Riassunti di Microbiologia, moduli 2 e 3

Università di Catania LUIGI FIORENTINO Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

MODULO 2

Modulo 2Æ 9) Macromolecole biologiche fondamentali: DNA, RNA, proteine. 10) Mutazioni:

Adattamento fisiologico; adattamento genetico; origine della variazione genetica; test di

fluttuazione, replica plating; tasso di mutazione; mutazioni puntiformi; origine e natura chimica

delle mutazioni spontanee, reversioni; mutagenesi indotta; tipi di mutanti; nomenclatura dei

mutanti. 11) Genetica dei microrganismi: Ricombinazione omologa e sito specifica. Sistemi di

trasferimento di materiale genetico nei batteri: trasformazione nei batteri Gram-positivi e negativi;

trasformazione ed espressione della competenza in S. pneumoniae; competenza indotta

artificialmente. Plasmidi: organizzazione e struttura; coniugazione; Formazione ceppi Hfr; Test di

complementazione; Trasduzione generalizzata e specializzata. Elementi genetici trasponibili;

trasposoni coniugativi; sequenze d’inserzione (IS); sistemi di replicazione: conservativa e replicativa;

mappe genetiche nei batteri; Principi di genomica. Principi di biotecnologie. 12) Regolazione del

metabolismo nei procarioti: Regolazione della sintesi delle proteine; utilizzazione del lattosio in E.

coli; Induzione; Geni di controllo; Teoria dell’operone; mutanti costitutivi (I-, Oc); repressore;

promotore. Regolazione dell’espressione genica: proteina allosterica, sistemi feed-back. Isoenzimi.

Variazione di fase in Salmonella. Sistemi di regolazione associati ai fattori sigma; controllo positivo e

negativo: operon lac ed arginina; operon maltosio; operone triptofano; polarità; crescita diauxica;

regolazione globale; attenuazione. 13) La spora batterica, esempio di differenziamento cellulare nei

procarioti. Struttura; analisi genetica e molecolare: regolazione del processo di sporulazione e

fattori sigma alternativi; germinazione.

Modulo 3Æ 15) I virus: caratteristiche generali e strategie replicative; classi replicative virali.

Caratteristiche principali e sistemi di replicazione di MS2, lambda, fiX-174; Sistemi di replicazione di

T7 e T4 e loro regolazione. 16) Immunologia: le infezioni microbiche e le difese aspecifiche; barriere

generali, fisiche, chimiche e biologiche; microflora indigena normale; flogosi e fagocitosi, principi di

immunologia. 17) Potere patogeno dei microrganismi: Rapporti ospite-parassita; trasmissibilità del

patogeno; adesione e colonizzazione; penetrazione, crescita e moltiplicazione del patogeno;

tossigenicità: esotossine ed endotossine.

Capitolo 10: La Genomica Microbica

La parola genomica si riferisce alla disciplina della mappatura, del sequenziamento, dell’analisi e

del confronto dei genomi. Molte migliaia genomi da procarioti sono stati sequenziati, inclusi quelli

provenienti da più ceppi di alcune importanti specie di batteri e Archaea. Dal momento che si

fanno progressi e di frequente alcune innovazioni vengono introdotte nel sequenziamento del

DNA, il numero di genomi sequenziati continuerà a crescere rapidamente. Il primo genoma ad

essere sequenziato fu il genoma a RNA (di lunghezza intorno ai 3569 nucleotidi) del virus MS2 nel

1976 mentre il primo genoma a DNA ad essere sequenziato fu l’ssDNA (single-stranded DNA) del

virus ʔyϭϳϰŶĞůϭϵϳϳ͘/ůƉƌŝŵŽ genoma batterico sequenziato fu quello del cromosoma (con una

lunghezza di 1.830.137 coppie di basi, bp) del batterio Haemophilus influenzae pubblicato nel 1995

e nel 1996 venne sequenziato il primo genoma eucariotico di “Saccharomyces cerevisiae” con

3.000.000 pb. Infine nel 2000 è stato sequenziato il genoma di Drosophila melanogaster con

130.000.000 pb e quello dell’Homo sapiens 3 MLD pb. Considerando tutto ciò, la genomica

abbraccia diversi tipi di indagine.

Una tipologia di genomica è quella strutturale: con ciò si intende lo studio della struttura del

genoma, l’identificazione di geni e dei loro rispettivi prodotti di espressione, di elementi regolatori

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ed altre entità informazionali. Quando si inizia a studiare il genoma di un microrganismo, la prima

cosa da fare è analizzarne la struttura, partendo letteralmente dalla sequenza delle basi. Si

comprende che il genoma non è interamente costituito da soli geni ma vi sono delle porzioni non

geniche fondamentali nella regolazione e anche ai fini degli studi di filogenesi.

Il passo successivo è invece lo studio della genomica funzionale, ovvero l’analisi delle funzioni dei

geni in oggetto, delle loro interazioni (pathways metabolici - analisi di tutti gli aspetti che

costituiscono la via metabolica) e dei meccanismi che ne regolano l’espressione.

Di norma il genoma di un batterio è di natura circolare; tuttavia, sebbene siano rari, i cromosomi

lineari sono presenti in diversi batteri, tra cui Borrelia burgdorferi, l’agente della malattia di Lyme,

e l’importante genere Streptomyces che produce antibiotici. I genomi batterici hanno dimensioni

comprese nell’intervallo da circa 0,5 a 13 paia di megabasi (Mbp) e presentano all’incirca da 500 a

10.000 geni codificanti per proteine. Sono stati sequenziati con successo i genomi di molti

organismi superiori, incluso il genoma umano aploide (considerando quindi soltanto la metà

dell’assetto genetico), che contiene circa 3 miliardi di bp, ma solo circa 25.000 geni codificanti per

proteine. I più grandi genomi finora sequenziati, in termini di numero totale di i geni, sono quelli

dell’albero di pioppo nero (una specie di pioppo) con circa 45.000 geni e del protozoo Trichomonas

con una stima di 60.000 geni codificanti per proteine; entrambi ne hanno molti più geni di quelli

umani; sono stati inoltre sequenziati i genomi di molti agenti patogeni, in alcuni casi ceppi multipli

di un patogeno che variano in termini di virulenza sono stati comparati nella speranza che vengano

rivelati quali siano i geni clinicamente rilevanti. Inoltre, gli ipertermofili (vedi pagine 132-135)

hanno applicazioni importanti in biotecnologia perché i loro enzimi sono termoresistenti. Almeno

all’inizio le necessità delle industrie biomediche e biotecnologiche hanno fortemente influenzato

la scelta degli organismi per il sequenziamento, tuttavia questa pratica è ora divenuta di routine

visto che i progetti sono meno governato da esigenze mediche o tecnologiche. In effetti, una

recente tendenza è quella di sequenziare e confrontare diversi ceppi dello stesso organismo per

ottenere una mappa dei geni in comune rispetto a quelli che sono specifici. Alla base della

genomica vi è quindi lo studio dei geni nonché considerate le unità funzionali dell’informazione

genetica: tutte le forme di vita, compresi i microrganismi, contengono i geni situati sui cromosomi

o altre grandi molecole note collettivamente come elementi genetici che nell’insieme

costituiscono il complemento totale di informazioni genetiche, o il genoma, in una cellula o in un

virus. L’informazione genetica nelle cellule è incorporata negli acidi nucleici, il DNA e l’RNA: l’acido

desossiribonucleico, il DNA, è custode dell’informazione genetica nella cellula mentre l’acido

ribonucleico, l’RNA, è una molecola intermediaria che converte il codice contenuto nel DNA in

proteine. Le informazioni genetiche risiedono nella sequenza dei monomeri negli acidi nucleici;

perciò, in contrasto con polisaccaridi e i lipidi che sono tipicamente composti da lunghe unità

ripetitive, gli acidi nucleici sono macromolecole informative. Dal momento che la sequenza degli

aminoacidi nelle proteine è determinata dalla sequenza degli acidi nucleici che li codificano, le

proteine sono anche esse macromolecole informative. I monomeri degli acidi nucleici sono

chiamati nucleotidi, di conseguenza, Il DNA e l’RNA sono polinucleotidi. 244

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Un nucleotide presenta tre componenti: uno

zucchero pentoso (o il ribosio nell’RNA o il

desossiribosio nel DNA), una base azotata e

43-

. Le strutture

un gruppo fosfato, PO

generali dei nucleotidi a DNA e a RNA sono

molto simili (Figura accanto). Le basi azotate

sono o purine (adenina e guanina), che

contengono due anelli eterociclici fusi, o le

pirimidine (timina, citosina e uracile), che

contengono un singolo anello eterociclico a

sei membri. La guanina, l’adenina e la

citosina sono presenti sia nel DNA che

nell’RNA. Con piccole eccezioni, la timina è

presente solo nel DNA e l’uracile solo

nell’RNA. Le basi azotate sono legate allo

zucchero pentoso da un legame N-glicosidico

tra l’atomo di carbonio 1 dello zucchero e

l’atomo di azoto 1 (nelle basi pirimidiniche)

o il 9 (nelle basi puriniche). Una base azotata

legata al suo zucchero, ma priva del gruppo

fosfato, prende il nome di nucleoside; i

nucleotidi sono nucleosidi con uno o più

fosfati (Figura b accanto).

I nucleotidi giocano altri ruoli oltre a quello strutturale negli acidi nucleici: abbiamo già analizzato

l’importanza, soprattutto a livello metabolico, di nucleotidi quali l’adenosina trifosfato (ATP) e la

guanosina trifosfato (GTP). Altri nucleotidi o loro derivati funzionano nelle reazioni redox, come

trasportatori degli zuccheri nella biosintesi di polisaccaridi, o come molecole regolatrici. Lo

scheletro degli acidi nucleici è un polimero di zuccheri alternati a gruppi fosfato: i nucleotidi sono

tra loro legati covalentemente mediante un legame fosfodiesterico tra il carbonio 3’- (3 primo)

di uno zucchero e il carbonio 5’ dello zucchero successivo. La sequenza di nucleotidi in una

molecola di DNA o RNA è la sua struttura primaria e la sequenza di basi costituisce l’informazione

genetica.

Nel genoma delle cellule, il DNA è a doppio filamento: ogni cromosoma consiste di due filamenti

di DNA, con ogni filamento contenente da centinaia di migliaia fino a diversi milioni di nucleotidi

collegati tra loro da legami fosfodiesterici. I due filamenti che compongono l’elica sono tenuti

insieme da legami idrogeno che si formano tra le coppie di basi complementari in un filamento e

nell’altro. 245

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Il legame idrogeno è un legame

debole ma è termodinamicamente più

stabile quando la guanina (G) si lega

con citosina (C) e legami di adenina

(A) con timina (T). L’accoppiamento

(fig. accanto) specifico della base, A

con T e G con C, assicura che i due

filamenti di DNA abbiano una

sequenza di basi complementare;

perciò ovunque si trovi una G su un

filamento, una C si troverà nell’altro

filamento, e ovunque sia presente una

T, il filamento complementare

conterrà una A.

Quando i geni sono espressi, le informazioni genetiche memorizzate nel DNA vengono trasferite

all’acido ribonucleico (RNA). Nonostante esistano diverse classi di RNA nelle cellule, soltanto tre

tipi principali di RNA prendono parte alla sintesi delle proteine: l’RNA messaggero (mRNA), una

molecola a filamento singolo che trasporta l’informazione genetica dal DNA al ribosoma,

l’apparato che sintetizza le proteine; l’RNA transfer (tRNA) che converte l’informazione genetica

presente nelle sequenze nucleotidiche dell’RNA messaggero in una sequenza definita di

aminoacidi che comporrà una proteina. Gli RNA ribosomiali (rRNA) sono componenti catalitici e

strutturali importanti del ribosoma.

I processi molecolari relativi al flusso dell’informazione genetica possono essere suddivisi in tre

fasi:

1. Replicazione: durante la replicazione, la doppia elica del DNA è duplicata in due copie. La

replicazione è eseguita da un enzima specifico, la DNA polimerasi.

2. Trascrizione: si intende il trasferimento di informazioni genetiche dal DNA all’RNA. La

trascrizione è effettuata da un enzima chiamato RNA polimerasi.

3. Traduzione: è intesa come la sintesi di una proteina, utilizzando l’informazione genetica

contenuta nell’mRNA.

Questi tre passaggi sono caratteristici di tutte le cellule e costituiscono il dogma centrale della

Æ Æ

biologia molecolare: DNA RNA Proteina. Molte diverse molecole di RNA possono essere

trascritte da una regione relativamente breve della lunga molecola di DNA: negli eucarioti, ciascun

gene viene trascritto per produrre un singolo mRNA, mentre nei procarioti, una singola molecola

di mRNA può portare le informazioni genetiche da diversi geni; cioè contenere diverse regioni

codificanti per proteine. Esiste una corrispondenza lineare tra la sequenza delle basi azotate di un

gene (e del suo trascritto) e la sequenza degli amminoacidi in un polipeptide: ogni tripletta di basi

(gruppo di 3 basi in sequenza) su un filamento di DNA o su una molecola di mRNA codifica per

un singolo amminoacido, e ciascuna di queste triplette è chiamata codone. I codoni sono tradotti

in sequenze di aminoacidi dai ribosomi (che sono costituiti da proteine e RNA), con la

partecipazione dei tRNA, e delle proteine di supporto, i fattori di traduzione. Mentre il dogma

centrale è vero in tutte le cellule, vedremo in seguito che alcuni virus (che non sono cellule)

violano questo dogma. 246

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In tutte le cellule il DNA esiste come una molecola a doppio filamento con due filamenti

polinucleotidici le cui sequenze di basi sono complementari. La complementarità del DNA deriva

dall’abbinamento specifico delle basi attraverso i legami a idrogeno: l’adenina si accoppia sempre

con la timina e la guanina si accoppia sempre con la citosina; ogni coppia di basi adenina-timina

forma due legami a idrogeno, mentre ogni coppia di basi citosina guanina ne forma ha tre (vedi

immagine precedente). La qual cosa, rende le coppie GC più forti delle coppie AT e di rimando, le

zone più ricche di coppie GC (o CG) risultano più stabili delle zone del DNA più ricche in AT (o TA).

I due filamenti della molecola di DNA a doppio

filamento sono disposti in un modo

antiparallelo (figura accanto): un filamento

decorre dal 5’ (ovvero presenta un terminale

fosfato all’estremità) al 3’ (ovvero presenta un

terminale idrossile all’estremità opposta),

mentre il filamento complementare decorre

esattamente all’opposto dal 3’ al 5’. Sebbene di

per sé i legami idrogeno siano molto deboli, il

gran numero di tali legami tra le coppie di basi di

una lunga molecola di DNA conferisce una

considerevole stabilità alla molecola stessa,

sufficiente a tenere insieme i due filamenti.

Tutte le strutture, all’interno della cellula

microbica, contenenti materiale genetico (il DNA

nella maggior parte degli organismi, ma l’RNA in

alcuni virus) sono chiamati elementi genetici.

Nel genoma procariote si distinguono il nocciolo

genico (o core) e una parte accessoria (o flessibile). Nella parte del core (identificata come parte

stabile, generalmente il cromosoma vero e proprio) devono essere presenti tutti i geni

fondamentali (i cosiddetti geni housekeeping, costitutivamente espressi in quanto indispensabili

per le funzioni vegetative della cellula) tra cui i geni ribosomiali, quelli del metabolismo e della

replicazione; dall’altra parte invece abbiamo una porzione di genoma che può subire delle

modificazioni senza che venga meno eventualmente la sopravvivenza della cellula. Per cui nella

componente accessoria possiamo trovare i plasmidi, gli integroni, i fagi, i trasposomi e/o tutti i

tratti di DNA che determinano resistenza agli antibiotici e che determinano la patogenicità di un

dato microrganismo.

Il principale elemento genetico nei procarioti è senza dubbio il cromosoma: nel 1958 Francis Jacob

e Elie L. Wollman proposero che la struttura del cromosoma di E. coli fosse circolare. Il nucleoide

dei procarioti è funzionalmente analogo al nucleo della cellula eucariotica.

I due filamenti del DNA sono avvolti l’uno attorno all’altro per formare una doppia elica:

all’interno dell’elica prendono forma due distinti solchi, il solco maggiore e il solco minore. La

maggior parte delle proteine che interagiscono in particolare con il DNA si legano nel solco

maggiore, ove vi è molto spazio. Visto che la doppia elica è una struttura regolare, alcuni atomi di

ciascuna base sono sempre esposti nel solco maggiore (e alcuni nel solco minore), le regioni dei

nucleotidi che risultano importanti nelle interazioni con le proteine sono mostrate nella figura a

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a a

pagina 249: nella coppia C – G l’NH in 4 posizione della citosina, l’ossigeno carbonilico in 4

2

a posizione della guanina sono esposti al solco maggiore. Nella coppia A – T

posizione e l’N in 6 a a a

posizione, l’ossigeno carbonilico in 4 posizione della timina, l’NH in 5 e l’N

invece il metile in 3 2

a posizione dell’adenina sono esposti al solco maggiore.

in 7

L’estensione di una molecola di DNA è espressa come il numero di nucleotidi o il numero di coppie

di basi per molecola; perciò, una molecola di DNA con 1000 basi è uguale a dire 1 kilobase (kb) di

DNA. Se il DNA è costituito da una doppia elica, vengono utilizzate le coppie kilobase (kbp) perciò,

una doppia elica di 5000 coppie di basi è estesa 5 kbp. Il batterio Escherichia coli ha circa 4640 kbp

di DNA nel suo cromosoma: quando si tratta di genomi di grandi dimensioni, si utilizza la l’unità di

misura del megabase (Mbp) che equivale a un milione di coppie di basi; il genoma di E. coli

secondo questa regola è esteso 4.64 Mbp. Ogni coppia di basi è distanziata dalle adiacenti

(precedente e successiva) di 0,34 nanometri (nm) lungo la doppia elica e ogni giro dell’elica

contiene circa 10 paia di basi. Considerando ci&ograv