Riassunti biologia molecolare

Capitolo 1: Le scoperte di Mendel

Gli esperimenti di Mendel riassumono i risultati di incroci tra piante di piselli che differivano per caratteristiche ben determinate come la forma dei semi, il loro colore, la lunghezza del gambo. Dopo essersi accertato che ciascun ceppo parentale trasmettesse effettivamente il carattere di interesse, Mendel eseguì una serie di incroci tra genitori (P) che differivano per singole caratteristiche quali la forma o il colore del seme. Tutta la progenie aveva l’aspetto di uno solo dei due genitori; il tratto che compare nella generazione f1 è detto dominante, mentre il tratto che non appare in f1 è detto recessivo.

Il significato di questi risultati divenne evidente quando Mendel incrociò individui della generazione f1 tra loro. Questi incroci fornirono un importante risultato: il carattere recessivo riappariva in circa il 25% nella progenie f2, mentre quello dominante nel 75% degli individui della stessa progenie. Per ciascuna delle 7 caratteristiche che Mendel studiò ne consegue che la prima legge, segregazione indipendente, spiega il rapporto 3:1 tra fenotipi dominante e recessivo nella progenie f2.

L’aspetto o la struttura fisica di un individuo sono indicati con il termine fenotipo, mentre la sua composizione genica costituisce il genotipo. Individui con lo stesso fenotipo possono avere genotipi diversi: il termine omozigote si riferisce a un gene in cui il contributo dell’allele materno e paterno è identico, al contrario quei geni in cui il contributo dell’allele materno e paterno è diverso sono detti eterozigoti.

Mendel estese i suoi incroci a piante di piselli che differivano per più di una caratteristica. Iniziò con due ceppi puri, un ceppo aveva semi gialli e lisci, l’altro verdi e rugosi. Dato che i caratteri giallo e liscio erano dominanti sui caratteri verde e rugoso, tutta la generazione f1 aveva semi gialli e lisci. Gli individui della generazione f1 vennero poi incrociati tra loro per produrre un certo numero di individui della generazione f2, il risultato è che i fenotipi della progenie f2 avevano un rapporto di 9 gialli lisci, 3 verdi lisci, 3 gialli rugosi e 1 verde rugoso.

Questo principio è chiamato seconda legge di Mendel o principio dell’assortimento indipendente. Il principio dell’assortimento indipendente di Mendel è basato sul fatto che geni localizzati su cromosomi diversi si separino in modo indipendente durante la meiosi. Spesso però due geni non segregano in modo indipendente perché localizzati sullo stesso cromosoma. Spesso si rompono i punti identici per poi riunirsi in modo incrociato (crossing-over). Il crossing-over sostituisce gruppi di geni inizialmente localizzati su un cromosoma di origine paterna con gruppi di geni localizzati su cromosoma di origine materna.

Capitolo 2: Acidi nucleici trasmettono informazione genetica

L’esistenza di molecole speciali in grado di trasportare l’informazione genetica fu postulata dai genisti molto prima che questo problema fosse preso in considerazione dai chimici. Negli anni '30 i genisti iniziarono a pensare quale tipo di molecola potesse avere l’invariabilità strutturale necessaria per un gene e allo stesso tempo fosse in grado di mutare in maniera repentina e permanente. Era noto che i cromosomi avessero un costituente molecolare unico: acido deossiribonucleico (DNA).

Nonostante ciò, non c’era modo di pensare che esso contenesse l’informazione genetica, piuttosto si pensava che potesse servire come impalcatura molecolare per una classe di proteine ancora ignote. Era opinione generale che i geni fossero costituiti da amminoacidi perché a quel tempo erano le uniche biomolecole note da contenere l’informazione genetica. Dal momento che era stato dimostrato che tutti gli enzimi conosciuti erano di fatto proteine, il quesito fondamentale rimaneva il modo in cui i geni partecipassero alla sintesi delle proteine.

L’ipotesi più semplice era quella che l’informazione contenuta nei geni determinasse l’ordine dei 20 diversi amminoacidi all’interno delle catene polipeptidiche delle proteine. L’idea che il DNA potesse essere la molecola chiave emerse in maniera inaspettata. Griffith fece la sorprendente osservazione che alcuni ceppi di batteri, non infettivi, diventavano contagiosi se mischiati con dei corrispondenti, questo rappresentava modificazione ereditaria nei batteri. Pochi anni dopo l’osservazione di Griffith si scoprì che gli estratti di batteri uccisi erano in grado di indurre una trasformazione ereditaria e si iniziò a ricercare la natura chimica dell’agente trasformante.

Avery e i suoi collaboratori annunciarono che il principio genetico attivo era il DNA. A supporto di questa loro conclusione venne illustrato un esperimento al fine di dimostrare che l’attività trasformante nelle loro frazioni altamente modificate veniva distrutta da una deossiribonucleasi, un enzima che degradava specificamente le molecole di DNA. Crick e Watson individuarono la configurazione più favorevole e stereochimicamente compatibile con i dati dei lavori di Wilkins e Franklin.

Nella doppia elica le due catene di DNA sono unite da legami idrogeno (legame debole non covalente) tra coppie di basi su filamenti opposti. Questo appaiamento è altamente specifico, la base purinica adenina si appaia solo alla base pirimidinica timina mentre la base purinica guanina si appaia solo con la base pirimidinica citosina.

Nel DNA doppia elica il numero di residui adenina deve essere uguale al numero di residui di timina, come il numero di residui di guanina deve essere uguale al numero di residui di citosina. Ne consegue che le sequenze delle basi delle due catene di una data doppia elica sono in relazione complementare tra loro e che la sequenza di ogni filamento di DNA definisce esattamente quella del suo filamento complementare. I due filamenti avvolti tra loro in una struttura complementare suggerivano che un filamento servisse da una superficie specifica (stampo) sulla quale si poteva formare l’altro filamento.

Nel corso degli anni successivi Kornberg proseguì nel dimostrare che era necessario un enzima polimerizzante, specifico per catalizzare l’assemblaggio dei precursori che formavano il DNA. I suoi studi stabilirono che i costituenti nucleotidici del DNA erano precursori ricchi di energia (di ATP, di GTP, di CTP e di TTP), ulteriori studi identificarono un singolo polipeptide, la DNA polimerasi 1, come quello in grado di catalizzare la sintesi del nuovo filamento di DNA. Questo enzima lega in sequenza i precursori nucleotidici gli uni agli altri con un legame fosfodiesterico 3’-5’, inoltre il polipeptide funziona solo in presenza del DNA necessari a disporre i 4 nucleotidi nel prodotto polinucleotidico finale.

La DNA polimerasi 1 utilizza un filamento di DNA che agisce da stampo per determinare la sequenza del filamento che sta sintetizzando. Questo venne dimostrato in presenza di molecole di DNA che contenevano diverse quantità di coppie di basi A-T e G-C. In ciascun caso il prodotto sintetizzato enzimaticamente aveva lo stesso rapporto di base del DNA stampo. Sicché non vi erano altre componenti cellulari, non vi erano dubbi che DNA ricoprisse il ruolo di stampo di se stesso per la propria sintesi.

Meselson e Stahl condussero un esperimento in cui separarono le molecole neosintetizzate di DNA dimostrando che i due filamenti della doppia elica si separano definitivamente l’uno dall’altro durante la replicazione del DNA. Pertanto questi esperimenti dimostrarono che la replicazione del DNA è un processo semiconservativo in cui i singoli filamenti della doppia elica parentali rimangono intatti (sono conservati) e ognuno viene distribuito in una delle due molecole figlie durante il processo replicativo, escludendo altri due modelli proposti:

• La replicazione conservativa dove si ipotizzava che entrambi i filamenti parentali rimanessero insieme e che i filamenti neosintetizzati avrebbero formato una molecola di DNA interamente nuova.
• Il modello distributivo o dispersivo che stipulava che i filamenti di DNA venissero rotti ogni 10 coppie di basi e utilizzati successivamente per innescare la sintesi di regioni altrettanto corte di DNA che si sarebbero poi uniti per formare filamenti completi.

L’informazione genetica all’interno del DNA viene trasmessa dalla sequenza dei suoi 4 componenti nucleotidici A, G, C, T. Nonostante vi siano solo 4 lettere il numero di sequenze di DNA possibili (4 alla N dove N è il numero di lettere nella sequenza) è comunque straordinariamente grande. Oggi sappiamo che un tipico gene batterico è composto da circa mille coppie di basi.

Anche se il DNA doveva contenere l’informazione per disporre gli amminoacidi in sequenza, era chiaro che la doppia elica non poteva svolgere il ruolo di stampo durante la sintesi proteica. Alcuni esperimenti dimostrarono che la sintesi proteica avveniva anche in assenza di DNA.

In tutte le cellule eucariotiche la sintesi proteica avviene nel citoplasma, che risulta separato dal DNA cromosomico dalla membrana nucleare. Pertanto nelle cellule eucariotiche doveva esistere una seconda molecola contenente l’informazione che derivava la sua specificità genetica dal DNA che doveva poi spostarsi nel citoplasma per svolgere il ruolo di stampo per la sintesi proteica.

RNA: si trovava principalmente nel citoplasma avente un singolo filamento di DNA che quando non serviva come stampo per il filamento complementare di DNA poteva essere utilizzato come stampo per una catena complementare di DNA. Quindi la struttura dell’RNA dimostra che la sua sintesi può avvenire a partire da uno stampo di DNA. Dal punto di vista chimico è molto simile al DNA. L’RNA è una molecola lunga e non ramificata contenente 4 tipi di nucleotidi uniti da legati fosfodiesterici 3’-5’. Lo zucchero del DNA è il deossiribosio mentre quello dell’RNA è il ribosio, uguale al deossiribosio tranne per la presenza di un gruppo ossidrile (OH) sul carbonio 2’; l’RNA non contiene timina ma l’uracile.

La formazione di doppie eliche di RNA nella maggior parte dei casi è dovuta all’appaiamento di due porzioni complementari alla stessa molecola di RNA a singolo filamento. Venne formulata un’ipotesi che il DNA cromosomico funzionasse da stampo per le molecole di RNA che venivano successivamente trasportate nel citoplasma determinando l’ordine degli amminoacidi all’interno delle proteine.

Duplicazione

• DNA → Trascrizione → RNA → Traduzione → Proteina

La freccia tra DNA e RNA indica che la sintesi di RNA (trascrizione) è diretta da uno stampo di DNA, allo stesso modo la sintesi delle proteine (traduzione) è diretta da uno stampo di RNA.

Ipotesi dell’adattatore di Crick

L’ipotesi più semplice e credibile fu che gli stampi di RNA per le proteine potessero ripiegarsi e formare sulla loro superficie esterna delle cavità specifiche per i 20 amminoacidi diversi che dovevano avere una forma tale che solo un determinato amminoacido potesse occuparla. Crick sostenne che non poteva funzionare, in primo luogo perché i gruppi chimici superficie delle 4 basi dell’RNA (A U G C) avrebbero dovuto interagire con i gruppi chimici solubili in acqua, in secondo luogo perché anche se l’RNA avesse potuto ripiegarsi in qualche modo sembrava improbabile che lo stampo di RNA potesse esser utilizzato per discriminare amminoacidi con caratteristiche chimiche molto simili.

Perciò Crick propose che prima dell’incorporazione nelle proteine gli amminoacidi fossero attaccati a specifiche molecole adattatrici, le quali a loro volta avevano superfici particolari in grado di legare in maniera specifica le basi dell’RNA stampo.

RNA Transfer

Zamecnik scoprì che prima di esser incorporati nelle proteine gli amminoacidi vengono uniti alle molecole che oggi chiamiamo RNA transfer che rappresentano circa il 10% dell’RNA cellulare. Circa l’85% RNA cellulare si trova nei ribosomi e dato che il loro numero aumenta notevolmente nelle cellule, che hanno intensa attività proteica, si pensò che l’RNA ribosomiale fosse lo stampo per disporre in successione gli amminoacidi. RNA ribosomiale (rRNA) è la tipologia più abbondante di RNA presente nelle cellule. Non codifica direttamente le proteine, ma è il componente essenziale dei ribosomi, macchine catalitiche che provvedono all’assemblaggio delle proteine presente in tutte le cellule viventi. La funzione del RNA ribosomiale è fornire un meccanismo per la decodifica dell’mRNA in amminoacidi ed interagire con il tRNA durante la sintesi proteica, provvedendo all'attività della peptidiltransferasi, che avviene nella subunità maggiore. Per i geni dell’rRNA è stata dimostrata la dominanza nucleolare.

Sintesi enzimatica dell’RNA su uno stampo di DNA

Ai tempi della scoperta dell’RNA messaggero, i biochimici Hurwirz e Weiss isolarono in maniera indipendente il primo degli enzimi in grado di sintetizzare l’RNA a partire da uno stampo di DNA. Questi enzimi, chiamati RNA polimerasi, funzionano solo in funzione di DNA, che funge da stampo su cui si formano le catene a singolo filamento di RNA, utilizzando come precursori i nucleotidi ATP, GTP, CTP, UTP. Questi enzimi sintetizzano l’RNA utilizzando come stampi degli appropriati segmenti di DNA cromosomico. Solo uno dei due filamenti di DNA viene usato come stampo per produrre RNA durante la trascrizione. Questo è logico, dato che i messaggi portati dai due filamenti sono complementari ma non identici, e perciò codificano due polipeptidi diversi. La sintesi dell’RNA procede solo in una direzione, inizia cioè dall’estremità 5’ e finisce con il nucleotide all’estremità 3’.

La determinazione del codice genetico

Dato che ci sono 20 amminoacidi, ma solo 4 basi, i nucleotidi possono specificare un amminoacido solo se presi a gruppi. I gruppi dei due nucleotidi, però, ne possono specificare solo 16. Così a partire dal 1954 si cominciò a pensare a come potesse essere costituito il codice genetico e ci si focalizzò sul modo in cui le triplette (gruppi di 3 nucleotidi) potessero funzionare anche se di fatto esse permettevano più permutazioni di quelle richieste nel caso in cui ciascun amminoacido fosse specificato da una singola tripletta.

La scoperta più importante venne da Nirenberg e Matthaei. Nel 1961, questi ricercatori osservarono che l’aggiunta di un polinucleotide sintetico poli U (UUUUUUUU…) a un estratto crudo in grado di sintetizzare proteine generava una catena polipeptidica contenente esclusivamente l’amminoacido fenilalanina. Il gruppo nucleotidico UUU doveva, perciò, specificare la fenilalanina. L’utilizzo di polinucleotidi definiti, sempre più complessi, come l’RNA messaggeri, portò rapidamente all’identificazione di un maggior numero di codoni.

Particolarmente importante per il completamento del codice fu l’utilizzo di polinucleotidi tipo AGUAGU, da parte del chimico Khorana. Tali polinucleotidi definiti furono estremamente utili per determinare la sequenza di alcuni codoni. Nel 1966 il completamento del codice mostrò che 61 su 64 possibili gruppi di permutazione corrispondevano a amminoacidi, e che la maggior parte di essi era codificata da più di una tripletta di nucleotidi.

La conoscenza del codice genetico ci permette di prevedere quali sequenze di DNA codificano una proteina. Lo sviluppo dei metodi di sequenziamento rapido del DNA ha aperto la nuova era della genomica, in cui vengono determinate le sequenze genomiche complete di un numero sempre crescente di organismi compresi l’uomo. Il confronto delle sequenze genomiche costituisce un potente strumento per l’identificazione di regioni cruciali: non solo quella codificanti importanti elementi proteici, ma anche zone regolatrici che controllano l’espressione genica e la duplicazione del genoma.

Capitolo 4: La struttura del DNA

La caratteristica più importante del DNA è quella di essere normalmente formato da due catene polipeptidiche, avvolte l’una sull’altra nella forma a doppia elica. Se ruotata di 180° la doppia elica appare a prima vista identica: ciò è dovuto alla natura complementare dei due filamenti di DNA. L’impalcatura di ciascun filamento dell’elica è composta di zuccheri alternati a residui fosforici; le basi si proiettano all’interno ma possono esser accessibili attraverso solchi maggiore e minore.

Un nucleotide consiste di un fosfato legato a uno zucchero il 2’ deossiribosio a cui è attaccata una base. Lo zucchero è detto 2’ deossiribosio perché è privo di un gruppo ossidrilico in posizione 2’, dove invece sono presenti soltanto due atomi di idrogeno. Una base si unisce al 2’ deossiribosio rimuovendo una molecola di acqua tra un ossidrile del carbonio dello zucchero in posizione 1’ e la base stessa per formare un legame glicosidico. Lo zucchero unito a una sola base forma il nucleoside. In modo simile, il legame di un fosfato al 2’ deossiribosio, ottenuto eliminando una molecola di acqua tra il fosfato e l’ossidrile sul carbonio 5’, da un fosfomonoestere. Aggiungendo un fosfato o più di uno a un nucleoside, si ottiene il nucleotide, questa molecola è prodotta