Riassunti di Biologia Molecolare, Modulo 1 - Struttura e Riparazione del DNA

DELLA POLIMERIZZAZIONE SIA NEGLI EUCARIOTI CHE NEI PROCARIOTI

1. DIREZIONE UNIVOCA 5'->3':

2. LE DNA POLIMERASI DEI PROCARIOTI ED EUCARIOTI HANNO UNA STRUTTRA MOLTOSIMILE E RICHIEDONO SEMPRE GLI INNESCHI:

3. L'unica differenza tra procarioti ed eucarioti a livello della struttura delle replicasi è la maggiore complessità di queste nei secondi, spesso infatti sono costituite da numerose subunità e richiedono fattori aggiuntivi funzionali alla loro attività, tuttavia la struttura del sito catalitico è identica e si è mantenuta quasi inalterata nel corso dell'evoluzione.

4. PRESENZA DI UN OLOENZIMA NEI PROCARIOTI: mentre infatti nei procarioti la DNA pol III è un oloenzima costituito da più subunità, tra cui il complesso gamma e 3 DNA polimerasi III del core due delle quali agiscono, secondo il modello dinamico, switchandosi nella sintesi del filamento ritardato, negli eucarioti le polimerasi del...

core sono soltanto 2, lasui due filamenti (la epsilon generalmente polimerizza solo il filamento continuo mentre ladelta può polimerizzare entrambi).

7. MAGGIORE LENTEZZA DELLA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI: 3 micron al min neglieucarioti contro i 30 micron al minuto nei procarioti; questo è dovuto al fatto che negliorganismi superiori si è affinato e perfezionato, come abbiamo visto, un sistema quasiperfetto di controllo e regolazione del meccanismo a vari livelli. Nei procarioti il processodella replicazione si completa in circa 30 minuti (0,67 h) mentre richiede ben 8 h neglieucarioti. D’altro canto nell’uomo occorrono 24 ore per il completamento di una divisionecellulare a fronte dei 33 minuti dei procarioti.

115Università di Catania LUIGI FIORENTINO Facoltà di Scienze Biologiche, L-138. PRESENZA DI PIU’ ORIGINI DELLA REPLICAZIONE NEGLI EUCARIOTI: negli procarioti ègeneralmente una sola e la sua sequenza si trova alle ore

12 del cromosoma circolare,3 4mentre si trovano in media 10 / 10 origini della replicazione nel genoma eucariotico.Æ 3’:9. ASSENZA NEGLI EUCARIOTI DI UNA POLIMERASI AD ATTIVITA’ ESONUCLEASICA 5’Ænei procarioti è presente, e tale polimerasi è la pol I, che coadiuva la rimozione dei primersal termine del processo replicativo. Quest’attività negli eucarioti è realizzata dall’azionedell’endonucleasi FEN: si tratta di una nucleasi che digerisce nucleotidi all’interno dellamolecola polinucleotidica. Esistono due modelli, il secondo più validato del primo, cheipotizzano l’attività di questa nucleasi: il modello ad orecchio e il modello, più accreditato,ad RNAsi H, che sappiamo essere una tipoligia di enzima che riconosce e rimuove molecoledi RNA appaiate a DNA. A sinistra ilmodello adorecchio, cosìdenominato pervia dellaparticolareconformazioneassunta dal trattodi DNA scostato

L'elegato dalla FEN, prevede che, tanto nel filamento continuo quanto in quello discontinuo (l'unica differenza sta nel numero di primers per bp), durante la replicazione l'elicasi e la polimerasi nella sintesi delle porzioni di DNA più o meno lunghe (frammenti di Okazaki nel caso del filamento lagging) giungano in prossimità del primer del frammento successivo (magari sintetizzato da un altro nucleo della replicasi) scostino leggermente il primer stesso in modo tale da creare una corta porzione a singolo filamento comprendente il primer del frammento di Okazaki che estrude dalla doppia elica e non risulti appaiata. A questo punto FEN si lega nei pressi di questa regione, specificamente nella regione intermedia a livello dell'aramificazione tra singolo filamento e doppio filamento, applica il taglio e elimina porzione del frammento assieme al primer, lasciando un piccolo gap dovuto all'assenza del legame fosfodiesterico tra i due nucleotidi adiacenti in quella zona, tale

legame viene successivamente formato grazie all'intervento della DNA ligasi.

A destra il modello ad RNAsi H è molto simile a quanto visto nei procarioti perché presuppone che per primo agisca questo enzima a rimuovere il primer fino all'ultimo ribonucleotide, non dimentichiamo che il primer degli eucarioti è costituito però sia da una parte a RNA (4/5 ribonucleotidi) che da una parte a DNA (c.a. 10 2'deossi-nucleotidi) e solo successivamente FEN1. Come visto per i procarioti, l'enzima è impossibilitato a rimuovere l'ultimo ribonucleotide del primer perché esso risulta legato ad un 2'deossiribonucleotide pertanto non può idrolizzarne il legame fosfodiesterico. A questo punto, l'azione della DNA pol replicasi in cooperazione con l'elicasi scosta quest'ultimo ribonucleotide (come nel meccanismo precedente)

topoisomerasi nella decatenazione delle due molecole di DNA circolare che si trovano ad essere concatenate a termine del ciclo replicativo. Aldilà di questo però non abbiamo ancora analizzato nello specifico in che modo le due forche replicative che procedono in senso opposto lungo il cromosoma circolare, terminino il loro processo, e si uniscano a livello di una zona diametralmente opposta del cromosoma rispetto A livello di questa regione si trovano delle all'origine. sequenze specifiche, cosidette TER, di 23 pb tutte abbastanza vicine tra loro e ripetute sia da un lato che dall'altro rispetto all'asse di simmetria passante per il centro della circonferenza descritta dal DNA. Le due forche che procedono in direzioni opposte incontrando queste sequenze si bloccano perché tali sequenze sono direzionate, ossia vengono lette in un senso o nell'altro in relazione alla direzione della forca che vi passa attraverso. Infatti, guardando l'immagine, è

Possibile comprendere come siti TER di destra, da Ter C a TER B funzionino come terminatori per la forcella che procede in senso antiorario, la quale d'altro canto supera i terminatori posti dal suo lato, da

I siti TER vengono riconosciuti da proteine specifiche, le TER B a TER G, perché le loro sequenze possono essere lette come tali soltanto dalla proteine TUS che le legano, avvolgendole e forca opposta, quella che procede in senso posizionandosi su di esse, a seconda della direzione di orario.

Lettura della sequenza, in maniera tale da funzionare come delle sbarre, delle palette (come quelle che si trovano all'ingresso dei supermarket) che permettono il passaggio della forca solo in un senso, mentre dall'altro la bloccano. Il motivo per cui vi siano così tante sequenze TER da 117 Università di Catania LUIGI FIORENTINO Facoltà di Scienze Biologiche, L-13 un lato e dall'altro rispetto alle ore 6 del cromosoma, è anche abbastanza

dell’evento agiscono risolvendo il problema della concatenazione delle due molecole di DNA circolare batterico.x NEGLI EUCARIOTI INVECE E’ RICHIESTO UN PARTICOLARE PROCESSAMENTO POST-REPLICATIVO: negli eucarioti infatti sappiamo il materiale genetico è lineare, non certocircolare e covalentemente chiuso come quello dei procarioti e proprio per via di questa caratteristica strutturale si rende necessaria una serie di aggiustamenti e rifiniture soprattutto a livello delle terminazioni dei cromosomi, i telomeri che richiedono l’intervento della telomerasi, enzima specifico che polimerizza a livello di queste zone. Il primo inconveniente di questa struttura (seppure successivamente viene bloccata alle estremità per consentirne la spiralizzazione nella formazione delle strutture cromosomiche) sta nel fatto che, soprattutto in riguardo al filamento lagging, si renda necessaria l’inserzione ad opera dell’Dprimasi, come abbiamo visto, di numerosi inneschia

RNA (e in parte a DNA) che forniscano alle replicasi i terminali 3’-OH a cui apporre nucleotidi. Questo nei fatti costituisce un problema in corrispondenza dei telomeri (regioni terminali del cromosoma) perché, anche nel caso più fortunato, in cui l’ultimo primer (3’) per la sintesi dell’ultimo frammento di Okazaki (in direzione 3’) venga inserito esattamente appaiato all’estremità del filamento stampo Crick (5’), tale innesco dovrà essere poi rimosso con i meccanismi analizzati più sopra, più probabilmente seguendo il modello dell’RNAsi H, la quale pur sempre necessità che il primer venga estruso (anche se di poco, qualche ribonucleotide) dalla forca replicativa e spiazzerebbe come abbiamo visto anche qualche deossiribonucleotide. Ma ciò determinerebbe che quella regione ove prima presente l’innesco non venga ri