Microbiologia

La conta vitale

Si chiama vitale perché si vanno a contare solamente cellule vive che in quanto tali sono riuscite a formare la colonia visibile. Dopo aver contato il numero di colonie, le si esprimono in unità formanti colonia/mL. Con questo tipo di conta si evidenziano solo le cellule vive in grado di crescere nelle condizioni colturali e nutritive adottate.

Richiede almeno tre giorni di incubazione alla temperatura desiderata, per permettere a tutte le cellule di crescere anche se non trovano le esatte condizioni ideali. Questo perché si deve scegliere un terreno di definiti parametri culturali e quindi magari non si è nel range ottimale di tutti e si deve consentire anche alle cellule che non trovano le condizioni ideali di dare una piccola colonia che poi si andrà a contare.

Quando si fa la conta si può vedere che ci sono magari delle colonie puntiformi immerse nello strato di terreno utilizzato e anche quelle vanno contate. La dimensione di una

Colonia non va ad influire sul numero di microrganismi presenti, se la colonia è piccola vuol dire una cellula vitale era comunque presente nel campione, ma non è riuscita a svilupparsi troppo o per il terreno o per i parametri ambientali utilizzati e quindi la cellula non ha trovato le condizioni per crescere velocemente e quindi riprodursi e formare tante cellule uguali a se stessa. Per questo motivo si deve prolungare il tempo di incubazione delle piastre. Le piastre vengono messe ad incubare capovolte per fare in modo che la condensa che eventualmente si forma, cada sul coperchio e non sulla superficie della piastra dove si ricerca di mantenere separate le varie colonie. Quindi, qualsiasi piastra si prepari, queste vanno sempre messe ad incubare e conservate sempre capovolte. Queste piastre vanno incubate almeno per tre giorni.

LA CONTA TOTALE

Questa conta è più veloce, perché l'analisi viene eseguita nello stesso giorno in cui si ha la matrice da analizzare.

Si usa uno speciale vetrino contenente una camera di conta: reticolo di Burker. Il vetrino portaoggetto è inciso con un reticolo quadrettato di cui è nota l'area di ogni riquadro. Dato che lo spessore tra il reticolo ed il vetrino coprioggetto è noto, è possibile determinare il volume di sospensione batterica contenuta in ogni riquadro. La scelta del riquadro è in funzione della concentrazione cellulare. Basta preparare una diluizione appropriata della matrice da analizzare e poi utilizzare un vetrino contacellule. Un limite di questa conta è che è impossibile distinguere le cellule morte dalle vive e che è impossibile contare microrganismi filamentosi.

Un altro limite di questa conta è quello che si deve utilizzare un obiettivo 40x al microscopio contrasto di fase, quindi si deve avere un ingrandimento massimo di 400 volte e non di 1000. Con questo, i microrganismi molto piccoli a volte non si riescono a

Distinguere bene. Però il vantaggio è che è una conta molto rapida. Perché dopo aver contate il numero di cellule nel quadro che è stato definito, si rapporta il numero di cellule contate al volume del riquadro e da li si risale al volume di cellule presenti per mL, ricordandosi che indipendentemente dal tipo di vetrino e da camera di conta che hanno volume dei riquadri differenti, ci si ricorda che si parla sempre di mm e quindi dopo aver fatto la media delle cellule contate nei riquadri si deve contare per un fattore 1000, per portarlo al cm o al mL.

CONTA DEL NUMERO PIÙ PROBABILE

Con termini molto approssimativi è possibile anche determinare una carica molto bassa di microrganismi all'interno di una matrice, attraverso la determinazione del numero più probabile, dove si inoculano in una serie di provette delle diluizioni molto basse (10^-1 o 10^-2). Con queste diluizioni è possibile, in base alla crescita o meno in un

terreno contenente un indicatore permette di determinare subito dove è cresciuto o meno il microrganismo. Questa conta permette di avere un numero, che poi rapportato ad una tabella già presente nel metodo, permette di dire quante cellule ci sono per mL. In questa conta l'importante è il numero di cellule molto basse che magari non si riescono, né con la conta totale né con la conta vitale, a determinare. METODI DI CONTA INDIRETTI Sono molto utili in laboratorio, soprattutto quando si vuole rapportare la crescita di un microrganismo in condizioni diverse e verificare dove è cresciuto di più, perché magari si vuole avere una maggiore resa cellulare. Valutazione della torbidità Per questo basta avere a disposizione uno spettrofotometro. Di solito si usa uno spettrofotometro a doppio raggio. Si deve valutare l'aumento di torbidità di un brodo culturale correlato all'aumento della crescita. Il terreno di solitoè limpido, anche se un brodo culturale può essere colorato a seconda dei componenti che sono presenti nel terreno, ma è limpido quando non c'è crescita. Quando in un terreno cresce un microrganismo e aumenta il suo numero di cellule, aumenta la torbidità del brodo culturale. Questo aumento di torbidità è collegato direttamente alla crescita. L'aumento di torbidità può essere valutato mediante la misura dell'assorbanza o della densità ottica. Solitamente si misura a 550/600nm, cioè nello spettro del visibile. Se si usa uno spettrofotometro a doppio raggio, prima - se il terreno è colorato - si deve azzerare lo spettrofotometro con il terreno non inoculato per eliminare il terreno di fondo legato al colore del terreno. Poi dalla cuvetta di riferimento si elimina il terreno liquido, si introduce la brodocultura e si legge un valore di assorbanza che è tanto maggiore quanto.

maggiore è la crescita del microrganismo in determinate condizioni. Molti microrganismi, quando crescono in un brodo liquido, a volte possono tendere a crescere sul fondo formando uno strato cellulare sul fondo e lasciando limpido il terreno sovrastante, perché crescono meglio dove c'è meno presenza di ossigeno. In questo caso si deve mescolare prima la brodo-cultura, in modo tale da avere una crescita più omogenea per valutare l'assorbanza. Questo metodo può essere utilizzato anche se c'è bisogno di studiare per molto tempo in laboratorio uno stesso microrganismo e si vogliono avere velocemente i dati di crescita valutando solo l'assorbanza. L'assorbanza è un metodo indiretto, dice se un microrganismo è cresciuto di più o di meno, ma dal valore di assorbanza non si sa quante cellule sono presenti. Però si può fare con un microrganismo se si effettua prima una prova di crescita in diversi tempi,

attraverso per esempio la conta totale o la conta vitale, e per ogni determinazione che si fa ad intervalli di tempo si legge anche la corrispondente densità ottica e quindi si ha una correlazione tra densità ottica e numero di cellule per mL: si fa una taratura mettendo in rapporto la carica microbica determinata sperimentalmente con un certo valore di densità ottica. La retta di taratura vale solo per uno stesso tipo di microrganismo con cui è stata costruita, perché i microrganismi possono essere molto piccoli oppure molto più grandi, e il valore di densità ottica rimane uguale se la torbidità è la stessa, ma il numero di cellule può cambiare. Microrganismi molto piccoli, a parità di valore di assorbanza, possono essere presenti in maggior numero rispetto a microrganismi più grandi che danno lo stesso valore di assorbanza.È un metodo indiretto che viene utilizzato soprattutto per microrganismi filamentosi, per esempio le muffe. Le muffe hanno difficoltà ad essere contate, sia con la conta vitale che con la conta diretta a causa della loro natura filamentosa e per il fatto che crescono sia attraverso l'allungamento delle ife e del micelio vegetativo, sia attraverso la produzione di micelio aereo e di un numero elevato di spore. In molti casi, quindi, quando si vuole valutare se una muffa è cresciuta in un determinato terreno rispetto ad un altro, si può effettuare il peso secco. La muffa cresce di più dove la massa cellulare, determinata come peso secco, è maggiore. Quando la muffa cresce su un terreno solido, il proprio micelio si espande, di colore diverso a seconda del colore delle spore che si formano. Quando si vuole far crescere una muffa in un terreno liquido, si fa crescere in condizioni di agitazione perché la muffa è un microrganismo aerobio e ha bisogno di ossigeno per crescere.105°C deve durare per un periodo di tempo sufficiente a garantire la completa essiccazione della biomassa. Una volta terminata l'essiccazione, si può procedere con la pesatura del piattello contenente la biomassa essiccata. In questo modo si otterrà il peso secco della biomassa.¹ batteri. Per determinare il peso della biomassa, viene utilizzata una particolare bilancia. Il piattello contenente la biomassa viene rimosso dalla stufa a una temperatura di 105°C. Durante l'intervallo di tempo, si osserva che il peso diminuisce gradualmente man mano che l'acqua si allontana. È importante notare che il dato del peso secco può essere fornito solo dopo aver effettuato almeno 2/3 letture del peso costante. Per quanto riguarda la crescita batterica, i batteri si riproducono attraverso la scissione binaria, ovvero una cellula si divide in due. Da una cellula si formano due, da due se ne formano quattro e così via. A intervalli regolari di tempo, si verifica un raddoppio della popolazione iniziale. Grazie a questo processo di sviluppo dei batteri, è possibile effettuare considerazioni matematiche per comprendere quanto tempo di solito impiega una popolazione batterica per raddoppiare, ovvero aumentare il numero di generazioni.ro ha una densità di 1x10^6 cellule/ml, e si sa che la popolazione cellulare raddoppia ogni 30 minuti, possiamo calcolare il tempo necessario per ottenere una determinata densità cellulare. Per fare ciò, possiamo utilizzare la formula della crescita esponenziale delle cellule: N = N0 * 2^(t/tg) Dove: - N è la densità cellulare finale desiderata - N0 è la densità cellulare iniziale - t è il tempo trascorso - tg è il tempo di generazione Ad esempio, se vogliamo ottenere una densità cellulare finale di 1x10^9 cellule/ml, possiamo calcolare il tempo necessario come segue: 1x10^9 = 1x10^6 * 2^(t/30) Dividendo entrambi i membri per 1x10^6, otteniamo: 1000 = 2^(t/30) Applicando il logaritmo alla base 2 ad entrambi i membri, otteniamo: log2(1000) = t/30 t = 30 * log2(1000) t ≈ 30 * 9.97 t ≈ 299.1 minuti Quindi, per ottenere una densità cellulare di 1x10^9 cellule/ml, è necessario incubare la cultura per circa 299.1 minuti.