Microbiologia industriale con slide per l'esame, prof. Rollini

DOMANDA ESAME FONTE AZOTO

FONTI DI FATTORI DI CRESCITA DI IMPEGO INDUSTRIALE è DOMANDA D’ESAME.

Sono ingredienti ricchi di vitamine, le vitamine sono importanti per i microorganismi, facilitano lo sviluppo

microbico e alcune reazioni metaboliche. Cerco ingredienti grezzi che ne contengono un po, per non doverle

comprare e aggiungerle poi nel terreno colturale. 12

Quaderno di Alessandro Magro

FONTI DI FATTORI DI CRESCITA

1. Estratto di lievito: proviene da cellule di lievito lisate. Sono trattate termicamente, non più attive a

livello fisiologico e rimangono inalterate le vitamine presenti. L’estratto di lievito si puo usare in polvere

o in pasta. Non si usa come fonte di azoto perche molto caro. In piccole quantità si aggiunge alle colture

per il suo contenuto in vitamine. In commercio esistono anche integratori a base di lievito inattivato per

facilitare la ricrescita dei capelli, migliorare stato delle unghie, ci sono integratori a base di cellule di

lievito inattivate.

2. Idrolizzato di caseina: deriva dal settore lattiero-caseario. Le caseine sono proteine del latte,

contengono amminoacidi nobili e delle vitamine che si portano dietro. Ho una proteina che deve essere

tagliata, posso farlo per via acida o enzimatica ottenendo due prodotti diversi. L’idrolizzato acido di

caseina ha un contenuto di NaCl che può essere importante, costa di meno ma può dare problemi ad

alcuni microorganismi. Quello enzimatico è più tollerato e costa un po di più, ha meno sali.

FONTI DI MINERALI:

Supponiamo di fare 150L di coltura, gli ingredienti vanno sciolti in acqua (in lab si usa acqua distillata), ma

in un fermentatore enorme non si usa acqua distillata, ma l’acqua di rete ovvero l’acqua del territorio. Alcune

aziende hanno delle cartucce filtranti per modificare la composizione dei sali minerali. L’acqua di rete

generalmente contiene un certo quantitativo di minerali che è anche gradito ai processi microbiologici. Puo

contenere ferro, cobalto, zinco, manganese… in alcuni casi non bastano e vengono aggiunti dei sali come

solfato di magnesio, solfato di rame.

ANTISCHIUMA:

Supponiamo di avere un fermentatore da 100L, mettiamo dentro 100g ogni litro di melasso ecc ed

inoculiamo un microrganismo aerobio. Facciamo entrare aria nel fermentatore e le bolle devono essere

omogeneamente disperse. La prima cosa che succede è la formazione di una schiuma. Il sistema va agitato

tramite meccanismi, succede che se non stiamo attenti dopo 2 ore la schiuma si alza di livello fino a uscire

intasare le valvole ecc…causando dei grandi rischi.

Una sostanza che abbassa la tensione superficiale e limita la formazione della schiuma va aggiunta!

Antischiuma ideale

Possiamo avere antischuma naturali e antischiuma di sintesi.

Quelli naturali sono gli oli, se aggiungo 3 gocce di olio in un fermentatore allora la schiuma si abbassa

perche olio è tensioattivo.

l’olio è una fonte di carbonio, il microrganismo puo usarlo e puo tornare la schiuma.

Gli antischiuma di sintesi sono composti ad alta viscosità come siliconi che si aggiungono all’inizio del

processo fermentativo, non vengono usati dal micro e durano per tutto il processo. Unico problema è che

possono interferir nel processo di purificazione, possono venire estratti insieme al solvente e creare delle

interferenze. 13

Quaderno di Alessandro Magro

Micro industriale audio Andrea lezione 4 del 19/03

Cosa altro serve in un terreno colturale?

Controllare il pH, generalmente nel corso dello sviluppo microbico il pH della coltura tende a diminuire

perche vengono prodotti acidi organici quali acido lattico, acido acetico…

È fondamentale che il pH non raggiunga livelli incompatibili con il nostro processo microbiologico. Per

mantenere il pH esistono dei correttori. Questi possono essere tamponi oppure acidi e basi aggiunti in

risposta ad un segnale. Nel caso dei sistemi tampone questi possono essere aggiunti alla formulazione del

sistema colturale, come il KH2PO4. Possono essere aggiunti nella formulazione del terreno in modo che

sono questi sali che bilanciano il pH del terreno.

Oppure possono essere aggiunte delle polveri come il carbonato di calcio. Il carbonato di calcio è il calcare,

cio che si forma intorno ai rubinetti. Il calcio carbonato è insolubile a pH neutri —> croste

Per togliere il calcare dalle superfici si utilizza un anticalcare, che è un acido che rende solubile il carbonato

di calcio. Si aggiunge alla soluzione del terreno colturale il calcio carbonato, dunque se il pH è neutro questo

si deposita come una polverina ed è inerte.

Nel corso del processo venendo prodotti gli acidi organici, il carbonato di calcio si scioglie perche il pH si

abbassa. Lo ione calcio puo anche essere utile per i microrganismi.

In alternativa posso usare acidi o basi. Nel fermentatore troviamo sempre un pHmetro, una sonda che misura

l’acidità del terreno. Se il terreno diventa troppo acido aggiungerò una base come ammoniaca, idrato di

ammonio. Se il terreno diventa basico, si aggiunge acido solforico o cloridrico e questo riporta al pH

desiderato.

Precursori aggiunti nel terreno se ho delle molecole complesse che voglio far costruire al microrganismo.

Un esempio è inserire parti della molecola già pronte nel terreno cosi che il micro non spenda energia per

produrre queste parti da solo. Alcuni sono acido fenile-acetico, atomo di cobalto (presente nella vitamina

B12). Tutti gli ingredienti che abbiamo visto fino ad ora si sciolgono in acqua, generalmente distillata che

non contiene metalli e nessun residuo. In un impianto industriale acqua distillata si usa in modo oculato

perche costa molto. Si usa in alternativa l’acqua di rete, quella del rubinetto che costa molto meno e contiene

dei sali dovuti al fatto che passa dalle tubature, che possono aiutare il microrganismo e possono essere

considerati dei minerali utili.

In alcune produzioni come per la birra l’acqua di rete viene controllata perche alcuni elementi sono deleteri

per quel processo produttivo come il cloro. In un impianto industriale acqua non serve solo a sciogliere gli

ingredienti ma serve anche alla termostatazione, mantenere il fermentatore ad una temperatura adatta

durante tutto il processo fermentativo.

L’acqua distillata si usa solo quando serve trasformarla in vapore per la sterilizzazione, si usa solo per

sterilizzare.

Fermentatori:

Per far crescere un micro su scala industriale devo considerare molti fattori, non basta un bio-reattore per

fare un processo efficiente. Innanzitutto mi devo credere che cosa devo far crescere, che tipologia di

organismo è.

Noi vediamo reattori per cellule microbiche, quindi batteri lieviti e funghi. Devo valutare inoltre la

disponibilità di ossigeno, devo sapere se aggiungere la linea dell’aria o meno a livello di impianto.

Altre domande riguardano il tipo di substrato, la sterilità, le dimensioni e le tecnologie da adottare.

Per esempio il processo di produzione della birra spesso non avviene in sterilità.

Posso allestire processi su scala di laboratorio e lavorare su colture liquide in beuta. Fino a 10-30L sono in

scala pilota e si fa in fermentatori piccoli. Scala industriale si fa per volumi molto superiori. 14

Quaderno di Alessandro Magro

Fare lo scale-up di un processo vuol dire trasferire i risultati

dalla procedura di laboratorio alla scala industriale.

Terminologia

- Terreno culturale: Insieme di tutti gli ingredienti sciolti

nell’acqua. Non c’è il microrganismo, sto parlando

solamente di mix di ingredienti e non di microrganismo.

- Inoculo: aggiunta di microrganismo nella soluzione di

treno culturale. Di solito uso un volume ridotto di cellule

che trasferisco nel fermentatore, le cellule vedono un

terreno nuovo si adattano e iniziano a crescere.

- Inoculo+terreno culturale si dice coltura microbica: mix

di cellule microbiche nel proprio terreno culturale

- Il fermentatore va avanti, il microrganismo raggiunge la

fase stazionaria e a questo punto spengo il fermentatore e

scarico la mia brodocoltura. Posso separare le cellule

dalla parte liquida e le cellule si chiamano biomassa

mentre la parte liquida si chiama filtrato colturale.

- Nel filtrato colturale troviamo i residui del terreno

precedentemente elaborato (utilizzato dal micro) e in piu

i metaboliti che il micro produce e rilascia nel terreno.

Scala di laboratorio:

Le prove da condurre si allestiscono in beuta, contenitore

tronco-conico con una base larga che riduce il suo diametro spostandosi verso l’imboccatura della beuta. Le

colture liquide si possono allestire in alto strato o basso strato.

- Alto strato: terreno culturale occupa la metà del volume della beuta. Ha una limitata superficie a contatto

con l’ossigeno. Si allestiscono per far crescere i microrganismi che non tollerano l’ossigeno. Si usa per

batteri lattici anaerobi che crescono e depositeranno cellule sul fondo della beuta, nel punto piu lontano

dall’ossigeno.

- Basso strato: terreno culturale occupa una decimo del volume contenuto dalla beuta, riempio solamente

la parte bassa —> si ha un ampia superficie a contatto con l’aria e quindi con l’ossigeno. Va bene per

microrganismi aerobi. Il micro farà una film superficiale vicino all’ossigeno.

Per migliorare gli scambi di ossigeno, quindi solo per le colture in basso strato, posso aggiungere anche

l’agitazione ovvero posso agganciare le beute su un sistema che impone alla beuta un certo grado di

agitazione. L’agitazione muove la superficie e favorisce gli scambi del gas. Le colture agitate spesso vengono

allestite in beute che hanno nella parte bassa una rientranza del vetro che si chiama frangiflutto. Tale rientro

del vetro fa in modo che quando il sistema si agita, non si formi ne un vortice centrale ne una preferenza di

direzione della coltura, bensì si crea un ambiente turbolento. Serve per rompere eventuali flussi che si

possono creare e aumenta la turbolenza del sistema.

Gli agitatori possono essere esterni oppure ci sono dei box a temperatura controllata.

Quando aumentiamo i volumi si passa ad uno schema piu complesso:

Tutte le operazioni che vengono svolte per la preparazione del terreno colturale, la sterilizzazione e la

fermentazione compresa prende il nome di UPSTREAM.

Da quando spegniamo il fermentatore, scarichiamo, separiamo biomassa da filtrato e lavoriamo con una o

l’altro… tutte queste fasi prendono il nome di DOWNSTREAM. 15

Quaderno di Alessandro Magro

In un impianto industriale dobbiamo

formulare terreni che possono essere

anche 1000 metri cubi. Ci serve una

zona per stoccare fonti di nutrienti, che

vengono dunque pesati singolarmente

in un tank di preparazione. Dal

serbatoio di preparazione si portano

dunque nell’impianto del fermentatore.

La sterilizzazione del terreno puo

avvenire in questo passaggio oppure