Riassunti di Biologia Molecolare MODULO 2 - Da Ricombinazione Sito-Specifica a Sintesi Proteica

Università di Catania LUIGI FIORENTINO Facoltà di Scienze Biologiche, L-13

MODULO 2

MODULO 2: Adattamenti della ricombinazione a situazioni specializzate: la ricombinazione sito-

specifica. I trasposoni a DNA - I retrotrasposoni. Esempi di regolazione della trasposizione.

La trascrizione – le RNA polimerasi – la trascrizione nei batteri e negli eucarioti. Maturazione

dell’RNA – lo splicing ed il suo macchinario – lo splicing alternativo – l’editing dell’RNA.

La sintesi proteica nei procarioti e negli eucarioti– classi di RNA coinvolte nella traduzione – il

ribosoma - fasi della traduzione.

Capitolo 10: La ricombinazione sito-specifica e la trasposizione

Fin ora abbiamo trattato la ricombinazione omologa e alcuni suoi risvolti, esistono tuttavia altri

processi che garantiscono tanto nei procarioti quanto negli eucarioti la ricombinazione genica: la

ricombinazione conservativa sito-specifica (conservative site-specific recombination, CSSR) e la

ricombinazione per trasposizione (in genere detta trasposizione) che nel loro insieme sono

responsabili di molti riarrangiamenti del DNA (che dimostrano la plasticità del genoma). La prima

avviene tra due definiti elementi di DNA, mentre la trasposizione è un evento di ricombinazione

tra sequenze specifiche e siti del DNA non specifici (ossia le sequenze trasponibili sono specifiche,

ma possono trasporre in qualsiasi regione del DNA del cromosoma batterico, senza specificità) e

rappresenta la principale fonte di mutazione spontanea.

I due tipi di ricombinazione genetica, determinano effetti importanti che confermano la plasticità

del genoma ed hanno in comune alcune fondamentali caratteristiche molecolari, in particolare la

presenza di proteine, le ricombinasi, che riconoscono le specifiche sequenze di DNA dove deve

avvenire la ricombinazione. Le ricombinasi avvicinano ed uniscono questi specifici siti in un

complesso nucleoproteico, detto complesso sinaptico all’interno del quale, queste catalizzano il

taglio e la riunione delle molecole dell’acido nucleico provocando o un’inversione del tratto di

DNA o il suo movimento verso un nuovo sito.

La ricombinazione conservativa sito-specifica (CSSR), è normalmente il meccanismo utilizzato dal

fago nell’evento dell’infezione della cellula del procariote ospite: il segmento di DNA che viene

spostato porta sul sito dello scambio genico degli specifici elementi, costituiti da corte sequenze

(15/20 paia di basi), detti siti di ricombinazione. Un tipico, non a caso, esempio di questo tipo di

ricombinazione è dato dall’ŝŶƚĞŐƌĂnjŝŽŶĞĚĞůŐĞŶŽŵĂĚĞůĨĂŐŽʄŶĞůĐƌŽŵŽƐŽŵĂďĂƚƚĞƌŝĐŽ, durante

la quale la ricombinazione riguarda sempre esattamente la stessa sequenza nucleotidica

all’interno di due siti di ricombinazione, uno sul DNA fagico e l’altro su quello batterico. I siti di 163

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ricombinazione portano due tipi di elementi di sequenza: quelli specificamente legati dalla

ricombinasi e le sequenze dove avviene il taglio del DNA e la riunione.

Comunque, la CSSR può dare origine a tre diversi tipi di riarrangiamento del DNA: (1) l’inserzione

di un segmento di DNA in un sito specifico a struttura simile nel DNA di un altro organismo (come

avviene durante l’ŝŶƚĞŐƌĂnjŝŽŶĞĚĞůĨĂŐŽʄ = formazione del profago); (2) la delezione di un tratto di

DNA (es: reversione del profago); (3) l’inversione di un pezzo di doppia elica; il risultato finale

dipende dall’organizzazione dei siti di riconoscimento per la ricombinazione e dalla direzionalità di

certe sequenze sulla molecola o le molecole di DNA che partecipano all’evento. Ciascun sito di

ricombinazione è costituito da un paio di sequenze di riconoscimento della ricombinasi

palindromiche (indicate in rosso e blu scuro nella figura), organizzate in modo simmetrico: tali

sequenze fiancheggiano una corta sequenza centrale asimmetrica, nota come regione dello

scambio non palindromica (in nero), dove avviene il taglio e la riunione del DNA (è quella che nei

fatti viene scambiata al termine dell’evento e quindi subisce ricombinazione). Per effetto della

direzionalità delle sequenze della regione di scambio a monte e a valle, un sito di ricombinazione

ha sempre una polarità, l’orientamento dei due siti presenti su una sola molecola di DNA può

essere o del tipo ripetizione invertita o ripetizione diretta: la ricombinazione tra un paio di siti

invertiti inverte il pezzo di DNA tra di essi compreso; al contrario, la ricombinazione che avviene

con il medesimo meccanismo tra due siti organizzati in modo diretto (non invertiti) provoca la

delezione del tratto di DNA incluso mentre, si ha un’inserzione quando due siti di ricombinazione

presenti su due molecole diverse sono uniti per lo scambio. 164

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Nelle cellule esistono due famiglie di ricombinasi

per le reazioni conservative sito-specifiche: le

ricombinasi in serina e le ricombinasi in tirosina;

per entrambe le famiglie, il meccanismo

fondamentale consiste nella formazione, durante il

taglio del DNA, di un intermedio covalente

proteina-DNA. Per la ricombinasi in serina è la

catena laterale di un residuo di serina situata nel

sito attivo della proteina a portare l’attacco

(nucleofilo) ad uno specifico legame

fosfodiesterico presente sul sito di ricombinazione,

mentre per la ricombinasi in tirosina è la catena

laterale di una tirosina, presente nel sito attivo, che

attacca e poi unisce covalentemente il DNA; in

entrambi i casi, successivamente al legame sulle

sequenze di riconoscimento le ricombinasi tagliano

a livello della sequenza fiancheggiante (la regione di

scambio non palindromica e asimmetrica),

determinando la formazione di un intermedio

covalente proteina-DNA (fig. sotto) che conserva

l'energia del legame fosfodiesterico, e viene

successivamente idrolizzato, (invertendo il processo

di taglio) per far sì che i filamenti di DNA possono

essere riuniti. In questa reazione inversa, un gruppo

3’ OH del DNA interrotto attacca il legame covalente

che unisce la proteina al DNA, processo che richiude

covalentemente la rottura della doppia elica e libera

una molecola di ricombinasi.

La CSSR avviene sempre tra due siti di ricombinazione: come abbiamo visto precedentemente,

questi siti possono essere sulla stessa molecola di DNA (per l’inversione e la delezione), o su due

molecole diverse (per l’integrazione); ogni sito di ricombinazione è costituito da una doppia elica

di DNA, per questo per dare origine al DNA riarrangiato, si deve avere la rottura di quattro singoli

filamenti di DNA (due per ogni duplex) e, quindi, la riunione con un diverso filamento partner. Una

molecola di ricombinasi attua tutte queste reazioni di taglio formando un tetramero (un dimero

per ogni duplex). La differenza tra le due famiglie di ricombinasi sta nel fatto che mentre quelle

in serina tagliano ed uniscono tutti e quattro i filamenti di DNA in un singolo ciclo di taglio, 165

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quelle in tirosina, dapprima tagliano ed uniscono due filamenti di DNA e, solo dopo, tagliano ed

uniscono gli altri due filamenti e completano così la reazione in due cicli di taglio successivi.

Le ricombinasi a Serina, aderiscono alle sequenze

di riconoscimento palindromiche a livello dei loro

siti su ciascun duplex. Il residuo di serina di

ciascuna subunità su ogni duplex porta un attacco

nucleofilo al fosforo del fosfato in 5’ applicando

un nick sfalsato su ciascun filamento del duplex di

circa 2 nucleotidi. La formazione dell’intermedio

covalente proteina(serina)-5’P-DNA permette lo

scambio, guidato dalle subunità della proteina

(R3 si scambia con R1) nella maniera già

analizzata precedentemente (invasione e

successiva formazione dell’intermedio di

Holliday), la risoluzione finale è mediata

dall’attacco nucleofilo del gruppo 3’OH libero del

nuovo filamento a carico dell’intermedio

covalente DNA-proteina: questo attacco di fatto

permette la reversione del taglio e la riunione dei

filamenti con il rilascio da ciascun duplex delle

ricombinasi. A questo punto si è avuta

ricombinazione a livello della regione centrale,

non palindromica del sito, ossia la cosiddetta

regione di scambio a sequenza direzionata.

Esempi di ricombinasi in Serina possono essere la

'

trasposasi del fago Tn3 e la resolvasi La

caratteristica più cruciale della struttura

cristallografica di una ricombinasi a serina è

l'interfaccia ampia e piatta tra i due dimeri della

ricombinasi: quello "superiore" e quello

"inferiore" (Fig. a).

Questa struttura è in gran parte idrofobica e fornisce una piccola barriera alla rotazione delle metà

superiore e inferiore del complesso l’una attorno all’altra. Tuttavia, alcune regioni a carica 166

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complementare (positivo-negativo o viceversa) possono servire a stabilizzarne la struttura in modo

specifico nella orientazione iniziale e in quella ruotata di 180°, pertanto, l’analisi di questo

complesso supporta fortemente il modello secondo cui il meccanismo di ricombinazione sia

costituito prima dal taglio del DNA con formazione dell’intermedio covalente enzima-DNA, poi una

rotazione di 180 ° dei dimeri nel complesso proteina-DNA; e infine l’attacco da parte dei terminali

3’-OH a carico degli intermedi risolvasi-DNA per l’unione dei filamenti (joining) nella

configurazione ricombinata. Esperimenti più precisi hanno successivamente consentito di risolvere

una volta per tutte il meccanismo che attraverso successive rotazioni a carico dell’enzima porta

alla ricombinazione sito-specifica di due tratti di DNA a livello dei siti di ricombinazione (vedi figura

prima). Per quanto riguarda la famiglia delle

ricombinasi in Tirosina, anche in questo caso

le subunità della ricombinasi (un tetramero) si

legano ciascuno ad un duplex a livello delle

rispettive sequenze di riconoscimento sul sito

di ricombinazione. L’ossidrile in catena laterale

della tirosina a livello del sito catalitico

apporta un attacco nucleofilo al fosforo in 3’ di

un nucleotide a livello del sito di scambio, il

taglio ancora una volta è sfalsato di almeno 2

nucleotidi su ciascun filamento del duplex. A

questo punto l’intermedio covalente è

praticamente identico a quello che si forma

con le ricombinasi in serina, se non fosse che

proprio per via della diversa localizzazione del

taglio, la proteina è legata al DNA attraverso il

fosforo al 3’ quindi, l’intermedio sarà:

proteina (tirosina) -3’P-DNA ed anche in

questo caso l’energia di legame conservata

nell’intermedio servirà a revertire il taglio

nella riunione dei filamenti. L’intermedio

guida lo scambio che nella fattispecie avviene

quando ciascuna estremità di taglio 5’-OH sui

filamenti tagliati apporta un attacco nucleofilo

all’intermedio sull’altra doppia elica

successivamente all’invasione del filamento e

la formazione della giunzione di Holliday. Solo

a questo punto anche gli altri due filamenti ancora intatti di ciascun duplex subiscono il taglio ad

opera delle subunità di ricombinasi legate ad essi (R2 e R4) per avviare un secondo ciclo di scambi,

le estremità 5’-OH del nick agiscono sugli intermedi covalenti reciproci DNA-proteina con lo stesso

meccanismo precedentemente visto, scambiandosi il partner e risolvendo così, allo stesso tempo,

la giunzione di Holliday precedentemente formatasi. Esempi di ricombinasi a Tirosina sono le

O

integrasi del fago e le ricombinasi Cre del fago P1 e le ricombinasi XerC e XerD di E. coli

importanti per il completamento della replicazione. 167

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Un ottimo esempio di

ricombinasi in Tirosina è

fornito dalla struttura della

ricombinasi Cre: un enzima

codificato dal fago P1, che

serve a linearizzare il

genoma virale durante

l'infezione. I siti di

ricombinazione del DNA, su

cui Cre agisce, sono detti

siti lox: le strutture Cre-lox

mostrano che la

ricombinazione richiede

quattro subunità di Cre,

quali

ciascuna delle è

legata ad un sito di legame

sulla molecola di DNA

substrato.

Generalmente la conformazione del DNA in queste fasi è una struttura planare

cruciforme con ogni “braccio” di questa giunzione legato da una subunità Cre.

Il tetramero Cre esiste in due diverse conformazioni, 1 e 2, con due subunità

ciascuna (un dimero ciascuna). Solo in una di queste conformazioni può

tagliare e riunire il DNA, quindi, solo una coppia di subunità per volta è in una

conformazione attiva (in verde), nel secondo ciclo di taglio la coppia di subunità

nella conformazione attiva viene switchiata nella forma inattiva mentre le altre

due subunità precedentemente inattive vengono attivate. Questo scambio è

critico per il controllo della progressione della ricombinazione e garantisce che

il meccanismo di scambio avvenga in modo sequenziale, ossia che “un

filamento alla volta” venga ricombinato. Nella prima fase del processo le due

subunità attive della tirosina ricombinasi Cre apportano, grazie alla presenza

dell’ossidrile in catena laterale della Tirosina sul sito catalitico, un attacco

nucleofilo al livello del DNA substrato: i due duplex sono molto vicini, uniti da

una sinapsi, a formare dei bracci. A questo punto si determina un nick con

conseguente formazione dei primi due intermedi covalenti Cre-3’P-DNA ed

un’estremità 5’ libera su ciascun duplex: è la situazione ideale per avviare lo

scambio ove ciascuno dei due filamenti liberi al 5’ a livello della sinapsi invade il

duplex del reciproco intermedio, con la formazione della giunzione di Holliday

e scioglimento dell’intermedio per reversione del taglio. Dopo il taglio del

primo filamento le due subunità della ricombinasi attive si disattivano mentre

quelle precedentemente inattive subiscono una variazione allosterica che ne

causa l’attivazione: si dà avvio ad un secondo ciclo di taglio con formazione di

intermedio covalente DNA-3’P-proteina e liberazione dell’estremità 5’-OH la

quale su ciascun filamento eterologo guidata dalle subunità di Cre invade il

duplex opposto e nella reversione del taglio con scioglimento dei reciproci

intermedi DNA-proteine si ha quindi anche la risoluzione conseguenziale della

giunzione di Holliday prima formata. Il risultato è un DNA ricombinato in

ciascun duplex, a questo punto le ricombinasi vengono rilasciate dai loro siti di

processo è terminato.

riconoscimento ed il 168

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Le cellule e i virus fanno uso della ricombinazione conservativa sito-specifica per una grande

varietà di funzioni biologiche, in alcuni casi inseriscono il proprio DNA nel cromosoma ospite. In

altri casi, la ricombinazione sito-specifica è usata per alterare l’espressione genica o per aiutare a

mantenere l’integrità strutturale di molecole di DNA circolare durante la replicazione del DNA, la

ricombinazione omologa e la divisione cellulare. La segregazione dei cromosomi circolari può

quindi richiedere un evento di ricombinazione sito-specifica: nel momento in cui inizia la

replicazione del DNA, via via si hanno due copie della stessa molecola, e sequenze omologhe tra i

duplex in formazione possono già ricombinare, tuttavia se questi intermedi non vengono risolti si

potrebbe determinare un blocco della replicazione. La risoluzione di tali intermedi segue il

meccanismo della ricombinazione sito-specifica perché avviene a livello di siti specifici mediata da

particolari proteine che li riconoscono. In ogni caso, il confronto di diversi sistemi di

ricombinazione sito-specifica mostra alcune caratteristiche generali: tutte le reazioni dipendono

strettamente dall’assemblaggio delle ricombinasi sul DNA e dall’avvicinamento dei due siti di

ricombinazione; per alcune reazioni questo assemblaggio è estremamente facile in quanto

richiede solamente la ricombinasi e le sue sequenze di riconoscimento sul DNA, mentre altre

reazioni richiedono proteine accessorie. Quest’ultime, dette proteine architettoniche, legano

specifiche sequenze di DNA, costringendo la curvatura della doppia elica, avvicinando di fatto

sequenze specifiche dapprima lontane e di conseguenza stimolando la ricombinazione (o

regolando l’espressione genica). Le stesse proteine possono anche controllare la direzione della

ricombinazione: se la proteina architettonica curva in un senso il DNA, i siti non palindromi e

asimmetrici ossia quelli corrispondenti alla regione di scambio in corrispondenza dei quali avviene

il taglio, assumeranno una certa direzione; al contrario, se la curvatura avviene in maniera opposta

allora anche questi siti assumeranno direzione opposta (verranno letti in maniera opposta) e in

questo modo si avrà un effetto completamente diverso nel processo di ricombinazione; in tal

modo ad esempio la cellula si assicura che avvenga l’integrazione di un segmento di DNA e non la

reazione inversa, ossia la sua escissione. O (OInt); quando il

Un esempio di ricombinasi in tirosina è quello dell’integrasi del fago

ďĂƚƚĞƌŝŽĨĂŐŽʄŝŶĨĞƚƚĂƵŶďĂƚƚĞƌŝŽ͕ƵŶĂƐĞƌŝĞĚŝĞǀĞŶƚŝƌĞŐŽůĂƚŝǀi porta o all’instaurarsi di uno stato

lisogenico quiescente o alla moltiplicazione fagica, in un processo detto crescita litica. Nel primo

stato si deve avere l’integrazione del DNA f