Relazione di tirocinio su laboratorio analisi cliniche

DETERMINAZIONE DEI GRUPPI SANGUIGNI

ll sangue è un elemento liquido indispensabile alla vita

dell`organismo,composto dal

plasma e da eritrociti,leucociti

e piastrine ,si presenta come un

liquido di colore rosso, viscoso,

che circola nelle arterie e nelle

vene pompato dal cuore.

Grazie alla sua complessa

composizione e rapidità di

circolazione ,il sangue,irrorando

tutti i tessuti,svolge molteplici funzioni.

In particolare, attraverso la rete capillare che mette in comunicazione

la circolazione arteriosa con quella venosa, assicura il trasporto di

gas,sostanze nutritive e di elementi necessari alla difesa dell’organismo

da batteri , parassiti e virus. La circolazione sanguigna è garantita

dall’attività del muscolo cardiaco, che a ogni contrazione invia circa la

metà del volume ematico ai polmoni.

Il sangue è formato da una sospensione di cellule in un liquido chiamato

plasma ,un fluido leggermente alcalino (pH>7), con caratteristico colore

giallognolo, costituito prevalentemente da acqua (90 %) e da sostanza

secca (10 %).

Nel plasma sono contenute numerose sostanze organiche come glucidi,

lipidi, proteine, amminoacidi, vitamine, ormoni e sali minerali.

Gli elementi cellulari del sangue si dividono in globuli rossi, globuli bianchi

e piastrine. Gli eritrociti sono le cellule più numerose del sangue,sono

chiamati anche globuli rossi o emazie.

Essi sono privi di nucleo e proprio la mancanza del nucleo lascia più spazio

all'emoglobina, una proteina deputata al trasporto dell'ossigeno. Le

piastrine vengono prodotte dal midollo osseo e la loro principale funzione

è di fermare la perdita di sangue nelle ferite (emostasi).

A tale scopo, esse si aggregano tra loro promuovendo la coagulazione del

sangue.I leucociti o globuli bianchi sono cellule nucleate del sangue

incaricate della difesa dell'organismo,comprendono basofili, linfociti,

eosinofili, monociti e neutrofili.

Il sangue dei diversi individui può essere suddiviso in gruppi in base alla

presenza o meno sulla superficie dei globuli rossi di particolari complessi

molecolari con caratteristiche di antigeni,di cui i più noti sono il sistema

ABO e il sistema Rh.

Nel 1900 Landsteiner dimostrò che i globuli rossi umani contengono due

antigeni che indicò con A e B. Precisamente ciascun globulo rosso può

contenere: l'antigene A (gruppo A),

 l’antigene B (gruppo B),

 entrambi gli antigeni (gruppo AB),

 oppure nessun antigene (chiamato per questo gruppo Zero);



Il fattore Rh o fattore Rhesus, si riferisce alla presenza di un antigene,

in questo caso in una proteina, sulla superficie dei globuli rossi,È un

carattere ereditario e si trasmette come autosomico dominante. Se una

persona possiede questo fattore si dice che il suo gruppo è Rh positivo

(Rh+), se invece i suoi globuli rossi non lo presentano, il suo gruppo

sanguigno viene definito Rh negativo (Rh-).Il fattore Rh negativo è

recessivo e quindi presente solo in individui omozigoti per quel carattere,

quindi solo in individui figli di genitori entrambi Rh negativi o eterozigoti

per il fattore Rh.Per ricercare in laboratorio gli antigeni eritrocitari ABO

su campioni di sangue si utilizzano anticorpi specifici agglutinanti. Queste

tecniche consentono la produzione di anticorpi molto specifici di un’unica

classe anticorpale e pertanto sono detti anticorpi monoclonali .

La determinazione classica del sistema ABO si compie in laboratorio su

vetrini. Per ogni determinazione si utilizzano tre vetrini su ciascuno dei

quali si pone una goccia del sangue da testare e una di fisiologica, sul

primo vetrino poi si mette una goccia di siero test anti-A, sul secondo di

anti-B, sul terzo di anti-A,B .Su ciascun vetrino si mescolano i tre

elementi (sangue, fisiologica e antisiero) si bascula per qualche minuto a

temperatura ambiente e si legge per un’agglutinazione che, se presente, è

chiara e massiva. La determinazione degli antigeni del sistema Rh, nella

normale routine di laboratorio, viene ridotta alla ricerca del più

immunogeno degli antigeni, l’antigene D.Vengono definiti Rh positivi i

soggetti che presentano l’antigene D e negativi quelli che non lo

presentano. La determinazione del fenotipo Rh ha grande importanza

oltre che per le pratiche trasfusionali anche per individuare le donne Rh

negative coniugate con un D positivo. Queste donne, qualora il feto fosse

D positivo, vanno accuratamente monitorate perché, nel corso della

gravidanza, possono sensibilizzarsi verso il D e danneggiare il feto circa

gravemente. Nel corso del parto è frequente che le emazia del feto

passino nel circolo della madre. Ciò potrebbe sensibilizzare la donna e

costituire un grave pericolo per future gravidanze con prodotto del

concepimento D. SAGGI IMMUNOLOGICI

I Saggi immunologici sono basati sulla reazione antigene-anticorpo

utilizzati per l’identificazione batterica. Un anticorpo (più propriamente

immunoglobulina) è una proteina con una peculiare struttura quaternaria

che le conferisce una forma a "Y". Gli anticorpi hanno la funzione,

nell'ambito del sistema immunitario di neutralizzare corpi estranei come

virus e batteri, riconoscendo ogni determinante antigenico o epitopo

legato al corpo come un bersaglio

.Le immunoglobuline umane sono suddivise in 5 classi principali:IgG, IgA,

IgM, IgD, IgE.

Un antigene è una molecola riconosciuta come estranea o potenzialmente

pericolosa dal sistema immunitario di un organismo, che la combatte

attraverso la produzione di anticorpi. La maggior parte degli antigeni è in

grado di produrre una risposta immunitaria specifica, finalizzata alla loro

rimozione e coordinata dai linfociti T e B (le stesse cellule deputate al

loro riconoscimento).Gli antigeni possono essere classificanti in endogeni

o esogeni, a seconda che abbiano origine autoctone o estranee

all'organismo.

Questi ultimi penetrano nel corpo sottoforma di batteri, virus, sostanze

chimiche, pollini ecc. e sono fagocitati da apposite cellule (macrofagi,

monociti e granulociti neutrofili).Gli antigeni endogeni, confinati

all'interno delle cellule, vengono anch'essi processati ed esposti sulla

superficie cellulare e da qui sono riconosciuti dai linfociti T citotossici,

che liberano sostanze capaci di uccidere la cellula infetta per lisi.

I metodi immunologici per quantificare la concentrazione degli antigeni

garantiscono un’eccellente specificità e sensibilità per questo sono

diventate tecniche standard sia nella ricerca sia nelle applicazioni

cliniche.

Tutti i moderni metodi immuno-chimici sono basati su un semplice e

accurato metodo per misurare la quantità di molecole

indicatrici,distinguendosi cosi in:

Test radioimmunologico o RIA dove la molecola indicatrice e

 marcata con un radioisotopo che può essere misurato contando

l’emissione radioattiva in un contatore gamma.

Test immunoenzimatico o ELISA dove la molecola indicatrice e

 accoppiata covalentemente con un enzima,può essere quantizzato

determinando con uno spettrofotometro il tasso di conversione di un

substrato incolore in un prodotto colorato da parte dell’enzima.

Immunofluorescenza quando la molecola indicatrice e accoppiata

 covalentemente a un fluoro croma.

Questi saggi inoltre possono essere diretti e indiretti.Nei saggi diretti a

essere marcati sono gli antigeni o gli anticorpi specifici mentre negli

indiretti a essere marcati sono anticorpi secondari rivolti contro gli

anticorpi utilizzati nella reazione primaria con l’antigene.

ELISA è l'acronimo di Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, cioè

Dosaggio Immuno-Assorbente legato a un Enzima. Lo scopo di questo

saggio immuno-enzimatico è quello di rilevare la presenza o di un antigene,

generalmente appartenente ad un microrganismo patogeno, grazie all'uso

di uno specifico anticorpo (ELISA diretto) o di un anticorpo presente

nel plasma sanguigno specifico contro un antigene (ELISA indiretto),

come ad esempio nei test per l'HIV. La versatilità del saggio ELISA è

apprezzata sia nel campo della ricerca che nel campo sanitario. Esistono in

commercio numerosi KIT i cui campi di azione si articolano su diversi

bersagli antigenici. Il test ELISA si distingue in :

Metodo diretto,per determinare la presenza di un determinato antigene

in un campione biologico, prevede le seguenti fasi:

1. Fissaggio al substrato dell’anticorpo primario specifico per

l'antigene da ricercare.

2. Lavaggio per eliminare l’eccesso di anticorpo.

3. Aggiunta del campione da saggiare per la presenza o meno

dell'antigene che, se presente, si lega specificamente con

l'anticorpo.

4. Lavaggio per togliere antigeni in eccesso.

5. Aggiunta dell'anticorpo secondario specifico per l’antigene

coniugato a un enzima specifico (perossidasi o fosfatasi alcalina). Se

l’antigene è presente l’anticorpo si legherà selettivamente al

complesso anticorpo-antigene, formando un triplo strato da cui

prende il nome il test.

6. Lavaggio con soluzione tampone dell’eccesso di anticorpo o, nel caso

dell’assenza dell’antigene specifico, dell’anticorpo secondario.

Aggiunta del substrato specifico per l’enzima coniugato all’anticorpo

7. che porterà alla formazione di un prodotto colorato osservabile al

microscopio o ad occhio nudo. Lo sviluppo del colore è indicativo

della presenza dell'antigene che si voleva saggiare e l'intensità della

colorazione, misurabile grazie al spettrofotometro, è semi-

quantitativa. Se l’antigene è assente nel campione l’anticorpo

marcato non si legherà e sarà allontanato dal lavaggio per cui la

reazione non può avvenire.

Metodo indiretto, per determinare la presenza di un determinato

anticorpo, prevede invece le seguenti fasi:

1. Fissaggio al substrato dell’antigene specifico per l'anticorpo che

vogliamo misurare.

2. Lavaggio per eliminare l'eccesso di antigene.

3. Aggiunta del siero (campione) che si vuole saggiare per ricercare la

presenza di anticorpi specifici per l’antigene adsorbito al fondo del

pozzetto.

4. Lavaggio per eliminare l'eccesso di anticorpi che non hanno legato

l'antigene.

5. Aggiunta di un anti-anticorpo, cioè un anticorpo secondario marcato

con un enzima che legherà, se presenti gli anticorpi nel campione, il

complesso antigene(adsorbito)-anticorpo(del campione).

6. Lavaggio per eliminare eventuali anticorpi non legati al complesso.

7. Aggiunta del substrato dell'enzima con cui è stato marcato l'anti-

anticorpo: un cambiamento di colore indica la presenza degli

anticorpi nel sie