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Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia microbiota umano, prof. Guglielmetti

Appunti di Biochimica degli alimenti, della nutrizione e delle malattie metaboliche basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Guglielmetti dell’università degli Studi di Milano - Unimi, Interfacoltà. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano docente Prof. S. Guglielmetti

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Obesità, insulinoresistenza e sindrome metabolica sono associate a modifiche del microbiota intestinale.

Tuttavia i meccanismi molecolari in cui le modifiche al microbiota intestinale possono portare a queste

condizioni non sono ancora del tutto compresi. Lo studio “Acetate mediates a microbiome-brain- cell axis

β

to promote metabolic syndrome” propone un possibile meccanismo.

Questo studio mostra che nel topo gli alimenti ad alto contenuto calorico inducono una modificazione del

microbiota associato all'aumento della produzione di acetato, il quale attiva direttamente il sistema

nervoso parasimpatico, che a sua volta promuove:

- Aumento della secrezione di grelina

- Iperfagia (come plausibile conseguenza dell’aumento della

grelina)

- Aumento della secrezione di insulina maggiore

immagazzinamento energetico come grasso

- Obesità e le condizioni ad essa correlate.

In conclusione, l’attività del microbiota intestinale è correlabile all’obesità e può essere considerato un

target terapeutico.

Diversi meccanismi potrebbero essere coinvolti

1. Fermentazione microbica di polisaccaridi della dieta non digeribili dall’ospite assorbimento dei

monosaccaridi e degli SCFA prodotti conversione degli SCFA ad acidi grassi a più lunga catena e

loro esterificazione con glicerolo a formare trigliceridi nel fegato deposizione dei trigliceridi

negli adipociti

2. Regolazione da parte di microrganismi intestinali dei geni dell’ospite che promuovono la

deposizione dei lipidi negli adipociti

3. Asse microbiota-cervello-pancreas

4. ….Altri meccanismi?

Inoltre, non è chiaro quali gruppi microbici possano essere direttamente implicati in questa patologia.

Alcuni studi suggeriscono che è l’attività del microbiota nel suo insieme, e non singoli microrganismi, ad

essere correlabile all’obesità; altri studi, però, suggeriscono l’importanza di singoli batteri come, ad

esempio, Akkermansia muciniphila.

Cosa può supportare questi meccanismi nel microbiota?

Alcuni studi suggeriscono che è l’attività del microbiota nel suo insieme, e non i sinoli microorganismi ad

essere correlabile all’obesità, altri studi invece suggeriscono l’importanza di singoli batteri.

Infatti gli individui obesi e con diabete di tipo 2 differiscono da individui magri e sani nell’abbondanza di

alcune specie microbiche intestinali quali Akkermansia muciniphila, un batterio Gram- in grado di

degradare la mucina che è stato inversamente associato al grasso corporeo e all'intolleranza al glucosio.

In uno studio è stato indagato l’impatto della restrizione calorica (RC) sull’abbondanza fecale di A.

muciniphila. L'intervento ha previsto un periodo di RC di 6 settimane seguito da una dieta di

stabilizzazione del peso di 6 settimane in adulti obesi e in sovrappeso (N = 49, di cui 41 donne).

10

L'abbondanza di A. muciniphila nelle feci e i parametri bioclinici sono stati misurati prima e dopo la RC e

la fase di stabilizzazione del peso.

Risultati

È stato osservato che i soggetti aventi una maggiore abbondanza di A. muciniphila mostravano uno stato

metabolico più sano, in particolare nei riguardi del glucosio plasmatico a digiuno, dei trigliceridi

plasmatici e della distribuzione del grasso corporeo. Inoltre, gli individui con maggiore quantità di A.

muciniphila hanno mostrato un miglioramento dei marcatori di sensibilità insulinica e altri parametri

clinici dopo la RC.

In conclusione, A. muciniphila è associata ad un migliore stato metabolico e migliori risultati clinici

dopo la RC in adulti sovrappeso/obesi.

Il batterio può quindi essere considerato una sorta di biomarker di tali patologie.

Nello studio “A purified membrane protein from A. muciniphila or the pasteurized bacterium improves

metabolism in obese and diabetic mice” si è misurato il livello di LPS* nel plasma di topi alimentati con

una dieta ricca in grassi (HFD).

*LPS è in grado di migrare in circolo attraverso la barriera intestinale quando essa è permeabile (leaky

gut); ciò può avvenire a seguito di varie cause, tra cui uno stato infiammatorio come quello presente in

soggetti obesi. I topi alimentati con HFD mostrano un contenuto di LPS in

circolo molto più elevato; i topi alimentati con HFD e con Akk

pastorizzata o viva mostrano dei livelli inferiori di LPS.

Ciò è possibile grazie alla presenza della proteina Amuc_1100

di Akkermansia in grado di migliorare la barriera

intestinale: infatti ai topi cui veniva somministrata la sola

proteina manifestavano livelli inferiori di LPS).

Sono stati quindi valutati i livelli di claudine ed occludine

nell’ileo (marcatori di giunzioni strette): le due proteine si

trovano in maggiori quantità nei topi in cui veniva fornita

anche Akkermansia (viva o pastorizzata) o la sola proteina

Amuc_1100, a dimostrazione di una migliore permeabilità

intestinale era migliore. 11 3.11.2017

Studio 5 – Childhood overweight after establishment of the gut microbiota: the role of delivery mode,

pre-pregnancy weight and early administration of antibiotics

Questo studio dimostra che l’assunzione di antibiotici nell’infanzia è associato ad un più alto rischio di

sovrappeso in futuro; ciò suggerisce che, nell’infanzia, la modificazione del microbiota intestinale indotto

dagli antibiotici possa essere determinante per l’alterazione dello stato metabolico durante la crescita.

Quali possono essere, quindi, gli effetti che gli antibiotici hanno sul microbiota intestinale?

Sebbene gli antibiotici hanno lo scopo di colpire i microrganismi patogeni, anche i membri del microbiota

intestinale sono inibiti, determinando spesso modificazioni delle comunità batteriche intestinali che

permangono molto tempo dopo il periodo di assunzione degli antibiotici.

Nel caso degli antibiotici ad ampio spettro di azione, è stato stimato che circa un terzo dei taxa batterici

del microbiota intestinale possono essere influenzati, determinando la riduzione della biodiversità e la

modificazione delle abbondanze relative dei diversi gruppi batterici (disbiosi).

I trattamenti antibiotici non solo alterano la composizione tassonomica, ma anche l’espressione genica e il

metabolismo (e quindi le funzioni) e perciò influisce sui numerosi processi fisiologici umani che sono

influenzati dalle attività del microbiota intestinale.

È stato osservato che, dopo l’assunzione di antibiotici, i gruppi batterici principali tornano ai livelli iniziali

in un periodo che va da qualche settimana a qualche mese. Tuttavia:

- Plausibilmente, non tutti i membri del microbiota tornano ai livelli pre-trattamento, ed alcuni di

essi sono persi dal microbiota potenzialmente per sempre

- Le modificazioni del microbiota indotte dagli antibiotici, anche se transitorie, possono avere un

effetto ben più drastico nell’infanzia, in quanto i bambini si trovano in una fase di maturazione del

microbiota, il quale svolge funzioni fondamentali per la salute umana.

Gli antibiotici hanno tendenzialmente due tipologie di effetti sul microbiota intestinale:

Breve termine

• Drastiche alterazioni del microbiota in termini di composizione e funzione acquisizione e

o →

diffusione di microorganismi patogeni ed insorgenza di fenomeni di opportunismo da

parte di alcuni batteri (es. C. difficile o S. aureus)

Perdita di segnali batterici importanti per il SI

o Diffusione delle resistenze antibiotiche

o Alterazione della capacità fermentativa del microbiota diminuzione dei SCFAs nel lume

o →

intestinale

Lungo termine sono ancora poco noti, prevalentemente associati a bambini, in cui si ha una

• →

correlazione tra patologie (obesità, morbo di Crohn, malattie autoimmuni) e consumo di

antibiotici, tra cui sviluppo di:

Sovrappeso e tessuto adiposo

o IBS (Irritable Bowel Disease)

o Morbo di Crohn

o Allergie

o Asma uso di antibiotici in gravidanza

o → 12

Un numero crescente di studi dimostra che l’instaurarsi del corretto microbiota intestinale

immediatamente dopo la nascita e l’interazione di esso con l’ospite forniscono uno stimolo

indispensabile per lo sviluppo delle funzioni intestinali e immunitarie, con effetti anche a livello

sistemico. Pertanto, qualsiasi disturbo del processo di sviluppo del microbiota intestinale in fase

neonatale può avere implicazioni importanti per la salute infantile e per il rischio di malattia in fasi

successive della vita.

Questi studi suggeriscono l'esistenza di una "finestra di opportunità" per la programmazione microbica

dell’ospite nel periodo neo(peri)natale; in tale periodo il microbiota si sviluppa ed interagisce con il SI,

pertanto, qualunque intervento perinatale che modifichi l'instaurazione e lo sviluppo del microbiota

intestinale in questa fase potrà avere implicazioni importanti per la salute anche a lungo termine.

Il momento esatto di questa "finestra di opportunità" non è nota con precisione e costituisce un'area di

ricerca attiva e intensa. In particolare, si sta cercando di sviluppare strategie di modulazione

microbiologica volte a correggere la potenziale disbiosi presente nelle prime fasi della vita allo scopo di

favorire un adeguato sviluppo microbiotico o di evitare la sua alterazione da parte della

somministrazione di farmaci.

Tra i fattori perinatali che potenzialmente influenzano lo sviluppo del microbiota nel neonato, l'uso di

antibiotici rappresenta la minaccia più comune.

È stato dimostrato che le modificazioni del microbiota intestinale indotte dagli antibiotici nelle prime fasi

di vita determinano un aumento del rischio di sviluppo di effetti indesiderati a lungo termine, mentre ciò

sembra non avvenire (o avviene in misura molto minore) quando gli antibiotici sono assunti in età

adulta.

Nei casi più rari intervenire con antibiotici nel periodo dell’infanzia impedisce totalmente lo sviluppo di

un microbiota sano provocando malattie quali: IBD, diabete di tipo I, leucemie, forme di autismo…

I primi 3 anni di vita rappresentano quindi il periodo più importante e decisivo per gli interventi dietetici

mirati alla modulazione microbiota intestinale con il fine di migliorare la crescita e lo sviluppo dei

bambini e influenzare positivamente la salute.

È stato inoltre individuato che tipo di antibiotico utilizzato sembra essere rilevante in quanto, a seconda

dello spettro di azione, possono essere ottenuti effetti diversi: ciò suggerisce l’importanza di popolazioni

batteriche specifiche in termini di induzione dell’omeostasi nell’ospite.

Ad esempio, la somministrazione orale di kanamicina durante l'infanzia ha promosso lo sviluppo di

lesioni cutanee simili alla dermatite atopica nei topi ed è stato associato ad un cambiamento transitorio

nel microbiota intestinale; ciò non è avvenuto, però, quando è stata somministrata la Polimixina B.

In un altro studio per valutare l'influenza del microbiota intestinale sull’asma allergico in un modello

sperimentale murino, topi neonati sono stati trattati con dosi cliniche di streptomicina e vancomicina.

Il trattamento con streptomicina ha avuto un effetto molto limitato su microbiota e malattia, mentre la

vancomicina ha ridotto la diversità microbica, modificato la composizione del microbiota intestinale e

aumentato la gravità della malattia.

Nessuno degli antibiotici ha avuto un effetto significativo quando somministrato a topi adulti.

13

Quindi antibiotici diversi hanno effetti diversi poiché agiscono con meccanismi diversi:

Kanamicina interferisce con la sintesi proteica poiché agisce sulla subunità 30S ribosomale, ciò si

• traduce in un allineamento non corretto con l’mRNA che porta a errori di lettura provocando

l’inserimento di amminoacidi errati nel peptide.

Streptomicina si lega la 16S, interferendo con il legame alla subunità 30S e inibendo la sintesi

• proteica.

Polimixina B altera la permeabilità delle membrane esterne batteriche destabilizzandole, quindi

• agisce sui Gram-

Vancomicina agisce inibiendo la sintesi della parete batterica dei Gram+.

Il microbiota intestinale nell’infanzia

È interessante notare che i Bifidobatteri di origine umana sono sensibili alla vancomicina, mentre sono

intrinsecamente resistenti alla polimixina B e streptomicina.

I Bifidobatteri appartengono agli Actinobacteria, che

occupano una piccola % del microbiota umano ma

sono dominanti nel microbiota dei bambini allattati al

seno dove rappresentano fino al 80%.

Perché i Bifidobatteri sono importanti nell’infanzia?

La colonizzazione microbica dell’intestino avviene in parallelo con la maturazione del SI e svolge un

ruolo decisivo nella fisiologia intestinale. A partire dalla nascita, la diversità batterica del microbiota

intestinale aumenta e converge verso un microbiota adulto alla fine dei primi 3-5 anni di vita.

I principali fattori che influenzano il microbiota del bambino sono:

1. Tipologia di parto un parto naturale determina un microbiota intestinale più simile alla

mucosa vaginale, mentre per parto cesareo il microbiota è più simile a quello cutaneo

2. Genetica dell’ospite ad esempio la glicosilazione delle mucine intestinali

3. Dieta per un neonato la dieta è costituita prevalentemente da latte materno, che contiene

peculiari oligosaccaridi detti HMO (Human Milk Oligosaccharides). Gli HMO sono carboidrati non

coniugati strutturalmente diversi, molto abbondanti e unici del latte umano. La loro

concentrazione e composizione varia tra le donne e nel corso dell’allattamento.

Il colostro contiene fino a 20-25g/l di HMO, poi progressivamente diminuisce fino a 5g/l.

Gli HMO non sono idrolizzabili dagli enzimi umani ma sono dimostrati essere dei fattori

prebiotici bifidogenetici, cioè delle molecole non digerite dagli enzimi dell’ospite ed in grado di

raggiungere le parti distali dell’intestino, dove promuovono selettivamente la crescita dei

bifidobatteri.

Gli HMO sono anche antimicrobici che impediscono l’adesione di agenti patogeni alle mucose ed

abbassano il rischio di infezioni virali, batteriche e da parte di protozoi e parassiti. Inoltre gli HMO

possono modulare le risposte delle cellule epiteliali e immunitarie e fornire al bambino l’acido

sialico come sostanza nutritiva potenzialmente essenziale per lo sviluppo e la cognizione del cervello.

14

*Prebiotico = molecola che selettivamente inducono la crescita di batteri intestinali positivi per la salute

(probiotici).

Gli HMO sono costituiti da 5 zuccheri monosaccaridi: glucosio, galattosio, N-acetilglucosammina, fucosio e

acido sialico.

Quando raggiungono l’intestino gli HMO incontrano bifidobatteri che li idrolizzano e possono essere in

parte assorbiti: ad esempio l’acido sialico è molto importante per lo sviluppo del SNC.

Il fatto che il latte materno presenti delle differenze individuali nelle tipologie di oligosaccaridi presenti

dipende anche dalla presenza dei geni codificanti enzimi fucosil-transferasici nel genoma della donna.

Anche il sistema dei gruppi sanguigni “Lewis” dipende dalla dotazione genetica per questi enzimi (geni

FUT2 e FUT3); perciò, la composizione degli HMO del latte umano riflette quello dei gruppi di Lewis.

I Bifidobatteri tipici dei bambini allattati al seno (B. longum ssp. Infantis e B. bifidum) possiedono un

ampio numero di enzimi deputati alla metabolizzazione degli HMO, in particolare enzimi deputati

all’idrolisi dei legami tra gli HMO: ciò permette loro di proliferare nell’intestino degli infanti allattati al

seno.

Questo è un esempio di coevoluzione uomo-microorganismo, che vede i carboidrati come principali

promotori del processo.

Si ritiene che i Bifidobatteri possano anche essere gli insegnati del sistema immunitario in fase di

maturazione. Infatti la loro assenza, che avviene in mancanza di allattamento al seno, è associata a

problematiche immunitarie.

Appendice vermiforme

L’appendice vermiforme è un condotto cilindrico di 6-10 cm di lunghezza, molto sottile, che si diparte

dalla parete mediale del cieco, 2-3 cm al di sotto dell'orifizio ileocecale, terminando con una estremità

libera che volge per lo più inferiormente.

È caratterizzata da:

- Maggiore quantità di tessuto linfatico

- Maggiore biodiversità microbica

- Maggiore presenza di biofilm microbici

Questi tre elementi creano un organo a livello dell’intestino che ha come scopo quello di mantenere un

microbiota sano. 6.11.17

I noduli linfatici sono molto abbondanti a livello dell’appendice.

Biodiversità microbica e appendice umana

Gli autori hanno eseguito un’analisi del microbiota mediante profiling di appendici a seguito di

appendicectomia. Dall’analisi è emerso una elevata biodiversità in particolare di batteri commensali

(Bacteroides, Lactobacilli) ed una ridotta biodiversità di batteri negativi.

Quindi a livello dell’appendice vi è una elevata caratterizzata dalla presenza di una maggiore

α-diversità,

abbondanza relativa di batteri “buoni”.

L’appendice è abbondantemente rivestita da film microbico

È stato identificato un biofilm microbico adiacente all’epitelio intestinale, compenetrato nella mucina e

costituito anche dalle immunoglubuline A (IgA); questo biofilm è più abbondante nel cieco, decresce nel

colon ed è minimo in prossimità del retto. 15

Il biofilm microbico è una aggregazione complessa di microrganismi che crescono all'interno di una

matrice extracellulare; il biofilm comprende: batteri commensali, IgA e mucine.

Le osservazioni secondo cui il sistema immunitario supporta la formazione di biofilm microbico

nell'intestino e la presenza di tessuto linfoide abbondante nell’appendice, sostengono l'idea che

l'appendice sia una struttura in grado di mantenere una ricca riserva di batteri intestinali organizzati in un

biofilm connesso alla sua mucosa.

La presenza dell’appendice può quindi determinare un vantaggio per la salute umana: è stato ad esempio

ipotizzato che l’appendice possa favorire una più rapida guarigione nei casi di infezioni intestinali.

Quindi 3 caratteristiche distinguono l’appendice:

- Tessuto linfatico ricco

- Presenza di biodiversità in commensali buoni

- Presenza di biofilm

Malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD, Inflammatory Bowel Disease)

Sono un gruppo di condizioni infiammatorie del colon

e del piccolo intestino, considerate malattie

autoimmuni.

Le principali forme di IBD sono la malattia di Crohn

(CD) e la colite ulcerosa (UC). Altri esempi sono la

colite collagenosa, la colite linfocitica, la colite

ischemica...

CD e UC differiscono prevalentemente nella localizzazione e nella tipologia di cambiamenti immunlogici

ad esse associate

La IBS (Irritable Bowel Syndrome) invece è un insieme di sintomi e segni clinici che rappresentano le

manifestazioni cliniche di una o diverse malattie indipendentemente dall'eziologia che le

contraddistingue.

L ́IBS è un disordine funzionale dell'intestino la cui causa organica non è nota. La sua diagnosi è basata su

sintomi caratterizzati da dolore addominale cronico, gonfiore e alterazione delle abitudini intestinali. Può

essere associato prevalentemente a diarrea o a stitichezza, oppure possono alternare (classificati come

IBS-D, IBS-C o IBS-A, rispettivamente).

Appendice e Clostridium difficile

Un trattamento antibiotico massivo favorisce l’insorgenza e la diffusione di ceppi antibiotico-resistenti.

C. difficile è l’agente più pericoloso in grado di provocare la cosiddetta diarrea associata ad antibiotici

(antibiotic-associated diarrhea, AAD) e può condurre anche alla colite pseudomembranosa, una

infiammazione severa del colon.

In una piccola percentuale di soggetti adulti sani, C. difficile è presente naturalmente come componente

minoritario del microbiota intestinale, mentre altri soggetti possono assumere accidentalmente le spore

di questo batterio durante una degenza in ospedale. Nei casi in cui avviene una somministrazione

massiccia di antibiotici ad ampio spettro (es. clindamicina, ampicillina o cefalosporine), il numero di

cellule di C. difficile aumenta considerevolmente, poiché viene meno l’azione competitiva del normale

microbiota. Le cellule di C. difficile producono una tossina causando gonfiore e diarrea, associati a dolore

addominale. Se l’infezione non viene prontamente trattata la tossina prodotta stimola la produzione di

una pseudomembrana da parte delle cellule intestinali. Se la pseudomembrana diventa abbondante deve

essere rimossa chirurgicamente per evitare la morte del paziente

16

Talvolta le infezioni da C. difficile diventano ricorrenti e recalcitranti al trattamento con antibiotici.

Questo avviene soprattutto in soggetti ospedalizzati per lunghi periodi e sottoposti a drastiche terapie

antibiotiche.

Il ruolo dell’appendice nella protezione dalle infezioni di Clostridium difficile

A seguito di analisi univariata e multivariata, la presenza dell’appendice e l ́età superiore a 60 anni sono

risultati significativamente associati alle infezioni ricorrenti da C. difficile (CDI).

Anche in analisi multivariata, la presenza dell’appendice

La ricorrenza di CDI nei pazienti con appendice è stata del 18 %, rispetto al 4 % in quelli senza

appendice.

Quindi i principali fattori che influenzano l’infezione da C. difficile sono: età e presenza di appendice.

Questi risultati suggeriscono che la presenza di una appendice può proteggere nei riguardi di CDI

ricorrenti.

I potenziali meccanismi di azione suggeriti fanno riferimento a:

- Presenza di biofilm microbico a livello dell’appendice potrebbe accelerare il ripopolamento del

lume del colon, ripristinando una barriera contro la colonizzazione da parte di C. difficile

(esclusione competitiva). I batteri nell’appendice infatti si trovano in elevato numero, non sono

eliminati e trascinati dalla peristalsi, e nel momento in cui andiamo incontro a terapia antibiotica,

possono andare velocemente a ripopolare l’intestino. Inoltre i batteri in appendice possono

andare a svolgere il ruolo di immunomodulazione anche in presenza di antibiotici.

- Difese immunitarie le risposte immunitarie del colon contro C. difficile potrebbero essere

compromesse dalla appendicectomia, portando ad una maggiore vulnerabilità alla malattia

ricorrente (in alternativa o unitamente al precedente).

In conclusione, è stato ipotizzato che l’appendice umana funzioni come serbatoio di microrganismi

benefici che possono essere utilizzati per il ripristino del microbiota a seguito di eventi di colonizzazione

di patogeni, diarrea o trattamento antibiotico.

Questo è anche un esempio di co-evoluzione: l’appendice fa da riserva di microorganismi rappresentativi

dei batteri presenti nell’intestino, che permette all’organismo umano di ripopolare il microbiota a seguito

di infezioni da patogeni in grado di causare diarrea e quindi eliminazione di microflora. La ripopolazione

del microbiota permette la ricostituzione dell’effetto barriera del microbiota intestinale e quindi inibire

lo sviluppo di spore e l’infezione di patogeni.

Ripopolare rapidamente il microbiota

dell'intestino può quindi essere decisivo per

l’insorgenza dei alcune malattie, in particolare

per le infezioni.

Numerosi studi dimostrano che la disbiosi

intestinale è tra i principali fattori che

promuovono la suscettibilità alle infezioni. 17

Una strategia rapida per il ripopolamento del microbiota intestinale è il trapianto di microbiota fecale

(FMT).

Il FMT consiste nel trasferimento dei microrganismi presenti nelle feci di un individuo sano donatore

nell’intestino di un soggetto avente una specifica problematica correlabile a una disbiosi intestinale.

Questa procedura è nota con diversi nomi: trapianto di microbiota fecale (Fecal Microbiota

Transplantation, FMT), fecal bacteriotherapy, trasfusione fecale (fecal transfusion), trapianto fecale (fecal

transplant, stool transplant), clistere fecale (fecal enema) o infusione di probiotici umani (human

probiotic infusion).

Al momento sono disponibili evidenze scientifiche molto chiare che dimostrano l’efficacia del FMT nei

casi di infezioni ricorrenti da Clostridium difficile.

Sono in corso studi per capire se il FMT può essere efficace anche per altre condizioni quali IBD, obesità,

diabete e sindrome metabolica, morbo di Parkinson.

La suscettibilità alle infezioni è strettamente correlata ai batteri intestinali, ed è spesso causata da una

disbiosi intestinale o correlata ad altre mucose (orale, vaginale…) in quanto può promuovere una errata

attivazione del sistema immunitario.

Il FMT consiste nel lavaggio intestinale del paziente seguita dal trasferimento di un frullato di feci di un

donatore (generalmente un parente) mediante clistere, colon-scopia, incubazione nasogastrica o naso-

duodenale.

Al momento è concesso solo per infezione ricorrente da C.difficile, e determina una possibilità di

guarigione superiore al 90%.

Quali sono le implicazioni del FMT?

In realtà non sappiamo esattamente cosa stiamo trasferendo, quali virus siano realmente presenti (oltre

a quelli più noti) e quali funzionalità intrinseche del microbiota stiamo trasferendo.

Un esempio è dato dallo studio “Weight gain after fecal microbiota trasnplantation”.

Nell’IBD ha il 30% di efficacia, quindi non è così efficace nel caso di problemi cronici.

Utile sarebbe riuscire a sviluppare una strategia alternativa che prevede l’impiego di feci sintetiche nel

FMT: in uno studio due donne infette da C.difficile sono state trapiantate con 32 ceppi di batteri isolati

dalle feci di un soggetto sano, rappresentativi di tutte le specie componenti il microbiota umano.

I batteri coltivati sono stati assemblati mantenendo i rapporti presenti nelle feci del campione sano e

trapiantati nei pazienti.

Il vantaggio deriva dal fatto che in questo modo conosciamo esattamente la composizione di ciò che

andiamo a trapiantare, senza virus e altri componenti. Il trapianto ha consentito la risoluzione della

patologia per entrambi i pazienti. 18

Le attività dannose del microbiota intestinale

Microorganismi con attività protettive/dannose coesistono nel microbiota intestinale; i fattori che

influenzano l’equilibrio tra questi batteri hanno importanti conseguenze sulla salute.

Metchnikoff proponeva che lo sviluppo di un colon molto grosso, determina la stasi di cibo per lungo

tempo e quindi putrefazione da parte dei batteri intestinali.

La putrefazione porta infatti alla formazione di molte molecole e tossine.

In accordo la questa ipotesi, oggi sappiamo che diversi enzimi microbici sono coinvolti nella produzione

di molecole mutagene e cancerogene: β-glucuronidasi, nitroreduttasi, azoreduttasi, colesterolo

deidrogenasi, 7-α-deidrossilasi.

Queste attività enzimatiche non sono legate a patogeni ma ai normali batteri intestinali!

-glucuronidasi

β

I glucuronidi (o glucuronosidi) sono molecole in cui è presente l’acido glucuronico, legato attraverso un

legame glicosidico.

La glucuronidazione, ovvero la conversione dei composti chimici a glucuronidi, è uno dei principali

metodi attraverso cui gli animali riescono ad eliminare le sostanze tossiche (di origine ambientale,

alimentare o farmacologica): l’acido glucuronico, una volta legato al composto tossico, ne aumenta

l’idrosolubilità, favorendone l’eliminazione. Gli enzimi che rompono il legame glicosidico dei glucuronidi

sono dette glucuronidasi. L’attività della β- glucuronidasi è stata proposta come un biomarker del rischio

di cancro.

I batteri intestinali, in particolari Clostridia, sono in grado di rompere questo legame e quindi permettono

la stasi di tossine nell’intestino.

Nitroreduttasi

È una flavoproteina responsabile della riduzione del gruppo funzionale nitro di molti composti (R-NO )

2

alla corrispondente idrossilammina (R-NHOH); alcuni composti finali (ammine aromatiche) e gli

intermedi altamente reattivi (intermedi N-idrossilati) derivanti da queste reazioni sono mutageni e

cancerogeni. È nota anche come azoreduttasi, ed è comune a molti batteri, tra cui membri dei generi

Escherichia, Streptomyces, Neisseria, Clostridium.

Azoreduttasi

È un enzima in grado di ridurre le molecole azoiche, cioè che contengono gruppi AZO (-N=N-)

producendo gruppi amminici. Questa attività è importante per la sua azione sui coloranti azoici (per es.

E154) utilizzati in conserve di pesce, prosciutti e patatine fritte; il suo utilizzo è vietato in Europa,

Australia e alcuni altri paesi, ma è permesso nel Regno Unito.

Colesterolo deidrogenasi

Determina una riduzione del colesterolo che porta alla formazione di molecole cancerogene quali il

coprostanone.

Queste molecole da sole non causano la formazione di polipi ma contribuiscono, assieme ad altri fattori.

7- -deidrossilasi

α

È un enzima che trasforma:

- acido colico acido deossicolico

- acido chenodesossicolico acido litocolico (poco solubile ed epatotossico).

→ 19

È stata ipotizzata un’attività cancerogena da parte degli acidi biliari secondari non coniugati (si veda

l’esempio descritto di seguito per il DCA e il cancro al fegato).

Caso studio 1 – Obesity-induced gut microbial metabolite promotes liver cancer through

senescence secretome

Due gruppi di topi alimentati con due tipi di dieta differente, sono stati anche esposti ad un cancerogeno

chimico. Si è quindi valutato l’eventuale sviluppo di cancro al fegato:

- Dieta normale + cancerogeno chimico fegato normale

- Dieta ricca in grassi (HFD) + cancerogeno chimico sviluppo di tumori (carcinoma epatocelluare

associato all’obesità, HCC) Gli autori hanno analizzato il microbiota dei due gruppi: in presenza

di una dieta ricca di grassi il gruppo Bacteroidetes diminuisce

moltissimo, mentre Firmicutes ed altri Gram+ espandono.

Somministrando i topi sotto HFD anche la vancomicina (antibiotico

contro Gram+) i Firmicutes spariscono.

Gli autori hanno quindi valutato l’attività

enzimatica della 7- -deidrossalasi (baiJ) a seguito

α

dell’espansione di Firmicutes, identificanto un

enorme aumento dell’attività enzimatica baiJ ed un

aumento in circolo di DCA (acido deossicolico)

prodotto dell’enzima. Gli autori hanno supposto che DCA fosse responsabile

dell’aumento di tumori nel topo: il trattamento con vancomicina,

agendo principalmente sui Gram+, è in grado di ridurre l’attività

di baij e quindi i livelli di DCA in circolo e di conseguenza la

formazione di tumori, anche in presenza di una dieta ricca in

grassi (HFD).

20 9.11.2017

Sistema immunitario e microbiota

Il sistema immunitario è deputato alla difesa dell’organismo dalle malattie e al mantenimento

dell’omeostasi. I meccanismi di difesa vengono attivati nei confronti di agenti esterni di diversa natura

rilevati come pericolosi per l’organismo.

Un antigene è una sostanza in grado di essere riconosciuta dal sistema immunitario. gli antigeni

riconosciuti come self determinano un meccanismo di tolleranza, mentre quelli riconosciuti come non-

self e come pericolosi inducono delle risposte immunitarie e infiammatorie. un antigene può essere un

cellula intera di un batterio, una proteina o una piccola porzione di una proteina.

Il sistema immunitario è istruito per non rispondere alle molecole self. Ciò avviene attraverso

l’interazione e il riconoscimento di proteine e peptidi di superficie (complesso maggiore di

istocompatibilità, MHC I) che sono presenti sulla superficie di tutte le cellule. Un corretto funzionamento

del sistema immunitario si basa su un’adeguata discriminazione tra self e non-self e sull’attivazione di

risposte immunologiche e infiammatorie che vengono terminate una volta che l’agente scatenante è stato

debellato, senza causare danni alle cellule dell’ospite.

Il SI si divide in:

Immunità innata viene definita come l’insieme di reazioni immunitarie che hanno in comune

• →

la caratteristica di non produrre memoria. Sono risposte rapide che consentono che l’antigene

venga catturato e il patogeno possibilmente distrutto senza conservarne memoria.

Comprende: granulociti, macrofagi, monociti, proteine del complemento, cellule dendritiche

Immunità adattativa è in grado di conservare memoria. Comprende: linfociti T e B , NKT

• →

Sia nell’ambito dell’immunità innata che acquisita, il sistema immunitario opera attraverso una serie di

risposte e cascate di segnale coordinate da mediatori chimici e diversi tipi di cellule immunitarie

rilasciate da organi preposti alla loro produzione e maturazione.

Organi del Sistema Immunitario

Organi linfoidi primari

• Midollo osseo organo in cui avviene l’ematopoiesi a partire dalle cellule staminali

o →

pluripotenti

Timo l’organo dove avviene la proliferazione e maturazione dei linfociti T a partire da

o →

precursori immaturi prodotti nel midollo osseo e successivamente migrati nel timo. In

questo organo avviene un vero e proprio addestramento dei linfociti T noto come

educazione timica: dei linfociti che giungono dal midollo osseo solo circa il 5% viene

riversato nel sangue, il resto (ovvero i linfociti T che non sono in grado di riconoscere il self

o che sono iperreattivi verso il self) va incontro ad apoptosi. L’educazione avviene grazie al

contatto con macrofagi, cellule dendritiche e cellule endoteliali presenti nel timo che

presentano gli stimoli adeguati e necessari per una corretta maturazione e l’induzione

della tolleranza centrale e poi periferica.

I linfociti che riescono a riconoscere le proteine del MHC I (che presentano antigeni self)

diventeranno CD8+ (linfociti citotossici) mentre quelli in grado di riconoscere le proteine

del MCH II (che presentano antigeni estranei) evolvono come CD4+ (linfociti T helper).

21

Organi linfoidi secondari

• Milza organo che agisce come filtro immunologico del sangue: nella milza gli eritrociti

o →

invecchiati vengono fagocitati ed eliminati (funzione emocateretica); inoltre nella milza

sono presenti macrofagi, cellule dendritiche, linfociti B e T, cellule natural killer (NK). La

milza cattura gli antigeni presenti nel sangue la attraversa; inoltre le cellule dendritiche e i

macrofagi circolanti che portano antigeni raggiungono la milza dove gli antigeni vengono

presentati agli appositi linfociti T o B che vengono quindi attivati e rilasciati.

Linfonodi funzionano come filtri immunologici della linfa, fluido che si origina a partire

o →

dal liquido interstiziale presente nello spazio tra le cellule di un tessuto e attraverso il

quale avvengono gli scambi di metaboliti tra sangue e cellule. I linfonodi si trovano a

intervalli lungo il sistema circolatorio linfatico e contengono linfociti T e B, cellule

dendritiche e macrofagi. Antigeni presenti nella linfa proveniente dai vari tessuti vengono

filtrati prima di essere reimmessi nel circolo linfatico. Come nella milza, cellule dendritiche

e macrofagi circolanti che catturano antigeni li espongono ai linfociti presenti nei linfonodi

iniziando una risposta immunitaria e un rilascio e indirizzamento dei linfociti nei siti target

dell’infezione.

*Una continua attivazione dell’asse dello stress può determinare una mancata attivazione delle cellule

NK.

Nei vari distretti corporei sono presenti differenti tipologie di cellule immunitarie preposte all’attivazione di

meccanismi di difesa

Alcuni di questi distretti sono deputati alla produzione e maturazione di determinate cellule del sistema

immunitario, in altri distretti un certo numero di cellule sono presenti come «sentinelle» a presidiare e

monitorare il sito, e vengono attivate o vi confluiscono in maniera più estesa in seguito all’incontro con

un antigene e/o quando richiamate da determinati stimoli/segnali che possono provenire anche da

distretti corporei lontani.

Ad esempio la barriera emato-encefalica: organi considerati una volta immuno-privilegiati come il

cervello e il midollo spinale sono in realtà sorvegliati da cellule immunitarie.

In particolar modo il sistema immunitario riveste un ruolo chiave nei distretti corporei maggiormente a

contatto con l’esterno, come i tegumenti, le vie aeree e l’intestino.

Il SI si trova infatti anche associato alle mucose:

- NALT tessuto linfoide naso-faringeo

- GALT tessuto linfoide della mucosa intestinale

Riconoscimento tra SI e microorganismi

La differenza principale tra immunità innata ed adattativa consiste nel modo in cui le cellule riconoscono

un microorganismo (patogeno o commensale).

L’immunità acquisita riconosce un patogeno attraverso gli antigeni, mentre l’immunità innata riconosce i

patogeni attraverso i PAMP (Pathogen Associated Molecular Pattern) o più genericamente MAMP

(Microbe Associated Molecular Pattern).

I MAMP possono essere presenti solo in batteri, virus, lieviti e altri microorganismi ma non sono prodotti

dall’organismo ospite; essi inoltre sono presenti sia in microorganismi patogeni che in commensali o

probiotici. 22

I MAMP possono essere componenti della parete di uno specifico microorganismo oppure componenti

esterne come flagelli, ciglia, pili o anche elementi intracellulari come DNA o RNA; esempi sono: LPS,

lipoproteine, acidi tecoici, regioni CpG…

Le cellule immunitarie dell ́ospite possono riconoscere i MAMP in quanto esse possiedono specifici

recettori per la loro identificazione, denominati Pattern Recognition Receptor (PRR).

Ci sono tre tipi di PRR:

- Intracellulari

- Associati alla membrana (extracellulari)

- Secreti generalmente impiegati per marcare i batteri, noti anche come complement receptor

Tutti questi tipi di PRR attivano la risposta immunitaria innata e funzionano: avviando i processi di

fagocitosi, attivando i mediatori infiammatori, inducendo la secrezione di interferoni o citochine, o

inducendo apoptosi.

I più noti PRR sono i Toll-Like Receptor (TLR). I Toll Like Receptors (TLRs) sono una classe di

recettori costituiti da proteine transmembrana

espresse da numerose cellule, sia del sistema

immunitario che epiteliali. I recettori TLR

riconoscono motivi molecolari presenti sulla

superficie di numerosi microrganismi, sia

patogeni sia commensali e probiotici. Una volta

a contatto con queste molecole, i TLR attivano

cascate di segnale che dipendono dalla tipologia

del recettore e possono coinvolgere numerosi mediatori molecolari delle vie di risposta immunitaria e

infiammatoria.

La comunicazione tra i diversi reparti del sistema immunitario, e tra loro e i tessuti e i sistemi del nostro

organismo, è affidata a sostanze proteiche collettivamente chiamate citochine. Esse fungono da

messaggeri chimici che vengono percepiti dalle cellule del sistema immunitario e ne determinano una

risposta.

Le principali citochine sono :

- IL-1 , IL-6, TNF attività infiammatoria

β α →

- IL-10 attività antiinfiammatoria;

- IFNγ ed IL-2 hanno attività di attivazione delle NK

- IFN tipo I citochine di risposta virale

Cellule dendritiche

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l’antigene (APC) che inducono risposte immunitarie

verso i patogeni. Il loro nome deriva dal greco dendrón che significa albero, per via delle numerose

ramificazioni che le contraddistinguono. Una delle principali funzioni delle cellule dendritiche è quella di

istruire il sistema immunitario a riconoscere il self dal non self, e quindi di determinare una risposta

immunitaria specifica primaria e una memoria immunologica.

Le cellule dendritiche allo stadio immaturo risiedono principalmente a livello di quei tessuti che fungono

da barriera con l'ambiente esterno e quindi sono più facilmente raggiungibili da agenti patogeni, come la

cute e le mucose, l’epitelio tracheo-bronchiale, o la lamina propria dell’intestino. Le DC immature sono

23

cellule fagocitiche migratorie, localizzate nei tessuti non-linfoidi sopraccitati, che si interfacciano con

l’ambiente esterno.

Attivazione dei linfociti T helper da parte delle cellule dendritiche

A contatto con l’antigene, le cellule dendritiche si attivano (o maturano), internalizzano l’antigene per

fagocitosi e migrano a livello dei linfonodi o della milza. Lì giunte, espongono l’antigene sulla loro

superficie e stimolano i linfociti T helper i quali a loro volta, sono in grado di differenziarsi nei sottotipi di

cellule (Th1, Th2, Treg) in base al tipo di pattern citochinico espresso dalle DC.

Le DC quindi discriminano antigeni differenti in termini di produzione citochinica “istruendo” i linfociti T

helper verso una risposta Th1, Th2 o T reg. Infatti il riconoscimento ed il legame di antigeni differenti

(per esempio batteri o componenti batteriche) a differenti TLR e la conseguente attivazione di specifici

segnali intracellulari determinano il rilascio di differenti patterns citochinici da parte delle DC.

Le cellule dendritiche presentano caratteristiche e funzioni diverse a seconda del sito in cui si trovano

(tipo di tessuto, linfonodi, milza, sangue, mucosa intestinale) inducendo pertanto risposte diverse.

Esse sono inoltre cruciali per l’attivazione delle diverse popolazioni di linfociti. Ad esempio, nonostante i

linfociti NK non necessitino di una elaborazione dell’antigene come per i linfociti T citotossici (CTL), è

stato dimostrato come le DC rivestano un ruolo importante nell’aumentare la citotossicità delle NK grazie

alla produzione di determinate citochine (es. IL12 e IL2).

I meccanismi di risposta dei linfociti T helper

Le cellule Th sono considerate i principali protagonisti della risposta contro gli organismi infettivi. Per

esprimere la loro piena funzione, le cellule Th secernono una varietà di citochine, sulla base delle quali

possono essere suddivise in tre principali tipologie:

T 1, secernenti INF-γ, IL-2, IL-12, TNF-α Inducono una forte risposta cellulo-mediata,

• →

H

sostenuta da una altrettanto forte risposta infiammatoria, capace di distruggere virus e patogeni

microbici intracellulari.

Una polarizzazione “eccessiva” verso una risposta Th1 può portare alla comparsa di malattie

autoimmuni (presenza eccessiva di citochine infiammatorie); le cellule Th1 sono ritenute quindi

in grado di promuovere malattie come il morbo di Crohn

T 2, secernenti IL-4, IL-5, IL-13 inducono una risposta anticorpale capace di attaccare e

• →

H

distruggere batteri e patogeni extracellulari. La marcata polarizzazione Th2 può portare ad un

eccesso di risposta anticorpale soprattutto verso gli allergeni, con sovrapproduzione di IgE.

Le allergie, quindi, si pensa siano da attribuire all’eccessiva polarizzazione del circuito Th2

T 17, secernenti IL-17 hanno un ruolo chiave nell’induzione di risposte anti-microbiche in

• →

H

particolar modo a livello delle mucose e nello sviluppo di diverse malattie autoimmuni, tra cui la

sclerosi multipla, il lupus sistemico eritematoso, la psoriasi e le malattie infiammatorie croniche

intestinali

T , secernenti IL-10 e TGF-β (Transforming Growth Factor) sono i linfociti T regolatori che

• →

reg

svolgono primariamente una funzione inibitoria sulle risposte immunitarie. Le cellule Treg

mantengono l’omeostasi immunitaria e l’equilibrio Th1/Th2.

Un’eccessiva presenza di Treg può portare ad un’incapacità del sistema immunitario di reagire

quando necessario. 24

Il sistema immunitario e l’intestino

Il M.A.L.T. (Mucose Associated Lymphoid Tissue) è composto da tessuti linfatici diversi a seconda del

distretto corporeo in cui si sviluppa, e tutti strettamente interconnessi tra loro.

Il G.A.L.T. (Gut Associated Lymphoid Tissue) rappresenta, negli adulti, il 60% circa del totale di tutti i

distretti! Ciò è comprensibile se si tiene conto dell’enorme superficie di contatto con il mondo esterno a

livello intestinale (superficie superiore a 200m ) rispetto a pelle (2m ) e polmoni (80m ).

2 2 2

L’importanza dell’intestino nei processi di difesa dell’organismo è oggi unanimemente riconosciuta: è

considerato un organo a spiccata attività immunologica.

Al di sotto dello strato epiteliale intestinale circolano, infatti: mastociti, macrofagi, eosinofili, linfociti T e

B e plasmacellule con produzione di immunoglobuline e citochine

Le Placche di Peyer sono grandi aggregati linfoidi sparsi nella tonaca mucosale dell’intestino

(prevalentemente ileo), centro germinativo di linfociti B circondato da linfociti T. L’epitelio sovrastante le

placche presenta delle cellule di tipo epiteliale ma altamente specializzate, chiamate cellule M che hanno

la capacità di internalizzare antigeni interi e riesprimerli sul versante opposto, dove vengono captati e

processati da cellule presentanti l’antigene come le cellule dendritiche.

Il sistema immunitario intestinale, anche nelle sue strutture più importanti (placche di Peyer), ha un

comportamento anomalo rispetto agli altri distretti immunocompetenti: esso infatti attua una strategia

di tolleranza verso molti antigeni (alimenti) e batteri (alimentari, transienti e commensali) e per questo

si dice abbia un fenotipo tolerogenico.

Interazione tra microrganismi e sistema immunitario a livello dell’epitelio intestinale

Le interazioni tra i microrganismi e la mucosa intestinale coinvolgono

le cellule epiteliali (in blu) e le cellule dendritiche (DC, in giallo).

È stato dimostrato che le cellule dendritiche distribuite lungo tutto

l’epitelio enterico, riescono ad infiltrarsi tra le cellule epiteliali

aprendo le loro giunzioni strette senza cambiare l’organizzazione dei

microvilli, svolgendo in tal modo un’attività di monitoraggio

(sampling) degli antigeni presenti a livello del lume intestinale.

I segnali ricevuti attraverso i recettori (frecce rosse) nelle cellule

epiteliali possono indurre l’azione di “sondaggio” delle DC verso i

batteri del lume intestinale (1). I segnali provenienti dai recettori TLR

nelle cellule epiteliali (2) e nelle cellule del Paneth (cellule rosa; 3)

possono indurre la sintesi ed il rilascio nel lume intestinale di proteine

antimicrobiche (vescicole rosse).

Il ruolo centrale delle DC nell’attivazione della risposta immunitaria a livello intestinale e sistemico

Le cellule dendritiche sono cellule presentanti l’antigene in grado di avviare risposte immunitarie

adattative verso antigeni presenti nel lume intestinale (per es. cellule microbiche). Ciò avviene mediante

più step:

1. Campionamento (sampling) di antigeni (batteri) nel lume intestinale

2. Attivazione (maturazione) delle DC

3. Migrazione delle DC verso i linfonodi mesenterici o la milza

4. Attivazione delle cellule NK o dei linfociti T-helper (risposta Th1 o Th2)

25

La stimolazione del sistema immunitario da parte di un batterio a livello locale si traduce in una risposa

immunitaria sistemica.

Effetti immunomodulatori dei microorganismi a livello dell’epitelio intestinale

Il microbiota intestinale contribuisce al benessere dell’individuo grazie a numerosi microrganismi in

grado di innescare una risposta immunitaria (regolatoria o stimolatoria).

La parete di questi batteri, infatti, espone sulla sua superficie il peptidoglicano e altri componenti

coinvolti nell’attivazione delle cellule immuno-competenti dell’intestino, in particolare le DC.

Recenti studi hanno dimostrato che alcuni batteri del genere Lactobacillus interagiscono regolarmente

con le cellule del colon, comprese le DC responsabili della risposta immunitaria primaria. Alcuni ceppi

batterici, per esempio, inducono le cellule dendritiche a promuovere la polarizzazione delle cellule T

helper, funzionando quindi come agenti immunomodulatori attraverso meccanismi ancora non ben

descritti.

Anche batteri alimentari possiedono potenzialmente sulla loro superficie componenti che, riconosciuti

dalle cellule dendritiche, influenzano la differenziazione delle cellule T helper verso il tipo 1 o 2 o uno

stato non polarizzato. In questo caso, i probiotici potrebbero trovare impiego come coadiuvanti di vaccini

o in bioterapie

Il tipo di risposta immunitaria dipende dal tipo di ceppo microbico e dipende dalle caratteristiche

biochimiche dei ligandi microbici coinvolti.

Gli effetti del microbiota sul funzionamento del sistema immunitario comprendono:

Induzione della oral tolerance ovvero di uno stato di non-responsiveness nei confronti

• →

microrganismi commensali. La tolleranza immunitaria è l’insieme dei meccanismi fisiologici

deputati al mantenimento del sistema immunitario adattativo “indifferente” agli antigeni

autologhi

Mantenimento delle funzioni barriera la barriera intestinale è definita come l’unità

• →

funzionale che pone in costante equilibrio l’imponente carica antigenica del lume intestinale con

la complessa organizzazione immunologica e non immunologica della mucosa intestinale. Essa

svolge due funzioni fondamentali per la sopravvivenza dell’individuo:

Permette l’assorbimento delle sostanze nutritive

o Difende l’organismo dalla penetrazione di macromolecole dannose un ruolo

o →

fondamentale per le funzioni barriera è svolto dalle giunzioni strette tra le cellule

dell’epitelio (anche dette tight junction o zonulae occludentes)

Maturazione del sistema immunitario a livello locale e sistemico come dimostrato dal fatto

• →

che i topi germ free presentano tessuti linfoidi poco sviluppati, anomalie nello sviluppo di linfociti

B e T, scarsa capacità di attivare risposte di immunità acquisita.

Il microbiota intestinale può influenzare le risposte immunitarie nell’ospite

I prodotti dell’attività metabolica microbica agiscono da molecole segnale e influenzano lo stato metabolico

dell’ospite, agendo non soltanto a livello intestinale ma anche a livello di altri distretti, come fegato e

cervello.

Il microbiota produce acidi grassi a corta catena (SCFA) che costituiscono una fonte preferenziale di

energia per i colonociti, partecipano al mantenimento delle funzioni barriera dell’epitelio intestinale e

sono coinvolti nella proliferazione e modulazione dell’espressione genica nei colonociti.

26

Inoltre gli SCFA sono in grado di esercitare un effetto diretto sulla modulazione delle risposte

immunitarie, ad esempio inducendo risposte antiinfiammatorie tramite interazioni con specifici recettori

presenti in cellule del sistema immunitario e anche agendo sulle risposte neuroendocrine (ad esempio

inducendo le cellule cromaffini a produrre serotonina con conseguenti effetti sulla motilità intestinale).

Studio – Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria

Topi sterili (Germ-Free, GF) e topi convenzionali (Specific Pathogen Free, SPF) sono stati colonizzati con

batteri filamentosi segmentati (SFB).

Dopo dieci giorni, sono stati isolati i linfociti della lamina propria

dell’intestino tenue; sono stati quindi misurati i livelli di

espressione delle citochine IL-17 e IL-22 in queste cellule

(TCRβ+CD4+): tale colonizzazione è risultata essere sufficiente per

indurre l’espansione di cellule T helper produttrici di IL-17 e IL-22

(cellule Th17) nella lamina propria.

I batteri filamentosi infatti ricoprono totalmente la superficie

dell’intestino e penetrano all’interno degli enterociti: questa

interazione stretta è necessaria per sviluppare risposte di tipo

Th17 e per sviluppare resistenza verso il comune patogeno intestinale murino Citrobacter rodentium.

20.11.17

Studio – An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host

immune system

Le molecole in grado di operare una modulazione della risposta immunitaria sono molte, in particolare

quelle legate alla parete o alla superficie esterna del batterio. In questo studio si è analizzato l’effetto

polisaccaride PSA, in grado di regolare la maturazione dei linfociti.

Ad esempio la proteina S-layer di Lactobacillus, è una proteina che ricopre completamente la cellula e si

organizza in modo geometrico formando delle strutture cristalline.

La proteina S-layer si trova in diversi lattobacilli, quali:

- L. helveticus batterio alimntare, si trova nel Grana Padano

- L. acidophilus batterio commensale coevoluto con l’uomo

Entrambi i batteri possiedono quindi MAMP capaci di stimolare l ́immunità innata dell’ospite, sebbene

con attività immunomodulanti diverse. Uno dei principali MAMP di questi batteri è proprio la proteina S-

layer.

Effetti immunomodulanti possono essere esercitati anche da batteri con i quali normalmente il sistema

immunitario dell’ospite non entra in contatto.

Potenzialmente tutti i microrganismi, di qualsiasi origine, possiedono strutture in grado di attivare le

risposte immunitarie dell’ospite. La conoscenza di queste strutture può permettere un impiego mirato dei

microrganismi al fine di curare o prevenire disfunzioni immunitarie.

Anche piccole differenze nella sequenza aminoacidica o del folding di una struttura proteica, e

modificazioni chimiche (es. sostituzione di gruppi chimici) sulle macromolecole (per es. polisaccaridi,

lipopolisaccaridi, acidi lipoteicoici...) possono determinare effetti molto diversi nelle attività

immunomodulanti di batteri sul sistema immunitario dell’ospite.

27

Ad esempio Pseudoalteromonas sono batteri di origine marina, in grado di scatenare risposte

immunitarie: questi batteri presentano un LPS molto simile a quello di E.coli, ma invece che essere esa-

acilato è penta-acilato, e questo ne cambia il comportamento: infatti rappresenta un ligando in grado di

competere con LPS di E.coli per TLR4 ma non scatena una risposta infiammatoria.

Questi batteri possiedono quindi effetti immunomodulanti: riducono l’espressione della citochina pro-

infiammatoria IL12 e aumentano la citochina anti-infiammatoria/regolatrice IL10.

Anche modifiche della struttura dell’antigene somatico O dell’LPS

comportano una differente risposta immunitaria. Ad esempio il

ceppo Nissle 1917 di E.coli presenta una mutazione puntiforme a

livello del gene wzy codificante per l’antigene somatico O: questo

determina una riduzione della capacità del batterio di resistere ai

meccanismi antibatterici del sangue e quindi una ridotta risposta

infiammatoria.

La teoria degli “old friends”

Il sistema immunitario alla nascita risulta ancora immaturo.

Successivamente, l’incontro con i microrganismi derivanti dalla madre, dall’ambiente esterno, dal cibo,

da altre persone e/o animali domestici, porta all’interazione di diversi gruppi microbici e di loro ligandi

con le cellule epiteliali e immunitarie dell’ospite: i microrganismi con cui veniamo in contatto durante la

vita aiutano ad educare il nostro sistema immunitario.

Questa continua esposizione educa il sistema immunitario ad instaurare meccanismi di tolleranza nei

confronti delle proprie cellule, degli antigeni alimentari, e nei confronti dei microrganismi commensali, e

dall’altra parte ad attivare risposte infiammatorie mirate nei confronti di microrganismi patogeni, le

quali devono spegnersi una volta che la “minaccia” è stata eliminata.

Una sempre minore esposizione con gli old friends (come previsto dalla teoria dell’igiene) è stata

correlata ad un funzionamento anomalo del sistema immunitario e all’aumento dell’insorgenza di malattie

autoimmuni a causa di un mancato riconoscimento e tolleranza verso le molecole self, di allergie

(ipersensibilità verso componenti alimentari o ambientali, es. pollini), o all’insorgenza di malattie

infiammatorie croniche per mancata capacità di risolvere l’infiammazione.

Secondo la teoria dell’igiene nel mondo occidentale si ha un aumento di allergie e malattie autoimmuni

dovuto al fatto che i batteri (gli insegnanti) non si trovino più a contatto con il nostro corpo (es. i parti

avvengono in ospedale dove l’ambiente è quasi sterile…).

Gli eventi che caratterizzano il periodo perinatale infatti sono quelli che maggiormente incidono

sull’instaurarsi di una corretta maturazione del sistema immunitario. Tuttavia anche gli input che

riceviamo durante tutto il corso della vita da fattori microbici e ambientali o con la dieta sono di

supporto e di mantenimento per un corretto funzionamento del sistema immunitario.

Ad esempio è stato osservato come negli anziani che risiedono nelle case di riposo, dove vi sono limitati

incontri con l’ambiente esterno e con altre persone, vi sia una ridotta diversità del microbiota a livello

intestinale, e la presenza di stati infiammatori e sub-infiammatori cronici

Questo è stato dimostrato anche da altri studi: ad esempio uno studio dimostra come nella regione

finlandese della Karelia si registri un’incidenza di allergie quattro volte superiore rispetto alla Karelia al

di là del confine russo. Dall’analisi della polvere nelle abitazioni della Karelia russa è stata osservato un

28

contenuto microbico generalmente più alto, e una maggiore presenza di batteri associati ad animali,

rispetto alla zona finlandese. Il genere Acinetobacter, inoltre, isolato nel lato russo, è risultato invece

assente nella parte finlandese della Karelia.

In questo studio, l’analisi di campioni degli ambienti circostanti le abitazioni di individui allergici, ha

evidenziato una minore biodiversità microbioca, nonché una minore diversità del microbiota della loro

pelle, specialmente per quanto riguarda i Gram- della classe dei Gammaproteobatteri. Nei soggetti sani è

stata invece osservata una correlazione tra la presenza di Acinetobacter (un gamma-proteobatterio) nella

pelle e la citochina anti-infiammatoria IL-10 nelle cellule mononucleate del sangue.

La teoria igienista rivista e ampliata

L’ipotesi dell'igiene sostiene che l'aumentata insorgenza di reazioni allergiche che si è registrata in età

contemporanea nei paesi occidentali sia dovuta ad una carenza nel processo di switch dei linfociti T

helper verso la popolazione Th1, dovuto ad uno switch prevalente verso la popolazione Th2: ciò sarebbe

dovuto alla mancanza di un'adeguata stimolazione del sistema immunitario durante l'infanzia attraverso

gli old friends a causa del sempre maggiore stato di asepsi in cui vivono i bambini nati nel mondo

occidentale.

L’ipotesi dell’igiene è stata recentemente messa in discussione e rivalutata e ampliata sulla base di alcune

osservazioni. Ad esempio in Giappone, dove vi è un elevato livello di igiene e di urbanizzazione, vi è

un’incidenza di fenomeni allergici di gran lunga inferiore rispetto a Stati Uniti e Australia.

L’alimentazione in Giappone si basa, infatti, su un largo consumo di riso, cibi fermentati e pesce, che

comporta un più alto intake di fibre, microrganismi e acidi grassi ω-3.

Le differenze nella frequenza di insorgenze di fenomeni allergici in determinate situazioni sarebbe più

plausibilmente riconducibile alla combinazione di molti fattori, tra i quali un ruolo dominante è svolto

anche dall’alimentazione (oltre a differenze su come e dove i bambini vengono cresciuti, quanti

fratelli/sorelle hanno, contato con animali, piante, ecc..).

Sebbene l’identificazione delle reali dinamiche alla base dell’aumento di allergie nei paesi occidentali non

siano bene comprese, il ruolo chiave dei microrganismi è evidente.

In precedenza abbiamo parlato di linfociti T CD4 helper 17 (Th17), il cui ruolo è principalmente nella

difesa dai patogeni extracellulari (soprattutto nell’intestino), nell’infiammazione e nell’autoimmunità.

Abbiamo, poi, citato un gruppo di microrganismi intestinali, i batteri filamentosi segmentati (SFB)

indispensabili per lo sviluppo delle risposte Th17. Vediamo ora un esempio di come la risposta Th17

indotta dai batteri intestinali può avere un ruolo fondamentale nel mediare l’effetto di un componente

della dieta sulla salute umana.

Caso studio 2 – Salt-responsive gut commensal modulates T 17 axis and disease

H

L'alto contenuto di sale (NaCl) nella dieta occidentale è stato correlato a numerosi disturbi, in particolare

nelle malattie cardiovascolari. L'effetto deleterio di una dieta ad elevato contenuto di sale (HSD) sulla

salute cardiovascolare è determinata dall'ipertensione arteriosa. Finora, la maggior parte degli studi si è

concentrata sul ruolo dei reni, sul sistema nervoso simpatico e sugli effetti diretti sulla vascolarizzazione.

Tuttavia, alcuni studi suggeriscono il coinvolgimento del sistema immunitario in questi processi,

collegando le cellule T proinfiammatorie allo sviluppo dell'ipertensione. In particolare, l'interleuchina

17 (IL1-7A) prodotta dei linfociti T CD4+ helper 17 può favorire l'ipertensione. È noto che i linfociti

Th17 svolgono un ruolo deleterio nelle malattie autoimmuni.

29

Le cellule Th17 sono particolarmente influenzate dall'abbondanza di specifici batteri commensali (si

veda lo studio sui SFB). Si può quindi ipotizzare che l’assunzione eccessiva di sale possa promuovere

l’ipertensione attraverso la modulazione del microbiota intestinale.

Per determinare l'effetto di una dieta HSD sulla composizione del microbiota intestinale, sono state

analizzate le feci di topi alimentati con una dieta salina normale (NSD) o una dieta ad alto contenuto di

sale (HSD) mediante 16S rRNA gene profiling.

L’esperimento ha previsto ha previsto 14 giorni di dieta HSD seguiti

da tre giorni in dieta normale (NSD recovery); il gruppo di controllo,

invece è stato alimentato con la sola dieta NSD.

La quantità di cibo introdotta era la stessa, solo il sale era aumentato.

L’analisi del microbiota è stata fatta con una PCR quantitativa: la concentrazione

batterica totale non era significativamente differente tra i topi NSD e HSD.

È stato poi fatto uno studio del microbiota attraverso 16S gene profiling

per valutare la composizione del microbiota: anche in questo caso non è

emersa una differenza sostanziale tra i diversi gruppi.

Quindi l’assunzione di sale non ha un effetto drammatico sul microbiota

dei due gruppi. Gli autori sono quindi andati a valutare le differenze a livello delle

singole OTU (Operational Taxonomic Unit), ovvero di gruppi che

racchiudono microorganismi con più del 97% di sequenze simili del

gene 16S.

Diverse unità tassonomiche (OTU) erano significativamente

diminuite dopo 14 giorni di HSD (i generi Lactobacillus,

Oscillibacter, Pseudoflavonifractor, Clostridium, Johnsonella e

Rothia), mentre altre erano aumentate (per es. Parasutterella spp).

Per gli stessi campione è stata eseguita anche un’analisi metabolomica, e sono

stati trovati molti metaboliti differenti tra i due gruppi, soprattutto una

riduzione di metaboliti.

L'assenza di ampie differenze tassonomiche è inaspettata, date le differenze

nei metaboliti, ma è coerente con il fatto che le due diete erano identiche nel

contenuto energetico e differivano solo nel contenuto di sale.

Poiché Lactobacillus era il gruppo batterico più fortemente associato alla presenza di nella dieta, è stato

isolato un ceppo di Lactobacillus dalle feci di topo, identificato come L. murinus. La diminuzione

dell'abbondanza di questo ceppo dopo HSD è stata verificata con qPCR.

30

Il Lactobacillus murinus è infatti un microorganismo molto sensibile al sale.

Successivamente è stato verificato come una dieta HSD determina un

significativo aumento della pressione sistolica e diastolica, mentre

una dieta HSD diminuisce l’ipertensione sperimentale sensibile al

sale, ancor più se associata ad un trattamento con L.murinus.

Gli autori hanno quindi misurato le cellule T 17

H

in 3 distretti corporei: milza, lamina propria del

colon e lamina propria dell’intestino tenue

(analisi mediante citofluorimetria).

Una dieta HSD aumentava il numero di linfociti T 17 in tutti i distretti; il

H

contemporaneo trattamento con L.murinus è in grado di ristabilire i valori di

T 17 associati ad una dieta LSD.

H

Questi risultati suggeriscono che L.murinus può prevenire la

generazione di cellule TH17 indotta dalla dieta ricca in sale, e

di conseguenza migliorare l’ipertensione indotta da tale

dieta.

Come riesce L.murinus a contrastare la differenziazione dei linfociti CD4 in cellule effettrici T 17?

H

I lactobacilli hanno la capacità di produrre indoli a partire dal triptofano, in particolare acido indol-3-

acetico ed acido indol-3-lattico. 31


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AUTORE

_ariiel

PUBBLICATO

7 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in alimentazione e nutrizione umana (Facoltà d'Agraria e di Medicina)
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher _ariiel di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed ecologia del microbiota umano e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Guglielmetti Simone.

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