Riassunti biologia molecolare

UTILIZZATI TILING ARREY CHE COPRONO L'INTERO GENOMA

Una volta assemblata l'intera sequenza genomica di un organismo può essere usata per identificare in modo globale le sequenze codificanti proteine e quelle non codificanti (come gli introni e i geni per i miRNA). La porzione del genoma che fa da stampo per la sintesi dell'RNA è detta TRSCRITTOMA. Per identificare questa parte del genoma, vengono utilizzate molecole di DNA a singolo filamento sintetiche lunghe 50 nucleotidi, per creare un TILING ARREY. La tecnica del filino arrey genomico progredisce molto rapidamente (filino arrey su scala genomica rivelano dettagli sulla struttura di introni ed esoni di un gene). Per analizzare il trascritto, gli arrey vengono irrigati a sonde di RNA marcate con fluorocromi. Queste sonde possono derivare da uno specifico tipo di cellula. Alla fine si ottiene una serie di segnali di ibridazione che si associando alle ipotetiche sequenze codificanti proteine presenti nel genoma. Gli arrey che

coprono l'interogenoma forniscono informazioni immediate sulla struttura di introni e esoni delle singole unità trascrizioni. Questo è dovuto alla natura altamente instabile dei trascritti intronici. Un'altra importante caratteristica degli array genomici è che sono capaci di rilevare geni non codificanti, come quelli per i miRNA,. in genere questi RNA derivano dal processamento di RNA precursori più grandi (poi-RNA) originati da unità di trascrizione della lunghezza di 1-10kp. Gli array hanno riportato un'importante osservazione: circa 1/3 del genoma viene trascritto anche se solamente una frazione di questo corrisponde a sequenze codificanti proteine.

LE SEQUENZE DI DNA CON FUNZIONE REGOLATRICE POSSONO ESSERE IDENTIFICATE GRAZIE A STRUMENTI DI ALLINEAMENTO SPECIALIZZATI

Una volta identificati i geni, diversi approcci bioinformatici portano all'individuazione delle possibili strutture proteiche e delle loro funzioni. In particolare esiste

Un logaritmo denominato BLAST, che ne rappresenta un potente strumento per ricerche comparare e allineare sequenze proteiche o acidi nucleici. Le analisi di BLAST permettono di confrontare velocemente una certa sequenza esonica con un database ricco di informazioni di sequenze codificanti proteine. Usando varianti delle ricerche di BLAST si può identificare un sottoinsieme di sequenze regolatrici di vertebrati. Gli ENHANDER CELLULA.SPECIFICI contengono blocchi di siti di legame per una o più proteine che legano il DNA in modo sequenza-specifico. A volte questo raggruppamento è sufficiente per l'identificazione con l'allineamento di ceresequenze di DNA. Gli enhancer tessuto-specifici possono anche essere individuati analizzando le sequenze gnomiche per la presenza di potenziali siti di legame per proteine regolatrici note. LA TECONICA DELL'ETIDING. L'editing del genoma, permette di rimuovere o modificare specifici segmenti di DNA, all'interno di un

genoma cheresta intatto in tutta la sua rimamene sequenza. Questo approccio richiede una rottura di un doppio filamento (DSB) in uno specifico DNA bersaglio, che stimola i sistemi di ricombinazione omologa a riparare l'interruzione introducendo il DNA modificato. Durante la riparazione della rottura vengono inseriti i cambiamenti programmati per modificare in modo specifico la sequenza del genoma. I tagli sul bersaglio vengono effettuati da NUCLEASI, in genere a dito di zinco o meganuclaesi, ingegnerizzate per tagliare il DNA a livello di siti precisi bersaglio sul genoma. LE PROTEINE. PROTEINE SPECIFICHE POSSONO ESSERE ISOLATE DA ESTRATTI CELLULARI. La purificazione di singole proteine è cruciale per comprendere la funzione, nonostante in alcuni casi sia impossibile. Ciascuna proteina ha proprietà uniche, che rendono la sua purificazione in qualche modo diversa. Questo è l'opposto di quanto avviene nel DNA, che hanno in comune la struttura a doppia elica e didistinguonosolamente in base alla sequenza. La purificazione di una proteina è ideata in modo da sfruttarne le caratteristiche uniche, che comprendono le dimensione, la carica, la forma e in molti casi, la funzione.

PURIFICAZIONE DI UNA PROTEINA RICHIEDE SAGGIO SPECIFICO.

La purificazione di una proteina richiede un saggio che sia specifico per la proteina stessa. Per la purificazione del DNA il saggio specifico è sempre lo stesso, l'ibridazione sulla sua elica complementare. Per la purificazione di una proteine, può essere usato, l'IMMUNOBLOTTING.

PREPARARE ESTRATTO DI PROTEINA.

Il materiale di partenza per quasi tutte le purificazioni di proteine è costituito dagli estratti cellulari. Contrariamente al DNA, anche lievi sbalzi termici sono in grado di denaturare le proteine. Per questo motivo la maggior parte delle preparazione di estratti e delle purificazioni di proteine avviene a 4°C. Gli estratti possono essere preparati in modi diversi: le cellule

positiva o negativa. Le proteine con carica opposta a quella delle sfere vengono trattenute, mentre le proteine con carica simile vengono eluite. 2) CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ: In questa tecnica, le proteine vengono separate in base alla loro affinità per specifici ligandi immobilizzati sulle sfere di resina. Le proteine che si legano al ligando vengono trattenute, mentre le altre vengono eluite. 3) CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE MOLECOLARE: Questa tecnica si basa sulla dimensione delle proteine. Le proteine più grandi vengono eluite prima, mentre le più piccole vengono trattenute. 4) CROMATOGRAFIA A FASE INVERSA: In questa tecnica, le proteine vengono separate in base alla loro idrofobicità. Le proteine idrofobiche vengono trattenute, mentre le altre vengono eluite. Una volta separate, le proteine possono essere analizzate e caratterizzate utilizzando tecniche come l'elettroforesi su gel, la spettrometria di massa e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare.

negativa o positiva. Le proteine interagiscono debolmente con la matrice della colonna sono rilasciate dalle sfere in un tampone a bassa forza ionica. Le proteine che interagiscono più fortemente necessitano di una maggiore quantità di sale per essere eluite. In entrambi i casi il sale maschera le regioni cariche, permettendo il rilascio delle proteine dalle sfere.

2) CROMATOGRAFIA PER FILTRAZIONE MOLECOLARE: questa tecnica separa le proteine in base alla loro dimensione e forma. Le sfere usate per questo tipo di tecnica non sono dotate di gruppi chimici carichi, ma possiedono pori e cavità di diversa dimensione che le attraversano. Le proteine piccole possono penetrare in tutti i pori e quindi impiegano più tempo a essere eluite; le proteine grandi non sono in grado di penetrare nei pori e verranno eluite più velocemente. Per ciascun tipo di colonna le frazioni cromatografiche vengono ottenute con una concentrazione salina costante e con diversi tempi di eluizione e sono

Saggiate per la proteina di interesse. Le frazioni contenenti la maggior quantità dell'attività di interesse vengono raggruppate e sottoposte a ulteriore purificazione. Una proteina viene ulteriormente purificata mediante passaggi attraverso diverse colonne. Nonostante sia difficile che una sola colonna possa purificare una proteina fino all'omogeneità, una serie di passaggi di cromatografia può avere come risultato la formazione di una frazione che contiene molte molecole della proteina specifica e poche molecole delle altre proteine.

3) CROMATOGRAFIA PER AFFINITÀ: questo metodo può facilitare una piazza rapida purificazione delle proteine. La conoscenza specifica di una proteina può spesso essere utilizzata per purificare il polipeptide più rapidamente, questa tipologia di purificazione è detta CROMATOGRAFIA PER AFFINITÀ. Altri reagenti possono essere attaccati alla colonna per consentire la rapida purificazione.

La purificazione delle proteine; questi includono sequenze di DNA specifiche o anche altre proteine specifiche che si pensa possano interagire con il polipeptide da purificare. Quindi prima di iniziare una purificazione è importante pensare a quali informazioni si possiedono sulla proteina bersaglio per cercare di sfruttarle al meglio.

Una forma molto comune della cromatografia per affinità è la cromatografia PER IMMUNOAFFINITÀ. In questo approccio, alla matrice viene attaccato un anticorpo specifico per la proteina di interesse. Idealmente l'anticorpo interagirà solamente con la proteina bersaglio e lascerà passare le altre proteine attraverso la colonna.

La proteina legata potrà in seguito essere eluita dalla colonna utilizzando sali, un gradiente di pH o, in alcuni casi, un debole detergente. La difficoltà di questa tecnica è che spesso l'anticorpo lega le proteine bersaglio in modo talmente forte che la proteina deve essere

completamentedenaturata prima di essere eluita. Per facilitare lapurificazione le proteine possono essere modificate. Talimodificazioni comportano l'aggiunta di brevi sequenzeamminoacidi che alle estremità ammino-terminale ocarboni-terminale della proteina d'interesse. Questeaggiunte o "etichette"(tags), possono essere generateutilizzando i metodi di clonaggio molecolare. I tagspepetidici aggiungono proprietà note alle proteinemodificare che servono per la loro purificazione lacromatografia per immunoaffinità può essere utilizzata perfar precipitare rapidamente una proteine specifica. Inquesto caso la precipitazione si ottiene attaccandol'anticorpo. Dato che le sfere sono relativamente grandi,esse precipitano velocemente sul fondo della provettainsieme all'anticorpo e a qualsiasi proteina legata a esso.Questo procedimento noto come,IMMUNOPRECIPITAZIONE, è nato per purificarerapidamente la proteina i i complessi

proteici da unestratti crudo. SEPARAZIONE DI PROTEINE SU GEL DI ACRILLAMIDE. Le proteine non sono dotate né di una carica né di una carica negativa uniforme, né di una struttura secondaria uniforme. Esse sono costituite da 20 amminoacidi, alcuni dei quali sono privi di carica, alcuni dotati di carica positiva e altri ancora di carica negativa. Le proteine hanno struttura secondaria e terziaria e sovente formano complessi multimerici. Se, d'altra parte, la proteine viene trattata con il forte detergente ionico solida dodecil solfato (SDS) e un agente riducente come il mercaptoetanolo, le strutture secondarie terziarie e quaternarie generalmente veng