Riassunti di Biologia Molecolare, Modulo 1 - Struttura e Riparazione del DNA

Università di Catania - Luigi Fiorentino

Facoltà di scienze biologiche, L-13

Riassunti di biologia molecolare

Contenuti del corso

• Modulo 1: La struttura del DNA – conformazioni tautomeriche delle basi – concetti di denaturazione e ibridazione - le conformazioni della doppia elica – la topologia del DNA e le topoisomerasi. La struttura dell’RNA – la formazione delle strutture secondarie dell’RNA – classi di RNA – i genomi procariotici e ribozimi. L’organizzazione del DNA nella cellula - eucariotici: caratteristiche, contenuto genetico e contenuto organizzativo, caratteristiche in DNA ripetitivo – elementi strutturali dei cromosomi – il nucleosoma – gli istoni – assemblaggio dei nucleosomi – aspetti molecolari della duplicazione e della segregazione cromosomale. La replicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti – le DNA polimerasi batteriche ed eucariotiche – fase di inizio e di terminazione della replicazione. Mutazioni e riparazioni del DNA. La ricombinazione omologa ed il suo macchinario.
• Modulo 2: Adattamenti della ricombinazione a situazioni specializzate: la ricombinazione sito-specifica. I trasposoni a DNA - I retrotrasposoni. Esempi di regolazione della trasposizione. La trascrizione nei batteri. La trascrizione – le RNA polimerasi – e negli eucarioti. Maturazione dell’RNA – lo splicing ed il suo macchinario – lo splicing alternativo – l’editing dell’RNA nei procarioti e negli eucarioti – classi di RNA coinvolte nella traduzione – il ribosoma - fasi della traduzione.
• Modulo 3: Il codice genetico – mutazioni soppressore. Regolazione dell’espressione genica – regolazione dell’inizio della trascrizione nei procarioti: il modello dell’operone e il fago lambda - la regolazione traduzione-dipendente delle proteine. Meccanismi di regolazione trascrizionale negli eucarioti – fattori di trascrizione – i domini di legame al DNA - la trasduzione del segnale – regolazione della struttura della cromatina – silenziamento genico. Tecniche di biologia molecolare: l’elettroforesi di macromolecole biologiche – sonde d’ibridazione – il clonaggio genico – le librerie: genomiche e a DNA – la PCR – il sequenziamento.

Modulo 1: Capitolo 1: Introduzione alla biologia molecolare

Le macromolecole biologiche più importanti per la vita sono effettivamente gli acidi nucleici e le proteine. I primi per la quantità di informazioni contenute necessarie per le attività metaboliche della cellula, i secondi perché cooperano nei meccanismi che portano all’espressione di queste informazioni: tutto quello che la cellula è in grado di fare a livello fisiologico dipende dalla sua informazione a livello genomico ma anche dalla sua capacità di esprimerla in maniera corretta. Il compito di questo corso infatti sarà collegare le varie macromolecole con l’obiettivo di comprendere i meccanismi di base che regolano le varie funzioni della cellula.

La biologia molecolare è un ambito in continuo approfondimento; negli ultimi 10/15 anni si è compreso che non si può prescindere da questa disciplina nell’ambito generale di tutte le scienze: se non si conosce il meccanismo di base dei processi biologici, compito preposto a questa disciplina, non si possono studiare né comprendere le leggi e i meccanismi che regolano la vita in tutte le sue sfaccettature e non si può sperimentare laddove sia necessario.

In funzione di questo, ricordiamo che la biologia molecolare è una scienza che studia gli esseri viventi a livello dei meccanismi molecolari alla base della loro fisiologia, concentrandosi in particolare sulle interazioni tra le macromolecole, ovvero proteine e acidi nucleici (DNA e RNA). Per biologia molecolare si intendono spesso una serie di tecniche che consentono la rilevazione, l’analisi, la manipolazione, l’amplificazione (PCR) e la copia (clonaggio) degli acidi nucleici.

Il termine biologia molecolare risale al 1938, coniato da Warren Weaver, direttore della fondazione Rockefeller, che credeva in uno sviluppo della biologia a livello molecolare, grazie ad avanzamenti significativi di discipline quali la cristallografia a raggi X. Fino ad ora 215 scienziati, per la maggior parte statunitensi per via del costante investimento da parte di quegli stati nel campo della ricerca e del progresso scientifico, hanno ricevuto il premio Nobel per la medicina e la fisiologia; di questi soltanto 12 sono le donne, mentre purtroppo soltanto 5 sono i Nobel italiani, l’ultimo dei quali, nel 2007 a Mario Capecchi per la scoperta del principio per introdurre specifici geni nei topi tramite cellule staminali embrionali. Di questo ristretto gruppo di italiani, ancor più ristretto di quello delle donne, fa parte la Montalcini, insignita del premio per la celebre scoperta del fattore di crescita dei nervi.

Nel 2018 i vincitori di questo importante premio sono stati James Allison, immunologo americano che dal 2004 ha condotto le sue ricerche nel Memorial Sloan-Kettering Cancer Center di New York, e Tasuku Honjo di origini giapponesi, immunologo di formazione, insigniti per l’individuazione dei meccanismi che determinano la risposta immune contro le cellule tumorali. Il lavoro di Allison, già iniziato negli anni ‘90 ma inizialmente non accreditato dalla comunità scientifica, si basa sulle prove che esistono circuiti regolatori negativi controllati dal sistema immunitario: quando il sistema si attiva, con un’infezione o l’insorgenza di una patologia, porta all’espressione di particolari proteine sulla membrana del linfocita; queste ad un certo punto, quando l’azione immunitaria ha determinato l’eliminazione dell’antigene, si legano ad un recettore specifico espresso dalle molecole dell’antigene stesso riducendo l’attivazione dei linfociti. Questo meccanismo contestualmente all’azione immunitaria, è fondamentale in quanto evita che i linfociti siano sempre attivi e che vi sia quindi una infiammazione permanente.

È stata individuata questa proteina, chiamata CTLA-4, che ha un ruolo fondamentale nella disattivazione dei linfociti, l’ipotesi è: se si agisce impedendo a questa, posta sul foglietto esterno della membrana linfocitaria, di legarsi al suo recettore antigenico, allora il segnale di disattivazione dei linfociti non viene emesso e questi possono continuare ad agire. In effetti sperimentalmente utilizzando un anticorpo (ottenuto mediante purificazione e successivo lavaggio) che lega specificatamente tale proteina, si è riusciti a mantenere attivo il sistema immunitario. Utilizzando tale meccanismo, i linfociti possono quindi rimanere attivi quanto basta per uccidere le cellule tumorali.

Il lavoro di Tasuku Honjo invece, autonomamente e indipendentemente da Allison, dimostrò che in questo stesso meccanismo era coinvolta anche la proteina PD-1, la quale invia segnali negativi ai linfociti. Le cellule tumorali infatti esprimono ed espongono sulla membrana il recettore per la PD-1, in questo modo ad essa si lega la proteina esposta sul linfocita. Il linfocita perciò viene reclutato sulla cellula tumorale e quindi inattivato così la cellula tumorale può andare a riprodursi senza freni.

Nel 2017, tre statunitensi, Hall, Rosbash e Young sono stati premiati per le loro scoperte riguardo il ritmo circadiano: un ciclo continuo nel quale l’organismo, ciclicamente attraverso l’espressione di determinate molecole secondo dei picchi quantitativi regola i propri processi fisiologici, come il ritmo sonno-veglia. Negli anni ‘70 Young scoprì che questi meccanismi hanno una base genetica: una mutazione in un gene sconosciuto sono in grado di interrompere la regolarità di un ritmo circadiano in organismi modello. Successivamente Hall e Rosbash riuscirono individuare questo gene, e isolarne il prodotto proteico, la proteina Per. Scoprirono che, nell’arco delle 24 ore del ciclo, di giorno la proteina viene sintetizzata e si accumula nel citosol mentre nel momento in cui si verifica il passaggio tra giorno e notte dal citosol rientra nel nucleo e attiva geni specifici (fattore di attivazione).

A questo punto si chiesero come facesse la proteina a rientrare nel nucleo: sperimentalmente si è visto che questa proteina si lega ad un’altra proteina nel citoplasma, la proteina Tim formando un complesso che è in grado di entrare nel nucleo. Young successivamente identifica una seconda proteina DDT che regola l’accumulo e la sintesi della proteina Per, da cui si spiega l’oscillazione della concentrazione di questa durante il ciclo.

Nel 1910, attraverso esperimenti su procarioti, si scoprì che i geni si trovano sui cromosomi, e tali geni sono disposti in maniera lineare. Nel 1928, l’esperimento di Griffith dimostrò l’esistenza di un principio trasformante a cui era affidato il compito di portare l’informazione di cui egli non riesce a riconoscere la natura (lipide, o proteina, o zucchero, o acido nucleico). L’esperimento in questione consistette dapprima nell’iniezione di un topo con un ceppo S (patogeno) di Streptococcus pneumoniae, agente infettivo della polmonite che causò ovviamente la morte del topo; in parallelo però Griffith iniettò in un altro topo una soluzione contenente il ceppo R, non infettivo, per via della capsula differente dal ceppo S (smooth), e si accorse che in questo caso il topo non morì.

La curiosità di Griffith subentrò nel momento in cui prese una coltura cellulare del ceppo S e dopo averla sottoposta ad aumento di temperatura, iniettò la soluzione in un topo e questo non morì. Egli chiaramente non aveva strumenti per determinare le differenze a livello molecolare tra un ceppo e l’altro, ma si basava sulle evidenze sperimentali. L’ultimo esperimento infatti sul quale egli basò la sua teoria del principio trasformante, consistette nell’iniettare ad un topo sano, una soluzione di batteri patogeni uccisi S e batteri di tipo R vivi: il topo morì. Chiaramente deve essere accaduto qualcosa che ha portato alla trasformazione di cellule non patogene R in patogene.

Negli anni successivi, fino al 1944 si cercò di definire chimicamente la natura del principio trasformante di Griffith. Avery in quell’anno attraverso diversi esperimenti, estrasse, successivamente alla lisi indotta nella coltura del ceppo S di Streptococcus pneumoniae, le diverse componenti (proteine, DNA, RNA) e le separò mediante “centrifugazione”. Quindi iniettò singolarmente ciascuna componente in un ceppo di batteri R verificando quale tra queste fosse responsabile della trasformazione. Iniettò inizialmente la miscela contenente solo le proteine nella coltura di batteri R e registrò che non si trasformarono, secondariamente allora iniettò RNA e nuovamente questi non si trasformarono, tuttavia quando iniettò la miscela contenente il DNA del ceppo S nella coltura dei batteri R, notò che essi si trasformarono nel ceppo virulento come del resto dimostrava la morte del topo nel quale aveva iniettato quella particolare soluzione.

Per convincere ulteriormente la comunità scientifica agì al contrario, attraverso gli enzimi, inserendo dapprima proteasi nella soluzione, poi RNAsi ma continuando a registrare le morti dei topi iniettati con quelle soluzioni. Quando invece inserì DNAsi in soluzione e successivamente iniettò il tutto nei topi, osservò che questi non morivano. Nonostante ciò la comunità scientifica, alla luce di tali risultati, rimase ugualmente perplessa, forte della convinzione che la base dell’ereditarietà risiedesse nelle proteine. Perciò negli anni a venire si studiarono altre prove sperimentali per dimostrare che il DNA è il materiale genetico.

Nel 1952 allora Hershey e Chase compirono altre prove sperimentali sulla scia di Avery. Utilizzando dei fagi (in quanto erano certi che l’unica molecola iniettata nella cellula ospite fosse il DNA) marcati con radioisotopi di fosforo e azoto seguirono il destino delle due componenti principali, l’uno il DNA l’altro le proteine, durante il processo infettivo. In particolare marcarono con ³²P il DNA e con ³⁵S le proteine. Posero in una provetta i fagi marcati e per poter separare i capsidi vuoti dalle cellule infettate dal DNA fagico utilizzarono un frullatore (in quel periodo era stato appena inventato). Dopo la centrifugazione vera e propria, mentre i capsidi vuoti si ponevano nel surnatante in quanto più leggeri, le cellule infettate si ponevano sul fondo. Prelevarono una parte del contenuto del fondo di una provetta e una parte del surnatante. Analizzando le due parti, si accorse che nelle cellule era presente solo fosforo 32 mentre lo zolfo era completamente assente e lo si ritrovava solo nel surnatante.

A questo punto la comunità scientifica fu costretta ad accettare che il principio trasformante risiedesse nella molecola del DNA. Questa quindi era la molecola deputata all’informazione e alla trasmissione ereditaria di tale informazione. Rimaneva però il forte dubbio su come fosse possibile che una molecola “così piccola” (al tempo erano stati sequenziati solo pochissimi nucleotidi, al massimo un tetranucleotide) contenesse un così grande quantitativo di informazioni.

Nel corso degli anni, dagli anni ‘30 ai ‘70 le scoperte tecnologiche portarono alla conoscenza che il DNA è una molecola molto grande, circa 2 metri in forma estesa, ma nel momento in cui questa scoperta venne realizzata, il primo obiettivo fu quello di studiarne la consistenza, la sua natura chimica e la sua struttura. Allora a favore della individuazione di una struttura adeguata ad una molecola che rivestiva una funzione così importante, Chargaff elaborò una tecnica oggi chiamata cromatografia su carta per analizzare la composizione nucleotidica del DNA estratto da molti organismi diversi (egli si era chiesto se la struttura del DNA fosse uguale in tutti gli organismi).

Chargaff infatti sulla base delle evidenze sperimentali elaborò delle prove, oggi dette regole di Chargaff secondo cui:

• La percentuale di pirimidine e purine è uguale in tutte le cellule di un organismo (funghi esclusi);
• La percentuale di adenina è uguale alla percentuale di timina così come la percentuale di citosina è uguale alla percentuale di guanina in tutti i campioni;
• Il rapporto purine/pirimidine era sempre approssimativamente uguale a 1 (in alcuni organismi è 1,1 e in altri 0,9);
• La percentuale della somma tra adenine e timine è diversa della percentuale della somma tra guanine e citosine tra una specie ed un’altra.

Dalla quarta legge, possiamo dedurre che il tetranucleotide che si pensava fosse la vera struttura del DNA non poteva rappresentare la forma e la struttura in cui il materiale genetico si presentasse nella cellula. Ci si chiedeva ora se l’ordine in cui questi nucleotidi fosse importante nella trasmissione dell’informazione o se l’informazione rimanesse invariata anche qualora tale ordine fosse cambiato.

Nel 1949 i suoi dati dimostrarono che non solo i quattro diversi nucleotidi (di cui si conosceva a malapena la struttura in quegli anni) non erano presenti in ugual misura ma che i loro rapporti variavano da specie a specie. In parallelo si sviluppava grazie alla Franklin la tecnica della fotografia della diffrazione a raggi X con la quale si riuscirono ad ottenere delle fotografie abbastanza nitide che contribuirono al perfezionamento delle conoscenze sulla struttura del DNA.

Da queste immagini risaltava infatti come la molecola fosse elicoidale e non solo, ma visto che gli assi della X sono regolari e si incontrano al centro, la molecola ha un avvolgimento regolare. Inoltre viste le macchie posizionate similmente nei quattro angoli rispetto al centro, l’immagine rivelava che si trattasse di una doppia elica e che le basi fossero, considerate le macchie centrali, equamente distanziate (3,4 angstrom). Attraverso poi calcoli più precisi si ricavò che un giro completo di doppia elica fosse di 34 angstrom, perciò contenesse all’incirca 10 coppie di basi.

Tutte queste informazioni furono poi elaborate da Watson e Crick: i due biologi infatti si rivolsero così a Rosalind Franklin, che poté fornire loro numerose conoscenze chiave per portare a termine il lavoro. Servendosi dei lavori non ancora pubblicati della Franklin e di Wilkins, i due poterono dedurre la struttura a doppia elica, che pubblicarono sulla rivista Nature il 25 aprile 1953.

In tutto questo la Rosalind Franklin contribuì in modo particolare nell’individuazione della funzione dei gruppi fosfato degli acidi nucleici, la ricercatrice chiarì la loro posizione esterna, suggerendone la funzione di supporto. Watson e Crick ne conclusero dunque che l’informazione risiedesse nell’ordine delle quattro basi azotate. Dall’immagine fornita dalla Franklin si poteva desumere non soltanto che il DNA fosse una catena polinucleotidica ma che le basi fossero rivolte verso l’interno della catena, considerata la loro natura idrofobica; in aggiunta a questo, si osserva dall’immagine che la doppia elica ha un diametro regolare e costante di 20 angstrom al di là della posizione in cui venga sezionata e osservata. Alla luce di questi dati perciò l’unica struttura possibile, considerando anche i risultati di Chargaff, era quella in cui ad ogni base purinica si appa...