Reattori Biochimici per Applicazioni Analitiche e Terapeutiche (RBAAT) - Prof. D. Pirozzi

REATTORI BIOCHIMICI PER

APPLICAZIONI ANALITICHE E

TERAPEUTICHE

Prof. Domenico Pirozzi

A.A. 2017/2018

A CURA DI:

Federica Amitrano

Sommario Sommario

1. SPETTROFOTOMETRIA ....................................................................................................................................... 3

E ’A S I C ......................................................................................................... 11

NZIMI NELL NALISI DI OSTANZE DI NTERESSE LINICO

Analisi del Colesterolo ............................................................................................................................................. 13

Analisi del Glucosio .................................................................................................................................................. 15

Analisi del Fruttosio ................................................................................................................................................. 17

Analisi dell’Acido Urico ............................................................................................................................................ 18

Analisi dell’Ammoniaca ........................................................................................................................................... 19

Analisi dell’Urea ...................................................................................................................................................... 20

Analisi dell’Etanolo .................................................................................................................................................. 21

2. PROTEINE .........................................................................................................................................................23

T P ............................................................................................................................................................... 25

IPI DI ROTEINE

S P ............................................................................................................................................... 27

TRUTTURA DELLE ROTEINE

E ........................................................................................................................................................................... 34

NZIMI

Meccanismo Catalitico degli Enzimi ........................................................................................................................ 34

Cinetica Enzimatica ................................................................................................................................................. 36

Velocità di Reazione ...............................................................................................................................................................38

Determinazione dell’Attività di specifici Enzimi a scopo Diagnostico ....................................................................................40

Diagnosi della Patologia ...................................................................................................................................................42

Disturbi del Fegato – Fosfatasi Alcalina ............................................................................................................................43

Disturbi del Fegato – Transaminasi ..................................................................................................................................46

Disturbi del Fegato – – Glutamiltrasferasi .....................................................................................................................49

Infarto al Miocardio ..........................................................................................................................................................49

Differenziazione tra Infarto al Miocardio e Disturbi al Fegato .........................................................................................50

3. PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE ......................................................................................................................53

R P C ....................................................................................................................................... 54

OTTURA DELLE ARETI ELLULARI

Trattamenti Meccanici ............................................................................................................................................ 54

Trattamenti Enzimatici ............................................................................................................................................ 54

S P C P ................................................................................................ 55

EPARAZIONE DELLE ROTEINE DAI OMPONENTI NON ROTEICI

S P P ............................................................................................................... 56

EPARAZIONE DI UNA ROTEINA DA ALTRE ROTEINE

Metodi di Frazionamento a Bassa Risoluzione ........................................................................................................ 57

Tecniche Cromatografiche ...................................................................................................................................... 60

Cromatografia Gel – Filtration ...............................................................................................................................................61

Esempio ............................................................................................................................................................................63

Cromatografia a Scambio Ionico ............................................................................................................................................64

1

Sommario

Cromatografia per Affinità .....................................................................................................................................................65

S C R S P ........................................................................... 67

ELEZIONE DEI AMPIONI ACCOLTI DOPO CIASCUNO TADIO DI URIFICAZIONE

Misura della Concentrazione Totale di Proteine ..................................................................................................... 67

Valutazione dell’Efficacia della Purificazione .......................................................................................................... 68

Esempio ................................................................................................................................................................... 69

Esempio: sequenza di stadi di purificazione ..........................................................................................................................74

E ................................................................................................................................................................ 76

LETTROFORESI

4. APPARATO URINARIO.......................................................................................................................................81

R .............................................................................................................................................................................. 83

ENE

Nefroni..................................................................................................................................................................... 84

Ultrafiltrazione .......................................................................................................................................................................86

Riassorbimento ......................................................................................................................................................................89

Secrezione..............................................................................................................................................................................93

P ’A U ................................................................................................................................. 94

ATOLOGIE DELL PPARATO RINARIO

Dialisi ....................................................................................................................................................................... 95

Scambio dei Soluti .................................................................................................................................................................98

Emodialisi .............................................................................................................................................................................100

Emofiltrazione......................................................................................................................................................................101

Efficienza della Separazione ...........................................................................................................................................103

Dialisi Peritoneale ................................................................................................................................................................103

T P C ........................................................................................................... 105

RASPORTO ATTRAVERSO LE ARETI DI UN ONDOTTO

5. ELETTRODI ...................................................................................................................................................... 115

C G R – Z ...................................................................................................................................... 116

ELLA ALVANICA AME INCO

E M ...................................................................................................................................................... 118

LETTRODI ETALLICI

S P ............................................................................................................................................... 119

ENSORI OTENZIOMETRICI

Sensore Potenziometrico a Vetro per la Misura del pH ......................................................................................... 120

Sensori Amperometrici .......................................................................................................................................... 124

Sensore per la Misura di Acqua Ossigenata .......................................................................................................... 129

6. CARBONATO ANIDRASI .................................................................................................................................. 133

S C S .......................................................................................................................... 134

CHEMA DELLA IRCOLAZIONE ANGUIGNA

D A R ............................................................................................................................ 136

ISPOSITIVI DI SSISTENZA ESPIRATORIA

Rimozione della dall’Atmosfera .................................................................................................................... 137

T S ......................................................................................................................................................... 139

EST PERIMENTALI 2

Spettrofotometria

1. Spettrofotometria

La spettrofotometria è una tecnica analitica basata sull’assorbimento di radiazioni luminose da parte

di soluzioni o di gas. Al variare della lunghezza d’onda abbiamo diverse tipologie di radiazioni ed in

particolare la spettrofotometria si occupa delle variazioni nella regione spettrale compresa tra

200 900 , quindi le lunghezze d’onda che corrispondono alla regione del visibile ed in parte a

200

quella dell’ultravioletto. La lunghezza d’onda della luce visibile va indicativamente dai ai

700 ed al variare della lunghezza d’onda abbiamo diversi colori.

Uno strumento fondamentale in ambito spettrofotometrico è lo spettrometro. Tale strumento

consente di determinare la capacità di un mezzo, in genere di un liquido, di assorbire luce.

Lo spettrofotometro presenta:

- un monitor: dove è possibile leggere un valore;

- una tastiera: utilizzata per inserire il valore di lunghezza d’onda. È importante sottolineare

che ogni soluto ci darà un valore di assorbanza ad una determinata lunghezza d’onda. Se

cambio la lunghezza d’onda, non avrò più lo stesso valore di assorbanza, perché il raggio di

luce inciderà sulla soluzione in maniera differente. Questa tastiera quindi ci fornisce la

possibilità di inserire la lunghezza d’onda a cui noi intendiamo leggere l’assorbanza di quella

data sostanza.

Sul monitor ci sono due valori: un valore che è quello della lunghezza d’onda stabilito per una

);

determinata prova (600 un altro valore più in basso che è il valore dell’assorbanza letto dallo

strumento (data) che può essere negativo e non perché esista un valore di assorbanza negativo

(ricordiamo la definizione di assorbanza) ma perché nello strumento non c’è nessun campione

ancora.

Immaginiamo di avere una provetta con del liquido verde e di farla attraversare da una radiazione

luminosa: 3

Spettrofotometria

Vogliamo sapere quanto vale la radiazione luminosa che riesce ad attraversare la provetta e quanta

parte invece viene assorbita da essa. Queste misure si fanno ad una specifica lunghezza d’onda

quindi sul display dello strumento si indica a quale delle lunghezze d’onda intendiamo effettuare la

misura. Questa operazione la si fa utilizzando un generatore di radiazione, ad esempio una

lampadina, che solitamente genera una radiazione piuttosto complessa che è la sovrapposizione di

diverse radiazioni a varie lunghezze d’onda, tra queste va isolata quella di nostro interesse.

La radiazione viene fatta passare attraverso un prisma che, per effetto dei fenomeni di diffrazione,

determina una deviazione differenziata (con diversi angoli) delle varie componenti della radiazione

a seconda della lunghezza d’onda. Dopo l’attraversamento del prisma si possono distinguere le varie

componenti nelle diverse direzioni (avremo il rosso, giallo, blu ecc..).

Questa deviazione differenziata delle radiazioni componenti la radiazione emessa dalla lampadina

ci consente di selezionare quella che a noi serve. Faremo in modo che solo la radiazione alla

lunghezza d’onda da noi prescelta attraversi il campione.

Solitamente queste misure si fanno ad una lunghezza d’onda ben determinata perché le soluzioni

di liquido solitamente assorbono più a delle lunghezze d’onda e meno ad altre lunghezze d’onda,

quindi per scopi analitici che ci prefiggiamo è più utile adottare quelle lunghezze d’onda in

corrispondenza delle quali questa assorbanza è maggiore.

Chiamiamo l’intensità della radiazione che arriva sul liquido e ci sarà una radiazione residua che

0 . <

è riuscita ad attraversare il liquido di intensità Ovviamente e nella migliore delle ipotesi,

0

ovvero nel caso in cui il liquido non sia in grado di assorbire alcuna frazione di questa radiazione,

= . Quanto più il liquido è in grado di assorbire, tanto più piccola sarà l’intensità della radiazione

0 = 0.

residua. Nel caso in cui il liquido è in grado di assorbire tutta la radiazione, allora

Lo spettrofotometro è in grado di misurare sia la radiazione incidente sia la radiazione finale ed è in

grado di confrontarle. È chiaro che ogni liquido, a seconda delle sostante disciolte in esso, ha

capacità di assorbimento differente. Sappiamo che l’acqua da sola è trasparente ma un solubile

4

Spettrofotometria

disciolto in essa non sempre ha la capacità di assorbire. Ad esempio, sciogliamo una zolletta di

zucchero in acqua, l’acqua rimane trasparente il ché vuol dire che gli zuccheri non sono sostanze

cromofore, ovvero non sono in grado di assorbire luce. Se invece versiamo una goccia di sciroppo di

amarena l’acqua comincia ad acquisire quel colore roseo. Ciò non significa che quella soluzione

assorbe particolarmente la componente rosa della radiazione ma al contrario assorbe tutte le

componenti di quella radiazione tranne il rosa che passera attraverso la sostanza.

Ad esempio, in questa immagine:

È possibile notare che il liquido verde lascia passare la radiazione verde. Mentre invece in questa

immagine:

il liquido verde non lascia passare la radiazione blu.

Nel primo caso quindi il liquido ha una ridotta assorbanza e quindi sarà simile ad , nel secondo

0

≪

caso invece assorbe notevolmente la radiazione per cui .

0

Tornando all’esempio dello sciroppo d’amarena, se aggiungiamo altre gocce il liquido assume un

colore rosso sempre più intenso fino a diventare rosso scuro. Questo ci suggerisce che al crescere

della concentrazione di questa sostanza, la soluzione assorbe una quantità di luce sempre maggiore

evidenziando sempre di più la prevalenza di colore rosso.

Misurando l’assorbanza di una soluzione, cioè la capacità di assorbire luce di una soluzione, siamo

in grado di risalire alla concentrazione della sostanza in questo liquido. Quando in una soluzione c’è

una sola sostanza cromofora, quindi in grado di assorbire la luce, è possibile trovare una relazione

5

Spettrofotometria

tra l’assorbanza (capacità di assorbire la luce) e la concentrazione della sostanza. Nota questa

relazione, effettuando le misure che ci forniscono informazioni sulla frazione di radiazione assorbita,

da questa frazione si può risalire alla concentrazione di questa sostanza visto che al crescere della

concentrazione della sostanza la soluzione è in grado di assorbire una frazione sempre maggiore

della radiazione luminosa.

Diamo una definizione più rigorosa. Abbiamo visto che ed sono le intensità della radiazione

0

rispettivamente prima e dopo l’attraversamento della soluzione liquida. Immaginiamo di avere un

campione di l