Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia microbiota umano, prof. Guglielmetti

Ecologia del microbiota umano

L’essere umano è come un olobionte, ovvero un super-organismo definito come l’insieme dell’organismo ospite e di tutti i microorganismi commensali/simbiotici ad esso associati. L’ologenoma è la somma delle informazioni genomiche dell’ospite e di tutti microorganismi ad esso associati. La teoria ologenomica di evoluzione considera l’olobionte, con il suo intero ologenoma, come una unità di selezione nel processo evolutivo.

Distribuzione sito-specifica delle divisioni batteriche negli esseri umani sani

Sebbene i microorganismi comprendano anche lieviti e muffe, la maggior parte dei microorganismi associati all’uomo sono i batteri. In particolare a livello intestinale poiché la superficie del tratto intestinale è di 150-200m², ed a livello della mucosa intestinale il sistema immunitario è costituito da un ricchissimo tappeto linfatico che si estende al di sotto dell’epitelio (GALT). L’intestino rappresenta quindi il sito in cui i batteri hanno più possibilità di comunicare con il nostro corpo: ad esempio nell’ileo l’interno dell’organismo è separato dall’esterno da un unico strato monocellulare, ad elevato turn over. Quindi nell’intestino avviene lo scambio con il mondo esterno, principalmente tra alimenti e batteri.

Le principali funzioni del microbiota intestinale

Il microbiota è considerato un vero e proprio organo metabolicamente attivo del nostro organismo, in quanto svolge diverse funzioni:

• Barriera contro la proliferazione dei patogeni, con un meccanismo di esclusione competitiva - il meccanismo utilizzato dai batteri già presenti nell’intestino per mantenersi in questo ambiente, evitando la colonizzazione degli stessi siti intestinali da parte di altri microorganismi, già presenti o ingeriti. Gli antibiotici distruggono l’effetto barriera e quindi diventiamo più sensibili ad infezioni, soprattutto da parte di Clostridium difficile.
• Regolazione della maturazione del sistema immunitario e sua modulazione - il latte umano è infatti fondamentale per un motivo microbico, è necessario per istruire il sistema immunitario.
• Produzione di vitamine (acido folico, K, gruppo B).
• Regolazione della motilità intestinale - i batteri intestinali modulano i pathway serotoninergici, la serotonina modula le contrazioni intestinali.
• Modulazione dell’effetto degli alimenti sull’ospite - es. parziale recupero di energia dalle fibre alimentari.

Parziale recupero di energia dalle fibre alimentari

Nello studio di Hooper et al. (Annu Rev Nutr. 2002;22:283) viene mostrato il ruolo che ha l’intestino come bioreattore per i carboidrati. I mammiferi assorbono gli zuccheri semplici nell’intestino tenue, tuttavia hanno una capacità intrinseca limitata di digerire i polisaccaridi. I polisaccaridi non digeriti (es. cellulosa, xilano, amido indigerito o glicani di origine endogena come le mucine e i glicosfingolipidi) passano attraverso le parti distali del piccolo intestino (ileo) e del colon e sono degradati dai microrganismi del microbiota intestinale. Possiamo quindi pensare ai batteri dell’intestino come parte di un bioreattore per i carboidrati.

Che impatto può ciò avere per la salute umana e la nutrizione?

La fibra è la parte edibile di piante o carboidrati analoghi che sono resistenti alla digestione e all’assorbimento nel piccolo intestino; la fibra dietetica include polisaccaridi, oligosaccaridi, lignina ed altre sostanze vegetali. Tali carboidrati passano nel colon dove sono degradati dal microbiota intestinale mediante una completa o parziale fermentazione.

Cosa significa fermentazione?

I microorganismi sono in grado di fermentare i carboidrati che raggiungono il colon, in quanto trovandosi in un ambiente anaerobio, hanno necessità di svolgere altri metabolismi energetici, in particolare sotto forma di fermentazioni. La fermentazione è quel processo catabolico che porta all’ossidazione di tali substrati in modo incompleto, producendo prodotti di scarto che sono normalmente acidi organici. Quindi l’attività di bioreattore del microbiota intestinale consiste in un’attività di bioconversione dei carboidrati in acidi organici, anche detti acidi grassi a corta catena (SCFA, Short Chain Fatty Acids).

Gli acidi più abbondantemente prodotti sono:

• Acetato
• Butirrato
• Propionato

I monosaccaridi liberati e gli SCFA prodotti possono quindi essere assorbiti ed utilizzati dall’ospite.

I substrati disponibili per la fermentazione sono:

• Amido indigerito 8-40g/die raggiungono l’intestino
• Polisaccaridi non amidacei 8-20g/die
• Mucina 3-5g/die
• Poliacoli 5-10g/die

Queste quantità sono molto grandi se considerate dal punto di vista microbico! Essi vengono quindi utilizzati per produrre SCFA. Gli SCFA hanno diversi effetti sull’ospite. I carboidrati sono il principale elemento di pressione selettiva che dirige la co-evoluzione tra i microrganismi intestinali e l’ospite.

Bifidobacterium bifidum come prototipo di commensale umano

Bifidobacterium bifidum può essere considerato un prototipo di commensale umano: si trova esclusivamente nell’intestino umano. Ha un genoma molto piccolo (2,2Mb), in cui più del 9% delle proteine totali codificate sono coinvolte nel trasporto e nel metabolismo dei carboidrati. In particolare, B. bifidum possiede più di 30 geni che codificano gli enzimi per la metabolizzazione di oligosaccaridi del latte umano e dei carboidrati alimentari. Quindi rappresenta un batterio co-evoluto con l’essere umano adattatosi al suo ambiente specifico.

Confrontando 7 diversi ceppi di B. bifidum troviamo che tutti presentano in comune diversi geni coinvolti nel metabolismo degli oligosaccaridi del latte materno e mucine. (*Gli oligosaccaridi del latte materno, sono l’elemento più irriproducibile del latte umano: si trovano solo in tale alimento e non sono sintetizzabili chimicamente).

Quindi i batteri intestinali si sono co-evoluti con l’uomo; questa evoluzione è spinta dalla dieta dell’uomo e principalmente dai carboidrati assunti con la dieta: infatti molti batteri intestinali possiedono un elevato numero di strumenti enzimatici che permettono loro di utilizzare i carboidrati indigeriti degli alimenti, indicando un evidente processo di adattamento dei commensali batterici al loro ospite.

La dipendenza del microbiota dai carboidrati della dieta

In questo studio è stato confrontato il microbioma di soggetti giapponesi e soggetti occidentali. I soggetti giapponesi hanno un’alta prevalenza di enzimi porfiranasi e agarasi, due glicosil-idrolasi in grado di idrolizzare i due polisaccaridi amilosio e porfirano (polisaccaride solforato molto difficile da idrolizzare). Questi polisaccaridi si trovano in natura nelle alghe, che infatti vengono utilizzati nella preparazione del sushi. (*Il database CAZy raccoglie e classifica le famiglie di domini funzionali (o moduli) con struttura simile aventi attività catalitica o di binding, presenti in enzimi che degradano, modificano o creano legami glicosidici).

È quindi plausibile pensare che questi geni batterici siano stati in passato acquisiti per via orizzontale dai batteri intestinali grazie ai batteri derivanti dall’alga e siano stati poi trasmessi verticalmente nella popolazione giapponese. Questo studio dimostra l’importanza dei carboidrati alimentari nella costituzione (shaping) del microbiota/microbioma intestinale.

Il trasferimento verticale inoltre non è avvenuto solo a livello batterico ma anche umano. Quindi è possibile che vi sia un trasferimento verticale del materiale del microbioma? Ovvero che la madre trasmetta ai figli anche i geni batterici del microbiota?

Esiste una trasmissione verticale del microbioma?

Studio – Diet-induces extinctions in the gut microbiota compound over generations

Nello studio si è valutato l’effetto di una specifica tipologia di carboidrati sul microbioma di un modello murino. Topi germ-free (sterile) sono stati trapiantati con materiale fecale umano (→ topi umanizzati). I topi umanizzati (a 4 settimane, n = 10) sono stati nutriti con una dieta high-MAC ricca di fibre per 6 settimane e suddivisi in maniera casuale in due gruppi. Un gruppo è stato poi commutato a una dieta low-MAC per 7 settimane (durante le quali sono stati accoppiati a produrre la 2° generazione), dopo di che è stata reintrodotta la dieta high-MAC per 6 settimane; il gruppo di controllo è stato mantenuto sulla dieta high-MAC durante tutto l'esperimento. L’esperimento è stato eseguito su 4 generazioni, in cui la dieta del gruppo diet-switching è stata modificata da low-MAC ad high-MAC ed il microbioma è stato analizzato prima e dopo tale modifica.

Gli autori sono poi andati ad analizzare il microbiota in diversi punti, scelti in modo da poter vedere se vi è una differenza nel microbiota indotta dalla dieta. Questo ragionamento è stato esteso per le diverse generazioni: se infatti il microbiota è indipendentemente dalla trasmissione verticale, le modifiche indotte dalla dieta dovrebbero essere uguali in tutte le generazioni.

• All'inizio dell'esperimento, la composizione del microbiota di entrambi i gruppi di topi era indistinguibile (initial, grafico).
• A 5 settimane, i topi allevati con dieta low-MAC avevano un microbiota a ridotta diversità α rispetto ai controlli alimentati con high-MAC.
• Anche dopo passaggio alla dieta high-MAC per diverse settimane, la loro diversità microbiota non aveva recuperato i livelli dei controlli.

Confrontando il microbiota della generazione G1 contro quello della generazione G4 è evidente che con ogni generazione, la composizione del microbiota del gruppo diet-switching ha mostrato un progressivo aumento della divergenza dai controlli. Per stabilire se la capacità del microbiota intestinale di metabolizzare la fibra fosse stata alterata durante le generazioni, è stata analizzata l’abbondanza dei geni codificanti le glicosil idrolasi (GH) tra le generazioni G1 (a) e G4 (b) di entrambi i gruppi (controllo e diet-switching). 22 famiglie di GH hanno mostrato una perdita significativa di abbondanza nel gruppo diet-switching nella generazione 4 (4 settimane dopo il ritorno alla dieta high-MAC) rispetto al momento iniziale alla generazione 1. Non sono state invece osservate differenze nelle famiglie di GH nel gruppo di controllo. Questo indica che una dieta alternata povera/ricca in fibra, altera il microbiota.

È stata anche eseguita un’analisi della diversità (tiene conto del numero di unità tassonomiche nel α microbiota ma anche della distribuzione di queste unità). Analizzando i diversi punti dello studio, il microbiota ha sempre la stessa composizione nei topi che hanno mantenuto una dieta high-MAC; mentre si ha un cambiamento del microbiota nei topi che hanno subito un cambio di dieta, nel corso delle diverse generazioni.

In particolare, nel gruppo diet-switching, le generazioni G1, G2 e G3 mostrano una perdita progressiva di taxa principalmente appartenenti all’ordine Bacteroidales, mentre i topi alimentati con una dieta high-MAC manifestano sempre una maggiore biodiversità. Molti dei taxa persi, inoltre, non sono più riacquisiti re-introducendo la dieta high-MAC. Per ripristinare la composizione e la diversità del microbiota intestinale ai livelli del controllo non è sufficiente la dieta, ma è stato necessario operare un trapianto del microbiota fecale (FMT) dai topi di controllo ai topi diet-switching di 4° generazione. Entro 10 giorni la composizione del microbiota e la diversità del gruppo FMT non erano distinguibili dai controlli high-MAC di quarta generazione.

Questo studio indica che la dieta povera in “carboidrati accessibili per il microbiota” (MAC) induce un cambiamento nel microbiota (riduzione della diversità e perdita di Bacteroidales) e nel microbioma (riduzione di numerose glicosil idrolasi). Il microbiota alterato, inoltre, è mantenuto nelle generazioni successive, e non torna allo stato iniziale a seguito della reintroduzione dei MAC.

Ciò suggerisce quindi due importanti considerazioni (tuttavia ancora da dimostrare in uomo):

• Una dieta povera in fibre determina un impoverimento del microbiota, con la perdita di alcuni gruppi tassonomici batterici che non possono essere recuperati reintroducendo la fibra nella dieta.
• Il microbioma è trasferito verticalmente alla progenie.

Nell’uomo questo può avvenire a seguito di patologie quali gastroenteriti o consumo di antibiotici: ciò può portare alla IBS (Sindrome da intestino irritabile), un danno non risanabile.

Studio – Impact of diet in shaping gut microbiota

Rivelato da un confronto tra bambini di Europa e Africa rurale

Lo scopo di questo studio è stato quello di comparare il microbiota intestinale di:

• 14 bambini di età compresa tra 1 e 6 anni che vivono in un villaggio dell’Africa rurale in un ambiente che possiede le caratteristiche degli insediamenti ad agricoltura di sussistenza dell’età Neolitica.
• 15 bambini della stessa età dell’Europa occidentale, sottoposti ad una dieta e viventi in un ambiente tipico del cosiddetto mondo sviluppato.

Queste 2 diverse popolazioni di bambini offrono un interessante modello per lo studio dell’impatto di molte variabili ambientali sul microbiota intestinale.

La dieta

La dieta dei bambini del Burkina Faso è povera in grassi e proteine animali e ricca in amido, fibre e polisaccaridi delle piante, ed è prevalentemente vegetariana. Tutti gli alimenti sono completamente prodotti localmente, coltivati e raccolti nelle vicinanze del villaggio. La dieta consiste principalmente di cereali (miglio, sorgo), legumi e vegetali. Il contenuto in carboidrati, fibre e proteine non animali è perciò alto. Solo raramente è mangiata carne di pollo o termiti. Questi bambini africani sono stati alimentati con latte materno fino a 2 anni di età.

I bambini europei sono stati nutriti con latte materno fino ad 1 anno e sono stati quindi alimentati con una tipica dieta dei Paesi occidentali, ricca in proteine animali, zuccheri, amido e grassi e povera in fibre.

Assunzione giornaliera di cibo

Una prima differenza fra i due gruppi è il consumo calorico (600Kcal contro 1000Kcal); le proteine sono comparabili, mentre i grassi ed i carboidrati totali sono molto più alti nei bambini europei. In termini di fibre invece i bambini africani ne assumono molte di più.

Analisi del microbiota

È stata eseguita un’analisi metagenomica del microbiota mediante il sequenziamento delle regioni ipervariabili V5 e V6 del 16s RNA. Da tale analisi è stato ricavato un dendogramma basato sui generi batterici individuati nei campioni dei 29 bambini inclusi nello studio. Dall’analisi è evidente come i due gruppi (africano ed europeo) siano ben distinti ad eccezione di un sub-cluster al centro del dendogramma che contiene gli unici campioni che non possono essere nettamente attribuiti ad uno dei due gruppi. Questi campioni corrispondono ai tre bambini più giovani del Burkina Faso (16BF, 3BF e 4BF, rispettivamente di 1, 2 e 2 anni) e ai due europei più giovani (2EU and 3EU, aventi 1 anno di età).

Tenuto conto che, come precedentemente specificato, i bambini del villaggio africano sono nutriti con latte materno fino a 2 anni di età, mentre quelli europei fino a un anno, pare che le marcate differenze tre i 2 gruppi di bambini derivino dalla loro dieta dopo lo svezzamento.

Composizione del microbiota intestinale dei due gruppi di bambini

Più del 94% delle sequenze di tutti i campioni appartenevano alle divisioni Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria. Alcune divisioni batteriche erano molto più abbondanti nei bambini africani che in quelli europei:

• Actinobacteria (10,1 vs 6,7%)
• Bacteroidetes (57,7 vs 22,4%)

Queste specie vengono ritrovate anche nei ruminanti o in animali che si nutrono di alimenti ricchi di fibre, quindi batteri in grado di idrolizzare i carboidrati complessi in modo molto efficace. Al contrario, negli europei erano più abbondanti i Firmicutes (63,7 vs 27,3%) e i Proteobacteria (6,7 vs 0,8%)

I quattro generi Prevotella, Xylanibacter (Bacteroidetes), Treponema (Spirochaetes) e Butyrivibrio (Firmicutes) sono presenti esclusivamente nel microbiota dei bambini africani. È ipotizzato che la presenza di questi generi può essere una conseguenza dell’elevata assunzione di fibre, che conduce ad una migliore estrazione di energia da questi carboidrati indigeribili. Questi gruppi microbici, infatti, sono in grado di utilizzare xilani, xilosio e carbossimetilcellulosa producendo elevate quantità di acidi grassi a corta catena (SCFAs).

Sono state quindi analizzate le feci dei bambini per identificare la presenza di SCFAs. La misurazione ha infatti rivelato una maggiore quantità di SCFA nelle feci dei bambini africani rispetto a quelli europei: questo spiega il fatto che i bambini africani hanno la capacità di recuperare energia dalla fibra, che non è generalmente fonte di energia, attraverso i SCFA. Gli SCFA sono assorbiti in maniera molto rapida ed efficace: ad esempio gli enterociti utilizzano il butirrato come principale fonte di energia, oppure possono raggiungere il fegato dove vengono trasformati in acidi grassi a lunga catena, esterificati a trigliceridi e quindi stoccati come acidi grassi negli adipociti.

Il microbiota intestinale umano, dunque, è co-evoluto con il suo ospite al fine di ottenere un recupero ottimale dell’energia dalla dieta (principalmente dai carboidrati). Questo studio ha inoltre evidenziato una più grande ricchezza e biodiversità...