Qualità e sicurezza microbiologica nei sistemi alimentari ed Ecologia del microbiota umano: MODULO PROF. GUGLIELMETTI

ECOLOGIA DEL MICROBIOTA

UMANO

APPUNTI A CURA DI: ALESSANDRO MAGRO

ANNO ACCADEMICO 2020-2021 1

giovedì 1 ottobre 2020

Ecologia del microbiota umano - Lezione 1

Prof Guglielmetti e Foschino. Guglielmetti fa microbiota e Foschino fa microbiologia.

Calendario di Foschino c’è su ariel. Corso diviso in due moduli. Prima parte piu lezioni di

microbiota e poi da pausa didattica piu prof Foschino. In presenza si faranno prove di verifica

e vedranno casi studio su argomenti differenti. Foschino si occupa di sicurezza dei prodotti

alimentari e inizia il 5 ottobre. Nel gruppo Teams e su ariel c’è un documento per la didattica

esami, programma ecc. esame prova orale separata nelle due unità didattiche, c’è un appello

per tutti e due. Orale tramite teams anche in momenti diversi non insieme. Mercoledì e

giovedì ci sarà modulo microbiota.

Microbiota - Guglielmetti

Ecologia microbica di micro del corpo umano è molto buona con impatto medico e di salute

umana che si sta riconoscendo poco a poco.

Usare la sezione post per comunicare con il prof!! Non scrivere mail.

Rapporto tra salute umana e alimenti mediato dai microrganismi associati al corpo umano.

Giovedì inizia alle 13.30 e mercoledì alle 11.30. registrazioni caricate su microsoft stream

(c’è il link su ariel). Su stream si arriva anche da Teams. Fa 1.30h senza pausa. Materiale a

disposizione fino alla fine del semestre. No libri, materiale slide del prof che studia le

pubblicazioni. Usare registrazioni + pdf che da.

Le prime due lezioni sono introduttive per fornire terminologie e materiale comune per

comprendere la didattica. 2

giovedì 1 ottobre 2020

Principi di ecologia

Ogni volta che ci occupiamo di interazione di organismi e ambiente allora ci riferiamo

all’ecologia.

Ecosistema è insieme di tutto cio che costituisce ambiente sia biotico che abiotico. Anche

aspetti fisici, presenza di molecole.

Biota è il materiale vivente di un ecosistema.

Microbiota è la parte vivente del mondo microbico.

Habitat e nicchia ecologica sono diverse. Il primo è una parte dell’ambiente di ecosistema

dove vive una specifica tipologia di essere vivente. La nicchia ecologica è un concetto che

indica il ruolo e la funzione di un organismo nel suo habitat. Si usa per indicare che cosa fa il

biota in quell’ecosistema.

L’ecologia microbica è studio del comportamento dell’attività dei micro nei loro ambienti

naturali. Studio dell’interazione della componente microbica con l’ambiente.

I microrganismi sono organismi viventi

cellulari che fanno parte dei regni monera,

Protista, fungi. Hanno dimensione a livello

del micron, al di sotto della possibilità

visiva del nostro occhio. Occhio umano ha

come limite gli 0.2 mm. C’è il regno dei

protesti con alghe e protozoi; regno fungi

con lieviti (eu unicell) e muffe e funghi

(pluricellulari). Regno monera è dei

procarioti, contiene la maggior parte dei

micro associati al corpo umano. Questi sono

procarioti unicellulari: batteri, archeobatteri

e cianobatteri. Organismi pluricellulari quali

parassiti fanno parte del regno animalia e

non ce ne occupiamo. I virus sono costituiti

da molecole organiche che vivono come

parassita obbligato e anche da non vivente

come struttura cristallina. La letteratura

europea si basa su questa divisione dei

regni. La letteratura americana usa la

classificazione a tre domini: classificazione

di Woese del 1990 con eucaria, arkeae o 3

giovedì 1 ottobre 2020

bacteria. Questi sono divisi in regni: arche, batteria, protista-animali-fungi-plantae. Si ha una

suddivisione maggiore. Regno arche diviso per differenze strutturali, sono marginali per il

nostro intestino.

Microbiologia ambientale: insieme dei processi microbici che si verificano in un ambiente (su

ampia scala). Come certi attività di micro hanno effetto su gas serra, processi trofici

planetari… accezione piu ampia. Quasi sinonimo di microbiologia microbica.

Popolazioni: una singola cellula che cresce crea tante cellule

uguali a se stesse (batteri scissione binaria) e il gruppo di cellule

che si forma si chiama popolazione.

Corporazioni: le popolazioni metabolicamente correlate

costituiscono le corporazioni o gilde.

Comunità microbiche: per valutare piu specie che concorrono in

certi processi nel nostro intestino (come i passaggi che fa la fibra)

si parla di comunità microbica. Conducono processi fisiologici

complementari e interagiscono.

I microrganismi interagiscono sia con l’ambiente che tra di loro.

1. Neutralismo: compresenza di diverse specie senza che ci siano

danni o benefici. Sono neutrali fra loro e si ignorano.

2. Commensalismo: interazione non obbligatoria tra due esseri viventi dove uno approfitta

degli scarti dell’altro senza procurare danno o beneficio. Ad esempio micro intestinali che

si nutrono della fibra che noi ingeriamo (inulina). Il prodotto dell’utilizzo di inulina puo

avere effetto sull’organismo umano. Ruminococcus si nutre di acido lattico, scarto dei

lattobacilli. Rapporto trofico legato al nutrimento. È un rapporto sia trofico che atrofico.

A livello di ecologia può anche non essere trofico.

3. Sinergismo: interazione in cui tutte e due gli organismi traggono beneficio. Le due

popolazioni sopravvivono da sole, ma insieme trovano un beneficio. Esempio dell’ape e

polline del fiore.

4. Mutualismo: o simbiosi. I due micro beneficiano entrambi del rapporto che si instaura,

ma è un rapporto imprescindibile per la sopravvivenza. Il microbiota intestinale attua

mutualismo o una simbiosi. Il corpo umano non sopravvive e non puo essere quello che è

senza il microbiota e viceversa. È un interrelazione obbligatoria che determina un

beneficio per entrambi. Topi germ-freee (topi sterili) non hanno microbiota e non hanno

sistema immunitario efficace. Sterilità di microbiota non è compatibile con

funzionamento dell’organismo superiore. 4

giovedì 1 ottobre 2020

5. Competizione

6. Antagonismo: interazione tra due specie dove almeno una specie subisce danno. Una o

tutte e due subiscono un danno. Di seguito le tipologie:

- Antibiosi: muffa fa un antibiotico che uccide un batterio. Inibizione della crescita e della

riproduzione di un microrganismo da parte di un altro.

- Parassitismo: sempre di natura trofica. Un organismo vivente si nutre a spese di un altro

creando danno biologico. Ad esempio un parassita o una Tenia che sottrae nutrimento

all’animale che va in carenza di nutrimenti. È un commensalismo dove ‘organismo che

viene parassitato subisce un danno a livello solitamente trofico.

- Predazione: a livello trofico si ha una preda che è preda per il predatore e di cui si nutre.

Nei batteri non si identifica chiaramente, ci sono certi micro che si nutrono di componenti

costitutive di altri (rara).

- Competizione: interazione quando c’è interessa di due organismi per una stessa risorsa,

ambientale o nutrizionale.

Terminologia e nomenclatura dei microrganismi

Classificare elementi con caratteristiche comuni. La tassonomia da anche un nome sulla base

di specifiche regole. La nomenclatura è l’insieme di regole da seguire. Identificazione è atto

di assegnazione di un nome. Filogenesi è processo evolutivo che ha permesso creazione di

gruppo di micro viventi. 5

giovedì 1 ottobre 2020

Nomenclatura binomiale:

Denominare qualsiasi organismo vivente

sulla base di regole stabilite da Linneo

nel 1753. È un modo di denominare gli

organismi basato su unità di base degli

organismi che è la specie. Specie è

insieme degli individui che hanno

elevato numero di caratteristiche

comuni, somiglianze a livello anatomico morfologico e fisiologico. Tali caratteristiche

differenziano gli individui di specie diverse. Assegnare per descrivere una specie sempre due

nomi. Questi sono i nomi di due livelli tassonomici di base ovvero genere e specie. Epiteto

generico ed epiteto specifico. Noi siamo Homo sapiens. Questo vale per tutti i viventi

Saccharomyces cerevisiae. Genere e specie sono livelli di base della tassonomia. Tassonomia

è gioco di contenitori per classificare gli organismi in funzione delle caratteristiche e si

raccolgono in gruppi

omogenei

che sono i TA X A

( TA X O N

singolare).

Solo genere e specie si scrivono in corsivo. I livelli superiori no. Prossima volta partiamo dal

concetto di ceppo! FINO SLIDE 13 6

mercoledì 7 ottobre 2020

Ecologia - lezione 2

Concetto di ceppo molto importante per la classificazione.

La divisione phylum è particolarmente grande. Importante per l’ecologia microbica.

Ceppo:

Concetto fuori dalla tassonomia. I livelli tassonomici hanno regole di nomenclatura basate

sulla lingua latina. Il concetto di ceppo è fuori da queste regole, fuori dalla tassonomia. Per i

micro che ci interessano, il concetto di ceppo è l’insieme di tutte le cellule microbiche che

sono teoreticamente originate da un unica cellula progenitrice. Il concetto è importante

perche fa vedere la biodiversità che c’è tra i livelli tassonomici. La specie non definisce in

modo specifico le capacità e le abilità di un certo organismo, ci sono livelli di diversità

enormi. Escherichia coli è specie che sta nel nostro intento e non ci provocano danni, ma

hanno funzioni positive. Ci sono alcuni ceppi pero che non vanno bene come quelli entro-

emorragici. Ci sono anche escherichia coli usati come prodotti probiotici. Il ceppo ci permette

di esprimere la biodiversità che c’è in un livello tassonomico. in ecologia microbica

raramente si parla di ceppi.

Attenzione al livello del Phylum, comprende molti generi e specie. È un livello che ci

permette di descrivere bene gli ecosistemi microbici. L’ecosistema intestinale ha molti

microrganismi e non ci si puo basare sulle specie, per descriverlo globalmente ci si basa sul

livello tassonomico del phylum (divisione).

Vediamo le divisioni che piu ci possono

interessare.

Gli arche sono estremofili. Nella figura ci sono

le principali che ci interessano di piu. Per

esempio in firmicutes troviamo bacilli,

lactobacilli, lactococcus… vedi immagine

I proteo batteri sono i gram negativi e sono

principalmente le enterobatteriacee.

Alla base ci sono gram positivi fon a

deinococcus e chlorofexi, quelli sopra sono

gram negativi. 7

mercoledì 7 ottobre 2020

Modo di presentare la fillogenesi

batterica basandosi sempre sui phylum.

PCR è base di tecnologie che mostrano

molti risultati.

Identificazione tassonomica batterica

Per distinguere a livello microbico diverse specie allora il nostro occhio non basta e servono

altri strumenti. Si basa su identificazione della specie, unita fondamentale della tassonomia.

Specie è una collezione di ceppi simili che differiscono sufficientemente da altri gruppi di

ceppi da giustificare il riconoscimento come unita tassonomica a se stante. Definizione molto

filosofica e poco concreta. La microbiologia ha stabilito delle regole concrete e dei limiti per

definire tale concetto. Ogni specie si definisce come un gruppo di ceppi, tra questi ce n’è uno

che è quello di riferimento. In microbiologia per

assegnare ceppo ad una specie bisogna fare

riferimento al capostipite di quella specie che è il

ceppo type. Si puo prendere da varie fondazioni

che collezionano microrganismi. Le piu

importante sono rappresentate qui a lato.

Importante il concetto di ceppo type! Per parlare

di identificazione batterica bisogna parlar di

specie —> ovvero un insieme di ceppi. Le specie

per gli eucarioti sono molto diverse, basate sula sessualità. I batteri non hanno sessualità. I

ceppi di riferimento (type) si comprano quindi per poter confrontare dei ceppi ritrovati e

poterli definire. I ceppi devono avere un certo grado di similarità, un livello limite per

l’appartenenza alla specie. Difatti i ceppi sono diversi. Per ogni specie abbiamo piu ceppi che

fanno parte della specie, ma il ceppo type nella specie è uno solo. Tutti gli altri devono fare

riferimento a questo per far parte della specie. Il ceppo type viene scelto arbitrariamente da

chi indaga su una specie nuova. La t esponente nel nome indica che è un ceppo type.

Le slide con il tratteggio azzurro sono di ripasso, non sono cose che chiede.

Il concetto di specie batterica

Negli organismi microbici bisogna utilizzare delle regole che pongono confini alle specie e le

regole sono arbitrarie e stabile dai microbiologi per comodità. Importante ricordarle. I ceppi

di una specie devono essere simili a livello fenotipico (che molecole producono, morfologia).

Devono avere almeno una proprietà fenotipi che li distingue tra tutte le altre specie. 8

mercoledì 7 ottobre 2020

Omologia genetica con il ceppo type

maggiore del 70%

Elevata omologia filogenetica basata

sul gene 16s rRNA (almeno 98%

simile al ceppo type)

Queste regole concrete vanno

ricordate e le chiede all’esame.

Riassociazione molecolare DNA/DNA.

Ho un ceppo, ipotizzo che appartenga ad una specie. Estraggo DNA del ceppo type e del mio

ceppo.

Prendo il dna e lo metto in cuvetta di quarzo e lo monitoro con lo spettrofotometro che mi da

uno spettro di assorbimento (260nm). Monitorando la densità ottica a tale lunghezza, mentre

riscaldo il DNA, avrò la curva di ipercromicità. Questa curva fa vedere cosa succede al dna

mentre scaldo, si sta denaturando. I due filamenti del dna si stanno staccando. Questo

determina un aumento della densità ottica, che scende se io raffreddo. Facciamo questo con il

dna di un singolo ceppo. quando raffreddo la curva scende molto tornando a valori iniziali,

perche i due filamenti si ri-appaiano (re-ibridano) e la densità ottica scende. Non è uguale

all’inizio perche il ri-assembramento puo variare. 9

mercoledì 7 ottobre 2020

Se miscelo dna di due ceppi e faccio questo:

Se dna simile: la curva rimarrà alta

Se dna diverso: la curva scende molto

Quando miscelo i due ceppi (type di specie e uno nuovo) ho un 20% di riassociazione circa.

Curva di ipercromicità si ottiene denaturando il DNA con l’innalzamento della temperatura.

Si staccano i due filamenti e aumenta intensità ottica. Raffreddando i filamenti si appaiano.

Se sono filamenti di un batterio allora si ri attaccano bene e la curva scende molto. Se sono

due batteri allora questa associazione (raffreddando) sarà piu difficile e la curva rimane

elevata a livello di densità ottica. Se i due filamenti si riappaiono allora i due ceppi

appartengono alla stessa specie (almeno 70%).

Se i due dna sono molto simili la curva si abbassa, se sono molto diversi la curva rimane alta.

Curva molto alta 0%, curva molto bassa come il ceppo da solo sarà 100%. Il limite empirico

è il 70%.

Un ceppo simile ad un altro ceppo significa che ha sequenze di dna simili.

Omologia basata sul gene 16s rRNA. Questo gene è molto importante. Il ribosoma batterico

ha la stessa funzione e costituzione biochimica analoga a quello eucariota. I ribosomi

permettono la sintesi proteica e la traduzione del RNA messaggero in una catena

polipeptidica. Il ribosoma batterico, denaturando centrifugano e trattando, lo posso

frammentare in molecole di RNA e molecole proteiche. Il ribosoma batterico ha un

coefficiente di sedimentazione che è 70S (di intero ribosoma). Quello eucariota ha 80S. Se

tratto con il magnesio (glielo tolgo e si destabilizza) la struttura si separa in due subunità 50s

e 30s. Sono costituite da RNA e proteine. Se volessi staccare RNA da proteine allora

aggiungo urea (è polare, ha due cariche positive sull’azoto, rompe interazione tra le proteine e

il dna) che denatura le interazioni deboli di tipo elettrostatico e legami idrogeno. Cosi ottengo 10

mercoledì 7 ottobre 2020

una serie di proteine e RNA ribosomiali, 5S 23S E 16S (molecole di RNA che arrivano da

una trascrizione di geni).

I geni che codificano RNA del ribosoma non vengono tradotti. Questi RNA provengono dalla

regione genica che si chiama operone (insieme di geni che sono trascritti assieme, hanno un

promotore unico) ribosomiale. È un frammento di DNA. Il gene 16S è un gene di media

dimensione, 1500 paia di basi, ed è quello che codifica per RNA ribosomiale 16S.

Parliamo di questo gene perche i geni variano molto da batterio a batterio. Il 16S ci interessa

perche ce l’hanno tutti, tutte le cellule viventi hanno i ribosomi! Servono per tradurre mRNA

in proteine. L’RNA 16S si assembla a fare strutture a forcina e ha una struttura 3D che

permette di tradurre. La forma tridimensionale avviene per via dei legami deboli tra le basi.

Quando cambio un singolo nucleotide, interferisco sulla sua capacita di avere struttura 3D. Il

gene 16S codifica per un RNA che non puo mutare facilmente. Si definisce altamente

conservato, ovvero che nel corso dell’evoluzione non subisce mutazioni. Il gene 16S pertanto

è uno come altri, ma è importante perche tra i piu conservati in assoluto. Lo hanno tutti i

batteri e non puo assorbire mutazione, perche avrebbe una perdita di attività legata alla

modifica della struttura. Serve come orologio molecolare. Se si vogliono stabilire relazioni, il

16S ha lunghezza giusta per lavorare. Orologio molecolare: un gene molto conservato subisce

mutazioni molto lentamente. È molto simile tra i batteri, ma non identico. Trovo in questo

delle regioni che rimangono uguali e pochi mutamenti. Se provo a comparare lattato 11

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deidrogenasi di due batteri diversi, queste sono completamente diverse. Se prendo il 16S,

questo è conservato e ha accumulato nel corso di milioni di anni pochissime mutazioni.

All’interno del gene ogni specie avrà determinate modifiche. A seconda della modifica posso

capire a che specie appartiene il microrganismo. Si confrontano le differenze tra