Psicobiologia - Domande esame

Tecniche di localizzazione di neurotrasmettitori e recettori nel cervello

Immunocitochimica e ibridazione in situ sono due tecniche utilizzate per localizzare neurotrasmettitori e recettori nel tessuto cerebrale.

Nella tecnica dell'immunocitochimica, una fettina di tessuto cerebrale viene esposta a un legante marcato della molecola in esame, chiamato antigene. Questo provoca la produzione di anticorpi specifici per i peptidi cerebrali che agiscono come neurotrasmettitori o recettori. Nella fase 1, vengono iniettati gli anticorpi nel tessuto cerebrale. Nella fase 2, gli anticorpi vengono marcati con un colorante o un elemento radioattivo. Nella fase 3, le fettine di tessuto cerebrale vengono esposte agli anticorpi marcati, che si legano specificamente ai neurotrasmettitori o recettori desiderati.

Nella tecnica dell'ibridazione in situ, vengono creati filamenti ibridi di RNA messaggero (RNAm) complementari alle sequenze di RNAm che dirigono la sintesi della neuroproteina in esame. Nella fase 1, vengono creati i filamenti ibridi di RNAm. Nella fase 2, i filamenti di RNAm ibrido vengono marcati con un colorante o un elemento radioattivo che si lega all'mRNA. Nella fase 3, le fettine di tessuto cerebrale vengono esposte ai filamenti di mRNA marcati, che sono complementari ai neuroni specifici che si desidera studiare.

Le tecniche di ingegneria genetica sono un'altra metodologia utilizzata per studiare la localizzazione di neurotrasmettitori e recettori nel cervello.

IN PSICOBIOLOGIA...in psicobiologia: per studiare il ruolo di un fenotipo comportamentale nel ruolo di determinati geni nell'espressione:

1. knockout genico
2. gene replacement

KNOCKOUT GENICO

Creazione di organismi sprovvisti di un determinato gene

Studio delle anomalie neurali e comportamentali che li caratterizzano

3 fasi nella creazione di un knockout:

1. delezione di un gene in cellule embrionali in coltura mediante rimozione di sequenze di basi da un segmento di cromosoma
2. le cellule modificate vengono trasferite in embrioni in via di sviluppo
3. una volta che gli embrioni si sono sviluppati in organismi adulti, vengono incrociati per produrre prole omozigote per il gene knockout

Cautela nell'interpretazione delle conseguenze sul fenotipo comportamentale:

1. sono polimorfici (influenzati dall'attività di molti geni interagenti)
2. spesso, l'eliminazione di un gene influenza l'espressione di altri geni
3. tendenzialmente,

Il DNA dei controlli differisce da quello dei knockout anche per sequenze dibasi limitrofe al gene knockout. GENE REPLACEMENT: Rimozione di un gene e sostituzione con un altro. Esempio: Rimozione di un gene patologico da una cellula umana e inserzione in un topo → topo transgenico. Esempio: NB si riferisce al (sistema cre/loxp). lox p sono interruttori che inserisco manipolando il paio di basi della sequenza genica così che quando io poi inserisco una sostanza come il tamoxifene, si lega a recettori per estrogeni che sono staticamente localizzati nel sistema genico in maniera che poi siano espressi con la cre ricombinasi che si è svegliata e taglia dove ci sono i loci T. L'optogenetica è la combinazione di metodi di stimolazione ottica e di ingegneria genetica. Esistono in natura proteine canale fotosensibili, cioè proteine sensibili all'attraversamento di un flusso ionico (sensibili alla luce). Tra queste proteine può essere ricordata la channelrhodopsin 2 (ChR2, alga).chlamydomonas) eccitabile (si apre) a determinate lunghezze d'onda attorno a 480 nm (luce blu). L'utilizzo di questa tecnica prevede varie proteine fotosensibili, le quali sono attivabili mediante l'utilizzo di fibre ottiche inserite a livello cerebrale. Ad esempio, se occorre studiare l'attività di neuroni di un'area motoria dei gangli della base, la quale risulta composta da due circuiti principali, uno che stimola il movimento e uno che lo inibisce, attivando l'uno o l'altro con un laser, si induce nel topo la corsa o l'immobilizzazione. Applicando la tecnica ad un modello di topo con Parkinson, è possibile produrre un livello di attività motoria paragonabile a quello di un topo di controllo non affetto dalla malattia. How optogenetics works Prima dell'optogenetica, il controllo rapido dell'attività neuronale era ottenuto attraverso elettrodi, come accadeva per la stimolazione cerebrale profonda in.

Pazienti con malattia di Parkinson. Il problema derivante da tali metodi era relativo alla mancanza di specificità: tutta l'intera regione veniva stimolata anche quando un'area poco estesa avrebbe potuto contenere varie tipologie di cellule, con funzioni differenti se non opposte. La stimolazione optogenetica, proiettando un fascio di luce in un'area cerebrale riesce a stimolare solo le cellule che esprimono la proteina fotosensibile, permettendo una rapida comprensione delle funzioni di neuroni specifici. L'optogenetica non è un rimedio universale per qualunque ostacolo sperimentale nelle neuroscienze, ma è una tecnica rivoluzionaria attraverso la quale è possibile affrontare in modo innovativo studi su depressione, ansia, apprendimento e memoria, sonno, dipendenza. La possibilità di attivare con precisione specifici neuroni e circuiti mediante la luce non solo promuove la comprensione del funzionamento del cervello, ma apre anche nuove

prospettive terapeutiche.

7) PARADIGMI PSICOBIOLOGICI PER LO STUDIO DEL COMPORTAMENTO RESIDENTE ANIMALE AGGRESSIVITÀ:

- INTRUDER PARADIGM (aggressività di tratto, significa che c'è anche una componente genetica alla base dell'aggressività) due topi che combattono per la risorsa che è il territorio. Si misurano:

• N di attacchi
• Latenza all'attacco

Questi studi servono per traslazionalmente cercare casi di espansione patologica e come risolverli.

ANSIA-ESPLORATIVITÀ: OPEN-FIELD TEST le aree centrali sono più esposte e quindi meno preferite dal topo rispetto al contatto con la parete che da un grado di tranquillità all'animale. Ci sono molti parametri dell'animale come questi appena detti che fanno capire se è più esplorativo o più ansioso.

ANSIA- ELEVATED PLUS-MAZE PARADIGM → L'elevated Plus Maze per topi è un test comportamentale ampiamente utilizzato per i roditori ed è stato

validato per valutare gli effetti anti-ansia di agenti farmacologici e ormoni steroidei, e per definire le regioni del cervello e i meccanismi alla base dei comportamenti ansia-correlati. Il plus maze test è stato molto utilizzato per mettere a punto farmaci con proprietà ansiolitiche, in particolare quei farmaci che hanno come bersaglio i recettori A del GABA. Si osserva quanto tempo l'animale trascorre nei due compartimenti (protetto vs aperto), si cumula il tempo speso in queste due aree e si quantificano anche il numero di ingressi in queste due aree. L'efficacia di un farmaco ansiolitico (come le benzodiazepine che agiscono sui recettori a del GABA) è rivelato dal fatto che l'animale incrementa proporzionalmente il tempo speso nelle aree protette e rimane per più tempo nelle braccia protette, se è meno ansioso in quelle aperte). I topi utilizzati in questo test sono gli HAB/LAB: sono ratti creati attraverso accoppiamenti selettivi partendo da un unico

ceppo e ottenendo la possibilità di produrre due linee di high anxiety e low anxiety (accoppiando maschi e femmine molto ansiosi da un lato e maschi e femmine poco ansiosi dall'altro). Confrontando gli HAB con i LAB, dal grafico si evince che per quanto riguarda il numero di ingressi nei bracci aperti, i LAB ne effettuano un numero significativamente maggiore rispetto agli HAB. Un ulteriore evidenza emerge se si osserva il tempo di latenza impiegato dall'animale prima di effettuare la prima esplorazione di un braccio aperto: è significativamente più lungo, in secondi, negli HAB più che nel LAB e anche il tempo speso nei bracci aperti è significativamente inferiore negli ansiosi rispetto ai non ansiosi. In questo test sono state riscontrate due particolarità: - sembra non esserci abituazione alla risposta ansiogenica durante ripetute esposizioni all'EPM; alcuni sperimentatori hanno addirittura riscontrato un aumento della risposta.

ansiogenica durante test ripetuti;- farmaciansiolitici come le benzodiazepine sono inefficaci in animali che hanno già sperimentato l’EPM.
L’EPM, grazie anche alla sua facilità di esecuzione, è a oggi il test comportamentale maggiormente utilizzato dalle industrie farmaceutiche nella produzione di farmaci per il trattamento dell’ansia.
Un test sociale molto rilevante riguarda il paradigma residente-intruso: prevede che nelterritorio controllato da un animale residente venga introdotto un estraneo conspecifico che provocherà uno scontro sociale.
Social interaction test
Un test utile a studiare l'ansia sociale o la anedonia sociale è il social interaction test/social avodiance test. In questo paradigma sperimentale l'animale viene introdotto in una gabbia centrale inizialmente, poi viene aperta una porta che gli consente di esplorare un'area adiacente. In tale area viene collocato un conspecifico e si misura il tempo che

l'animale tende a trascorrere invicinanza del conspecifico e Io si confronta col tempo che l'animale trascorre a distanza, L'obiettivo sperimentale è quello di misurare quanto l'animale tende a preferire il contatto sociale (anche se non direttamente fisico, ma ravvicinato) con un conspecifico oppure ad evitarlo. Un animale sottoposto a stress sociale cronico come al seguito di social defeats tende ad attuare un comportamento evitante dai conspecifici in questo test. ANSIA, COPING STRATEGY SHOCK-PROBE DEFENSIVE-BURYING TEST Aversive stimulus (shock, unpleasant odour, air blast) C'è corrente elettrica in un sondino che se l'animale tocca con il muso la chiude. DEPRESSION, COPING STRATEGY FORCED SWIM TEST si fa notare il tipo in cilindri in modo forzato e si valuta quante volte cerca di appendersi alle pareti per uscire/ quante volte resta passivo. il grado di immobility (behavioral despair) quindi di passività dell'animale. si valuta il

Grado di depressione: tuttavia quando il topo alza la testa per respirare lo fa per necessità e questo non può essere usato come parametro per valutare la depressione. Tuttavia, il forcing test viene usato per testare e valutare nuove terapie per la depressione.

Coping Strategy Tail Suspension Test (depression, coping strategy): si appende il topo per la coda e si valuta quanto il topo cerca di scappare o resta attivo, questo valuta il grado di depressione perché meno si muove più è depresso.

Altri test, test per Anedonia (tendenza di cessare la ricerca attiva di stimoli piacevoli, le forme più studiate sono quella sessuale e alimentare). Come valuto un animale in anedonia? Do la possibilità all'animale di scegliere tra acqua e acqua con zucchero. Un ratto tende a preferire la soluzione zuccherina. Si valuta nel tempo se evolve la preferenza al consumo del test di rubinetto. Da grafico SDI=