Metodologie e tecniche analitiche in biochimica clinica

TARATURA (calibrazione)

Xmentre se è a 4 come 8 , è una regola che può non richiedere il rifiuto della seduta maXpiuttosto essere considerata come indicatore per la necessità di revisione dello strumento oricalibrazione di strumento e kit → nuova calibrazione.

Gli strumenti presenti in laboratorio richiedono una taratura per ogni analita; infatti, senza una curva di calibrazione non posso estrapolare il risultato del dato analitico e il termine taratura si riferisce a quell’operazione che viene comunemente chiamata calibrazione perché viene effettuata con campioni detti calibratori. Si parla di una vera e propria procedura da parte dello strumento e del kit diagnostico che stabilisce una relazione tra i valori di una grandezza forniti da campioni di misura e le corrispondenti indicazioni. Un esempio è la corrispondenza tra i cps letti da un rivelatore in un sistema in chemiluminescenza e la concentrazione rilevata dell’analita.

Producendo in questo modo una curva di taratura che è la rappresentazione della relazione tra il segnale del rivelatore e il corrispondente valore misurato della grandezza che lo produce.

Il controllo è un valore che la ditta fornisce di un campione (valori non fissi ma range in cui sono accettabili), il calibratore invece ha un valore fisso (non deve rientrare in determinati parametri ma serve per mettere un punto fisso) con il quale io costruisco una curva dalla quale poi vado a estrapolare i dati analitici; l'importante è definire i due parametri che legano l'analita che io cerco e il mio range in cui vado a costruire la curva si chiama limite di sensibilità.

La ditta mi da un campione a concentrazione 1, 2 e 3, io lo faccio passare nello spettrofotometro e ottengo dei valori costruendo la mia curva, se poi prendo un campione qualunque e faccio leggere l'assorbanza e mi viene un certo valore io vado a far incontrare la curva e trovo la mia concentrazione.

Una curva reale però non passa mai dallo zero a causa del rumore di fondo, perché non esiste uno strumento in grado di leggere assorbanza zero, perché c'è sempre l'aria, una cuvetta, l'acqua che assorbe una parte della luce; il rumore di fondo si trova facendo un bianco e il rumore di fondo stesso è costituito da varie cose (condizioni ambientali) e comunque è quasi sempre dato dalla strumentazione (ci sono parti meccaniche e ottiche come una lampada che piano piano sta decadendo, una cuvetta che mi si sta opacizzando, un bagno termostatato in cui l'acqua mi ha fatto funghi e si opacizza, un rivelatore che si è sporcato) → l'unica curva di calibrazione reale è quella che fotografa il momento.

La chimica analitica qualitativa è quella parte di chimica analitica dedicata all'identificazione delle sostanze presenti in un campione, è considerata propedeutica alla chimica analitica.

La chimica analitica quantitativa si occupa di stabilire la concentrazione delle specie identificate presenti in un campione. Ogni sostanza ha composizione e caratteristiche strutturali proprie, quindi è possibile mettere a punto metodi appositi per identificarla. Questi metodi possono essere basati sulle caratteristiche fisiche o chimiche della sostanza, facendola reagire con opportuni composti e valutandone il comportamento.

La chimica analitica quantitativa determina sperimentalmente la quantità di una determinata sostanza presente in un campione. Si avvale di tecniche pratiche come i diversi tipi di titolazione e di tecniche strumentali. Il principio su cui si basa è quello di stabilire una relazione matematica tra la quantità di sostanza presente e la caratteristica sperimentalmente sfruttata per determinare tale quantità (ad esempio la massa).

d'onda determinano i diversi colori della luce visibile. Intensità luminosa, che rappresenta la quantità di energia luminosa che arriva ad un punto in un dato intervallo di tempo. Viene misurata in candele o in lumen. Spettro luminoso, che rappresenta la distribuzione delle diverse lunghezze d'onda presenti nella luce. Può essere separato utilizzando un prisma o una griglia di diffrazione. La luce può essere utilizzata in laboratorio per diverse applicazioni: - Illuminazione: la luce viene utilizzata per illuminare l'area di lavoro, permettendo di vedere chiaramente gli oggetti e le reazioni chimiche in corso. - Spettroscopia: la luce viene utilizzata per analizzare le sostanze chimiche in base alla loro capacità di assorbire o emettere luce a determinate lunghezze d'onda. Questo permette di identificare le sostanze presenti in un campione e di determinarne la concentrazione. - Fotometria: la luce viene utilizzata per misurare l'intensità di una reazione chimica o di una sostanza presente in un campione. Questo permette di determinare la quantità di sostanza presente o di monitorare la velocità di una reazione. - Microscopia: la luce viene utilizzata per illuminare il campione e permettere l'osservazione al microscopio. Questo permette di visualizzare dettagli microscopici e di analizzare la struttura e la composizione dei campioni. In conclusione, la luce è uno strumento fondamentale in laboratorio, utilizzato per illuminare, analizzare e misurare le sostanze chimiche e i campioni. La sua natura elettromagnetica permette una vasta gamma di applicazioni e la sua manipolazione consente di ottenere informazioni preziose sulla composizione e le proprietà dei materiali.d’onda ciporta in mondi diversi, si può avere infatti qualcosa di visibile oppure no, ma chepercepiamo; la maggior parte delle nostre ricerche si hanno nella zona del visibile (porzionepiù piccola del nostro spettro che va da 400 nm a 700 nm);

Frequenza di variazioni nell’unità di tempo, quanti cicli completi si hannoànumero• nell’unità di tempo e si misura in Hertz)

Periodo è il tempo occorrente per compiere un’oscillazione completa (o per percorrereà• uno spazio pari alla lunghezza d’onda), si misura in s e si indica con la lettera T (è l’inversodella frequenza);

Velocità di propagazione = dipende dal mezzo in cui si propaga la radiazione• Energia• Intensità•

La luce come tutte le onde elettromagnetiche interagisce con la materia e i fenomeni che piùcomunemente influenzano o impediscono la trasmissione della luce attraverso la materia (e i

corpo possono essere diversi come trasparenti, opachi, impenetrabili e anche la luce può percorrere percorsi diversi e devo tenere conto anche del tipo di luce che sto analizzando) sono: Assorbimento è la capacità di un corpo di assorbire energia mediante onde elettromagnetiche e si realizza quando, posta una porzione di materia a contatto con radiazione elettromagnetica, essa è in grado di assorbire energia dalla radiazione stessa ma come si assorbe questo calore → la materia è costituita da elementi dotati di elettroni che tendono a girare sull'orbitale meno energetico possibile ma quando sono colpiti da un raggio si trasferisce energia e gli elettroni fanno un salto quantico eccitandosi (prendono energia e tendono a restituirla o sotto forma di calore o di luce); l'assorbimento in moltissimi analizzatori ci permette l'individuazione dei nostri analiti (differenza tra l'energia in ingresso e l'energia in uscita).uscita) Diffusione (scattering) = è un'ampia classe di fenomeni in cui una o più particelle vengono deflesse (cambiano traiettoria) a causa della collisione con altre particelle e questo fenomeno in fisica è riferito all'effetto dispersivo della luce svolto da particelle di oggetti macroscopici o microscopici come il pulviscolo o gli atomi di un gas Riflessione speculare (nel caso di superfici lucide e specchiate) = ad ogni raggio incidente corrisponde un raggio riflesso e l'angolo di riflessione è uguale all'angolo di incidenza (raggio riflesso, incidente e normale stanno sullo stesso piano); il raggio che colpisce la superficie torna indietro nello stesso modo sia che il raggio arrivi perpendicolare che con una certa angolazione; Riflessione diffusa = si ottiene in caso di superfici opache, prendo un raggio luminoso e lo faccio colpire uno specchio la luce viene riflessa nella stessa direzione ma se prendo un corpo opaco e

lo faccio colpire da un fascio di luce questo rimanda i raggi all'indietro ma le direzioni con cui vengono riflessi non sono perpendicolari ma vengono dispersi nell'ambiente (un'altra cosa che interagisce è la superficie non perfettamente pari); il raggio che colpisce viene diffuso in più direzioni (con una distribuzione sferica che è indipendente dalla direzione del raggio incidente) e per questo si parla di riflessione diffusa (dipende da superficie, intensità dell'opacizzazione dell'oggetto e sono raggi difficilmente studiabili);

Rifrazione (nel caso in cui non utilizzo corpi che riflettono o opachi) = si ha quando un raggio luminoso passa da un materiale all'altro in cui la radiazione cambia direzione di propagazione e l'entità della deviazione dipende dalla differenza di indice di rifrazione tra i due materiali; per esempio, al mare il raggio che attraversa l'acqua viene modificato con un certo tipo

di angolo che dipende da vari fattori (indici di rifrazione, tipo di liquido, strato che si attraversa)

Diffrazione

• Assorbimento: capacità di un corpo di assorbire energia mediante onde elettromagnetiche (es. luce). Quantità di energia assorbita da un corpo/soluzione = assorbanza.
• Fenomeni che avvengono in base all’interazione dei fotoni con ciò che ci circonda.

L’arcobaleno è un fenomeno ottico atmosferico in cui si ha una separazione delle lunghezze d’onda dello spettro del visibile e si verifica quando la luce del sole attraversa le gocce d’acqua rimaste in sospensione dopo un temporale o presso una cascata o una fontana. È un fenomeno detto dispersione cromatica che in vitro si ottiene con il prisma e la dispersione è un fenomeno fisico che causa la separazione di un’onda in componenti spettrali con diverse lunghezze d’onda (a causa della dipendenza della velocità

dell'onda dalla lunghezza d'onda nel mezzo attraversato); è spesso descritta in onde luminose ma può avvenire in ogni tipo di onda che interagisce con un mezzo.

Il colore si ottiene perché tutte le lunghezze d'onda del visibile sono state restituite da un determinato oggetto mentre se vedo nero tutte le lunghezze d'onda che hanno colpito l'oggetto nero non sono state restituite, se invece ho un colore rosso l'unico raggio restituito è stato quello della lunghezza d'onda del rosso.

Nelle nostre strumentazioni io devo conoscere la luce che utilizzo, le sue sfaccettature per il lavoro che devo fare e tutto quello che è in grado di interagire con la luce; lo spettrofotometro è costituito da:

• sorgente di luce (una luce controllata, bisogna sapere che tipo di luce viene emessa)
• filtro monocromatore
• luce incidente sulla cuvetta contenente il campione
• cuvetta
• luce trasmessa

rilevatore•→ giocando sulla luce possiamo riuscire ad identificare le nostre priorità strumentali i