Riassunti di Biologia Molecolare MODULO 2 - Da Ricombinazione Sito-Specifica a Sintesi Proteica

Il fago Mu: un trasposone a DNA particolare

Il fago Mu ha una struttura particolare, come il fago è un batteriofago lisogenico, ma è anche un grosso trasposone a DNA. Questo fago durante l'infezione usa la trasposizione per inserire il proprio DNA nel genoma della cellula ospite e, in questo, è molto simile ai retrovirus (precedentemente discussi); inoltre usa molteplici cicli di trasposizione replicativa per amplificare il proprio DNA durante la crescita litica.

Durante il ciclo litico Mu compie all'incirca 100 cicli di trasposizione all'ora, una caratteristica che lo rende il trasposone più efficiente tra quelli noti. Inoltre anche quando è presente come lisogeno quiescente, il genoma di Mu si traspone piuttosto frequentemente, se comparato ai trasposoni compositi tradizionali quali Tn10. Il nome Mu è l'abbreviazione di "mutatore" e deriva dalla sua capacità di trasporsi in modo promiscuo: le cellule che hanno inserita una copia.

del DNA di Mu, infatti, accumulano frequentemente nuove mutazioni a causa dell'inserzione del DNA fagico nei geni cellulari. Il genoma di Mu è di circa 40 kb e contiene più di 35 geni, ma solo due codificano per delle proteine con una funzione nella trasposizione, e sono i geni A e B, che codificano per le proteine MuA e MuB:

MuA è una trasposasi ed è un membro della superfamiglia delle proteine DDE di cui abbiamo discusso (vedi pag. 190-191) mentre MuB è un'ATPasi che stimola l'attività di MuA e controlla la scelta del sito di DNA bersaglio.

I trasposoni e retrotrasposoni sono frequenti anche in organismi vegetali e spesso la variabilità di alcune componenti del fenotipo (colore dei fiori, dei petali, delle foglie etc.) è data proprio dai differenti "salti" (o, se vogliamo, differenti siti bersaglio in cui traspongono) che compiono i trasposoni nel genoma; un classico esempio è la differenza tra uva

“nera” e uva “bianca”, il retrotrasposone gipsy GRET1 si inserisce in una regione genica di un fattore di trascrizione coinvolto nella regolazione della produzione delle antocianine, inattivandolo e determinando il fenotipo “bianco”. Le pannocchie di mais sono un esempio palese, la colorazione più o meno scura del chicco nella pannocchia dipende proprio dal differente salto dei trasposoni nel genoma. Gli elementi trasponibili mettono in atto degli eventi di regolazione per il loro meccanismo di trasposizione; c’è una sorta di equilibrio tra l’efficacia della trasposizione e la ricerca di siti non dannosi per il DNA bersaglio ove potersi trasporre. In qualche modo i trasposoni regolano la loro trasposizione nel sito bersaglio: non si inseriscono mai all’interno di sequenze trasponibili né si inseriscono all’interno di sequenze trasponibili. 198 Università di Catania LUIGI FIORENTINO Facoltà di Scienze Biologiche,

L-13Capitolo 11: La Trascrizione La trascrizione è il meccanismo che consente di copiare in maniera fedele le sequenze del gene nel momento in cui esso viene attivato: nella fattispecie è il processo in cui l'informazione della sequenza nucleotidica viene trasferita dal DNA all'RNA. L'informazione viene copiata mediante un macchinario, al pari di quello dedicato alla duplicazione, specifico, e cioè l'RNA polimerasi che lavorano in maniera simile alle DNA polimerasi; tuttavia vi sono alcune differenze sostanziali con il meccanismo replicativo:

1. innanzitutto la trascrizione è un meccanismo meno accurato della replicazione, questo perché mentre la replicazione avviene una sola volta e determina il fenotipo cellulare in tutto e per tutto; la trascrizione, avvenendo numerosissime volte a carico dei geni, anche se un prodotto di un ciclo di trascrizione risulterà mutato in qualche modo (statisticamente l'errore è molto

basso: circa 1 nucleotide errato ogni 10 mila polimerizzati) tutti gli altri èmolto probabile che siano normali e svolgeranno appieno le loro funzioni, nondeterminando mutazioni nella cellula. Inoltre anche questo è un processo estremamenteregolato: la cellula decide in maniera del tutto autonoma, in relazione alle necessità e leesigenze del momento, quali geni esprimere e quali invece tenere silenziati; l'RNApolimerasi quindi verrà portata selettivamente solo su quei geni che devono essere attivati;inoltre la regolazione include anche il momento dell'espressione di determinati geni nelproprio ciclo e anche la quantità di prodotti trascritti.2. La sintesi dell'RNA messaggero ha inizio, al pari della replicazione, a livello di una bolla ditrascrizione ove è presente una regione parzialmente denaturata ideale per il legame con ilcomplesso di trascrizione tuttavia, differentemente dalla DNA polimerasi essa, l'RNApolimerasiNon ha bisogno di un primer per innescare la trascrizione, ma è in grado di sintetizzare un filamento a RNA ex novo. L'RNA polimerasi è comunque sottoposta alla stessa restrizione della DNA polimerasi, ossia quella di poter polimerizzare soltanto in 3' per cui il filamento a DNA utilizzato come stampo da questo enzima sarà direzione 5' → 3' e il messaggero sintetizzato avrà una direzionalità quello che procede in direzione 3' → 5' ove al posto dei nucleotidi Timina, saranno inseriti i ribonucleotidi Uracile. La polimerizzazione avviene con lo stesso meccanismo utilizzato dalla DNA polimerasi, i siti attivi di questi enzimi, e in generale di tutte le polimerasi, sono regolati quasi alla stessa maniera. 3. L'RNA prodotto non rimane accoppiato alle basi dello stampo di DNA bensì, l'enzima attacca la catena ribonucleotidica a solo pochi nucleotidi di distanza dal punto di aggiunta di

Ogni nuovo ribonucleotide. Questo distacco è importante affinché l'RNA sintetizzato possa essere tradotto nel suo prodotto proteico. Inoltre, poiché questo rilascio è così vicino al sito di polimerizzazione, più molecole di RNA polimerasi possono trascrivere lo stesso gene allo stesso tempo, una dietro l'altra. In questo modo, una cellula può sintetizzare un grande numero di trascritti dello stesso gene (o di altre sequenze di DNA) in breve tempo.

Via via che l'RNA procede nella sintesi, la bolla di trascrizione si sposta assieme al ciò chiaramente è complesso e quindi la polimerasi sintetizza sempre al suo interno; diverso da quanto visto per la replicazione del DNA dove, si ricorda, che le forcelle di replicazione, le zone denaturate a singola elica, procedevano in maniera opposta tra loro non necessariamente seguendo l'attività degli enzimi della replicazione, perché

<199>Università di Catania LUIGI FIORENTINO Facoltà di Scienze Biologiche, L-13determinate dall'attività di due elicasi ATPasiche che procedevano in senso opposto; ilrisultato finale era che la porzione di DNA denaturata (ssDNA) era nettamente superiore aquella sulla quale gli enzimi stavano frattanto lavorando.Come visto per la replicazione del DNA, anche nel caso della trascrizione vi sono differenzesostanziali tra procarioti ed eucarioti:

1. La prima differenza di base consiste nel fatto che, nei procarioti l'assenza dicompartimentazione cellulare e, di conseguenza, l'assenza di un involucro nucleare, rendepossibile l'avvenimento accoppiato trascrizione-traduzione; in sostanza mentre l'mRNAviene trascritto, i ribosomi gli si associano per iniziare la traduzione. Negli eucarioti lapossibilità di godere di un involucro nucleare separato dal citosol e dal resto della cellula,dà una possibilità in più di

regolazione a questi organismi che così possono intervenireregolando la trascrizione sia a monte del processo che a valle (regolazione post-trascrizionale). L’accoppiata trascrizione e traduzione nei batteri è sottolineata dallevelocità pressoché simili dei due eventi: infatti la trascrizione ha una velocità di 40nucleotidi/sec e la traduzione ha una velocità di 15 aminoacidi/sec (se consideriamo che unaminoacido è codificato da una tripletta di nucleotidi allora in un secondo vengono letti 45nucleotidi dal ribosoma); in ogni caso queste velocità sono di gran lunga inferiori a quelledella replicazione (1000 nt al secondo).

2. Gli eucarioti, al contrario dei batteri in cui troviamo una sola polimerasi, durante latrascrizione utilizzano tre diverse polimerasi, che trascrivono ciascuna una classe diversa digeni:

a) La RNA polimerasi I trascrive l’Rrna, è localizzata nel NUCLEOLO ed è responsabiledella sintesi

del 50-70% dell'RNA totale;

b) La RNA polimerasi II trascrive l'mRNA, è localizzata nel NUCLEOPLASMA e sintetizza il 20-40% dell'RNA totale;

c) La RNA polimerasi III trascrive il tRNA e altri piccoli RNA, è localizzata nel NUCLEOPLASMA e sintetizza il 10% circa dell'RNA totale.

3. Inoltre, mentre i batteri hanno bisogno di un solo fattore addizionale d'inizio (σ), nelle cellule eucariotiche sono richiesti numerosi fattori d'inizio addizionali, questi fattori sono chiamati fattori generali di trascrizione (GTF).

Le sequenze che devono essere trascritte dall'RNA polimerasi fanno parte della cosiddetta unità trascrizionale che inizia dal punto di attacco dell'enzima, il sito di inizio a +1 nella sequenza, e termina a livello delle sequenze di terminazione ove l'enzima viene rilasciato dallo stampo: questa porzione è quindi delimitata da un promotore a monte (ovvero di quella sequenza di DNA che si lega

inizialmente all'RNA polimerasi (in molti casi assieme ai fattori d'inizio ed è necessaria per lo specifico inizio della trascrizione, sequenze si trovano subito prima del sito di inizio della trascrizione) e dal terminatore a valle dell'unità di trascrizione. Tra procarioti ed eucarioti i promotori ed eucarioti hanno una struttura diversa, in generale però devono contenere delle sequenze necessarie al riconoscimento della polimerasi. Nonostante ci siano alcune differenze tra procarioti ed eucarioti, in entrambi la trascrizione può essere suddivisa in 3 fasi: inizio, allungamento e terminazione. A) Inizio: riconoscimento del promotore e apertura del DNA a formare la bolla di trascrizione; B) Allungamento: l'RNA polimerasi sintetizza l'RNA utilizzando come stampo uno dei due filamenti di DNA; C) Terminazione: viene riconosciuto il terminatore.cture dell'RNA polimerasi. L'RNA polimerasi è un enzima che svolge un ruolo fondamentale nella trascrizione del DNA in RNA. È composta da diverse subunità, ognuna delle quali svolge una specifica funzione nel processo di trascrizione. Durante la trascrizione, l'RNA polimerasi si lega al DNA a monte del gene da trascrivere e si muove lungo il filamento di DNA, sintetizzando un filamento complementare di RNA. Durante questo processo, l'RNA polimerasi si muove lungo il filamento di DNA in modo unidirezionale, leggendo il codice genetico e sintetizzando l'RNA complementare. Durante la sintesi dell'RNA, l'RNA polimerasi si arresta in determinati punti del DNA. Questi punti di arresto sono chiamati siti di terminazione. Quando l'RNA polimerasi raggiunge un sito di terminazione, si stacca dal filamento di DNA e rilascia l'RNA appena sintetizzato. Esistono diversi meccanismi che possono causare l'arresto dell'RNA polimerasi. Uno di questi meccanismi coinvolge la formazione di una struttura a forcina nel filamento di RNA appena sintetizzato. Questa struttura a forcina può formarsi quando il filamento di RNA contiene sequenze complementari che si appaiano tra loro. La formazione di questa struttura a forcina provoca l'arresto dell'RNA polimerasi e la terminazione della sintesi dell'RNA. Un altro meccanismo che può causare l'arresto dell'RNA polimerasi coinvolge la presenza di proteine specifiche che si legano al filamento di RNA appena sintetizzato. Queste proteine possono interagire con l'RNA polimerasi e causare il suo distacco dal filamento di DNA, interrompendo così la sintesi dell'RNA. In conclusione, l'RNA polimerasi si arresta durante la sintesi dell'RNA in determinati punti del DNA, chiamati siti di terminazione. Questo arresto può essere causato dalla formazione di una struttura a forcina nel filamento di RNA o dalla presenza di proteine specifiche che interagiscono con l'RNA polimerasi.