Proteomica

Proteomica

Introduzione

La proteomica è una branca delle biotecnologie in cui convergono diverse discipline, fra cui biologia molecolare, biochimica e genetica al fine di studiare la struttura, la funzione e le interazioni delle proteine espresse in una particolare cellula, tessuto o organismo. Il proteoma, ovvero il set di proteine espresse in una cellula, dipende da diversi fattori sia endogeni (proteine espresse specificamente in un determinato tessuto) che esogeni (ambiente, dieta, inquinanti, microbiota, ecc.).

Oltre a ciò, la proteomica studia anche la localizzazione cellulare delle proteine, i livelli di espressione e le loro modificazioni post traduzionali. Tutto partì dal progetto genoma umano, il quale ebbe lo scopo di sequenziare l’intero HPP genoma umano. In seguito al completamento del HGP, venne lanciato il progetto (Human Proteome Project) con lo scopo di mappare il proteoma umano. In particolare, il progetto si focalizza sull’identificazione delle proteine codificate da ciascun cromosoma con differenti livelli di evidenze, PE1 con evidenze dirette a livello della proteina, PE2 con evidenze a livello del trascritto, PE3 sulla base di geni omologhi, PE4 per sequenze codificanti per proteine ma che non sono state identificate (ad esempio individuata una ORF), PE5 per sequenze con funzione incerta. Infine, il progetto studia come cambia il proteoma in funzione di particolari situazioni come ad esempio in caso di malattie. Al 2019 in banca dati erano presenti quasi 20k di proteine previste (somma i tutti i PE), di cui poco meno di 18k PE1, le restanti 2k circa appartengono a PE2, PE3 e PE4.

Human Proteome Map: contiene tutti i dati ottenuti dal progetto proteoma umano relativi a 17 diversi tessuti provenienti da adulti, 7 da tessuti fetali e 6 cellule ematopoietiche. Ha consentito l’identificazione di 30k di proteine partendo da 17k geni, tutti i dati derivano da analisi LC-MS/MS e contengono informazioni su diverse isoforme della stessa proteina espresse in diversi tessuti. Tutti i dati ottenuti vengono immagazzinati in banche dati fra cui UniProtKB che contiene tutte le sequenze identificate finora (una sezione contiene voci revisionate e inserite manualmente, una contiene voci non revisionate inserite automaticamente), PDB contiene informazioni strutturali ottenute da esperimenti NMR, x-ray e cryo-EM.

Cosa cambia con gli aspetti -omici rispetto a prima?

Se prima dell’avvento della proteomica ci si focalizzava solo su una determinata proteina in due situazioni differenti, ora ci si interroga su come cambia l’intero set di proteine (espressione, PTM, localizzazione) in seguito a uno stimolo di interesse o in una cellula (tessuto o organismo) in una situazione patologica rispetto al normale, più in generale in una data condizione rispetto al controllo.

Ricerca di biomarcatori

Un biomarker è una caratteristica misurabile sperimentalmente che dà informazioni legate a un processo, malattia ecc. Spesso sono proteine, in particolare c’è un alto interesse per quelle coinvolte nel cancro, molto importanti per diagnosi e imaging, prognosi e terapie perché le attuali terapie sono molto aspecifiche con effetti collaterali pesanti (danneggiano pesantemente il tessuto tumorale ma anche quello sano). Se si trovano marcatori specifici, questi potrebbero diventare target per nuove terapie. È noto in letteratura che i vari tipi di tumore producono proteine che altri tessuti non producono, queste possono essere localizzate in modo insolito all’interno della cellula, sulla sua superficie ma anche nella matrice extracellulare e in distretti periferici rispetto al tumore stesso. Tra questi sono di particolare interesse le proteine localizzate sulla superficie cellulare o quelle rilasciate all’esterno perché più semplici da trovare ad esempio nei fluidi biologici.

• Discovery near the source: metodo più semplice ma anche più invasivo e difficile ottenere il campione.
• Discovery in peripheral districts: dato che le proteine possono essere rilasciate dalla cellula in diverso modo, come ad esempio secrezione attraverso peptidi segnale, secrezione non canonica (tramite vescicole prive di peptide segnale), rilascio di proteine di membrana in seguito al taglio da parte di proteasi, lisi cellulare, cellule che esprimono una proteasi specifica (il marcatore può essere sia la proteasi sia il prodotto del taglio), è possibile cercare nuovi marcatori nel sangue di pazienti malati. Questo metodo è meno invasivo, è più semplice ottenere i campioni ma presenta alcune problematiche a cui bisogna far fronte.

Avere a disposizione marcatori specifici consente di migliorare nella diagnosi, nella prognosi e nella personalizzazione della terapia. Ad esempio proteine insolite localizzate sulla superficie della cellula possono essere riconosciute da anticorpi specifici che portano molecole fluorescenti (imaging) ma anche radioattive, citotossiche o molecole che reclutano il sistema immunitario. Chiaramente bisogna valutare accuratamente la sensitività e la specificità del marcatore, nel primo caso per evitare falsi negativi, nel secondo per evitare falsi positivi. Il processo prevede la scoperta, la validazione e l’implementazione di metodi per l’identificazione del marcatore, la proteomica si focalizza principalmente sul primo aspetto.

Discovery in peripheral districts – plasma biomarkers

La ricerca di biomarcatori nel plasma sanguigno è un approccio molto diffuso grazie alla facilità di ottenimento dei campioni con metodi non invasivi. Tuttavia, il problema principale è dato dalla sua composizione proteica che rende la scoperta difficoltosa, infatti 22 proteine compongono il 99% delle proteine totali e nel restante 1% sono presenti migliaia di proteine fra cui i potenziali marcatori. In altre parole il proteoma del plasma è altamente sbilanciato con un range dinamico di 10 ordini di grandezza, è come cercare un ago in un pagliaio. Servono quindi delle strategie per “normalizzare” la composizione del proteoma.

Arricchimento selettivo

Può essere fatto attraverso due approcci:

• Selective depletion of most abundant proteins by specific antibodies: utilizzando anticorpi specifici per le proteine più abbondanti è possibile allontanarle, aumentando la concentrazione di quelle presenti in concentrazione minore. Tuttavia, il rischio è quello di perdere anche potenziali marcatori che interagiscono con esse.
• Selective enrichment: ad esempio se si cerca una proteina che sta sulla superficie della cellula, è possibile arricchire il campione con quelle proteine che presentano glicosilazione usando una cromatografia per affinità con lectina. In alternativa posso taggare le proteine con biotina sfruttando la reattività di ammine primarie delle lisine, esse reagiscono con gli esteri pertanto si usa biotina coniugata con NHS, l’NHS viene liberato e la biotina si lega al gruppo amminico. Successivamente si utilizza una cromatografia per affinità con streptavidina.

Proteome equalization

A livello teorico, se si dispone di un’esca specifica per ciascuna proteina è possibile immobilizzare ciascuna di esse in quantità stechiometriche su una resina. In pratica è molto difficile da ottenere si utilizzano quindi gli aptameri, ovvero una libreria di esapeptidi che casualmente creano siti di binding per diverse proteine (64 milioni di possibili aptameri diversi). Chiaramente non tutti gli aptameri legano una proteina o lo fanno in modo stabile, tuttavia questa strategia riduce notevolmente la presenza di proteine più abbondanti e aumenta la presenza di quelle più scarse. Si rischia comunque di perdere qualche possibile marcatore durante lo step di arricchimento.

Immunoproteomica

Il concetto alla base è che se una cellula tumorale produce una proteina che nessun’altra cellula dell’organismo produce, l’organismo può produrre anticorpi specifici per essa. In generale si utilizzano microarray contenenti la gran parte delle proteine del proteoma in esame, si valuta quindi quali anticorpi si legano e le differenze fra il profilo del malato e del sano.

Tecniche

Gel bidimensionali

Con un unico esperimento è possibile separare le componenti di un campione complesso secondo due principi indipendenti fra loro, il pI e il MW. Lavorando con gel ad alta risoluzione è molto difficile che due proteine condividano lo stesso punto isoelettrico e il peso molecolare, per questo motivo ciascuno spot può essere considerato come una singola proteina. I vecchi approcci prevedevano l’analisi con anticorpi specifici per determinare la presenza di una specifica proteina in seguito alla colorazione con Coomassie. Oggi è possibile identificare tutte le proteine presenti abbinando la separazione tramite 2D-gel e la spettrometria di massa (dopo aver tagliato lo spot di interesse). Oggi giorno esiste anche una banca dati in cui depositare i risultati ottenuti, Swiss-2D-PAGE.

È possibile anche investigare le modificazioni post traduzionali presenti nelle proteine contenute nel campione utilizzando specifici protocolli di colorazione:

• Glicoproteine: si utilizzano coloranti fluorescenti che legano specificamente alla componente glucidica. Si trattano le proteine con acido periodico in modo da rompere l’anello glucidico e da formare due gruppi aldeidici che reagiranno con il fluoroforo, quest’ultimo è legato a un gruppo idrazinico che funge da base di Shiff.
• Fosfoproteine: è possibile utilizzare anche coloranti specifici per proteine fosforilate, come ad esempio Pro-Q Diamond il quale lega specificamente residui di Tyr, Ser e Thr fosforilati. Facendo un rapporto con il segnale generato da un colorante “generico” è possibile calcolare il grado di fosforilazione delle proteine presenti.

2D-DIGE (Difference Gel Electrophoresis)

Questo tipo di tecnica consente un’analisi quantitativa dei diversi livelli di espressione delle diverse proteine. Questo consente di eliminare il problema di variabilità fra un gel e l’altro semplicemente mischiando due campioni contenenti coloranti differenti. Ad esempio usando due campioni, uno sano e uno malato colorati in modo differente e mischiati in rapporto 1:1, è possibile vedere quali proteine sono espresse maggiormente o rimangono invariate. Le proteine possono essere colorate sfruttando la reattività di:

• Gruppi amminici: di N-terminali e lisine libere usando un fluoroforo legato all’NHS. Generalmente si usano Cy-5 (rosso) e Cy-3 (verde), che combinati in ugual modo danno una colorazione gialla (varie proporzioni daranno origine a varie sfumature tendenti al verde o al rosso). Una cosa importante da tenere a mente è che alchilare le lisine può cambiare il pI della proteina, si cerca di usare coloranti che non stravolgano le caratteristiche chimico fisiche della proteina.
• Gruppi tiolici ridotti: si utilizza Maleimide, esso lega i residui di cys liberi senza causare una variazione di carica netta. Grazie a questo principio è possibile analizzare lo stato di ossidazione delle cisteine nel campione utilizzando due fluorofori con colorazioni diverse (Dy-680 e Dy-780) e trattando con DTT fra una colorazione e l’altra. Uno dei problemi di questo tipo di colorazione è data dalla possibile presenza di regioni ricche di cys, queste possono generare un segnale molto intenso portando a sovrastimare la proteina in questione.

Vantaggi:

• Economico, semplice e versatile
• High-throughput
• Compatibile con analisi quantitative multiplexing
• Alta risoluzione e riproducibilità

Svantaggi:

• Limitato range di MW e pI
• Necessaria derivatizzazione con fluorofori
• Basso range dinamico, sensibilità e analisi quantitative e di PTM non accurate
• No identificazione delle proteine presenti

Applicazione di 2D-DIGE nella ricerca di biomarcatori di carcinoma epatico nel plasma

Si vogliono identificare proteine diversamente espresse fra soggetto sano e malato. Prima di tutto si utilizza il sistema MARS per eliminare la maggior parte delle proteine maggiormente presenti nel campione (albumina, IgA-G, antitripsina, transferrina ecc), si potrebbero perdere alcuni potenziali marcatori in quanto legati all’albumina. Successivamente si fanno 6 gel in doppio in modo da coprire un range di pH da 3.5 a 11 contenenti 50ug dei due campioni colorati con Cy-3 e Cy-5 (nei 6 gel successivi si invertono i coloranti). Per permettere la riproducibilità fra diversi gel si aggiunge uno standard interno su cui normalizzare i segnali dei due campioni, esso è costituito da 25ug di ciascun campione legato a Cy-2. Si cercano quindi spot tendenti al rosso e al verde, quelli in giallo no perché indicano che la proteina in questione non mostra variazione. Sono state identificate mediante MS/MS 43 proteine che mostrano variazione, ovvero potenziali marcatori biologici che devono essere validati da approcci diretti come western blot, ELISA e immunoistochimica.

Come capire se la differenza della proteina x nei due campioni è significativa o dovuta al caso?

Innanzitutto l’analisi va ripetuta più volte e si fa la media dei valori ottenuti. Si calcola quindi quanto i dati sono distanti dalla media ottenuta (variazione standard, s) e si calcola il t-value, definito come:

differenza fra medie dei campioni = t-value = variabilità osservata fra i campioni

Bisogna a questo punto definire l’ipotesi nulla H₀, vale a dire che non c’è una variazione significativa. Dato un t-value, quale è la probabilità che non ci sia variazione significativa (p-value)? Il p-value viene calcolato in base ai gradi di libertà (n_a + n_b – 2), generalmente si fissa come soglia di accettabilità 0.05 (5% di probabilità che la variazione sia dovuta al caso). Nel caso della ricerca di marcatori si esegue il two-tail t-test, con il quale si accettano i valori all’interno delle due code della gaussiana (proteina x più o meno espressa). Esistono delle tabelle su cui valutare il t-value ottenuto e accettare o meno l’ipotesi in funzione dei gradi di libertà. Il t-value indica il punto sulle ascisse mentre il p-value indica l’area integrata della coda della gaussiana partendo dal t-value.

Protein Microarrays

I microarrays sono stati sviluppati in seguito all’avvento degli approcci -omici, sono sistemi miniaturizzati su cui vengono immobilizzate esche di proteine o DNA. Contengono da centinaia a migliaia di esche per chip che possono interagire con altre proteine. Ne esistono di diverso tipo, per quanto riguarda quelli su cui vengono depositate le proteine possono essere microarrays di anticorpi (questi legheranno i rispettivi antigeni per rilevarne la presenza, studi di protein profiling) o con proteine funzionali (saggi enzimatici, interazione fra proteine e DNA, piccole molecole, lipidi e altre proteine, studi funzionali).

Immobilizzazione

Esistono diversi approcci per la creazione di microarray attraverso legami di tipo:

• Covalente: reattività di ammine primarie (NHS esters) e tioli (maleimide) è possibile legare le proteine covalentemente al supporto in modo irreversibile e versatile. Tuttavia non si ha il controllo sull’orientazione delle proteine in seguito al legame, la reazione chimica può alterare la conformazione della proteina, possibile variabilità fra gli spot, sistema complesso e costoso.
• Non covalente: assorbimento delle proteine, tramite interazioni elettrostatiche e/o idrofobiche, sistema semplice ed economico che non richiede reazioni chimiche. Tuttavia anche in questo caso l’interazione può denaturare le proteine, non si ha il controllo sull’orientazione e potrebbe esserci variabilità fra gli spot.
• Derivatizzazione della proteina: ad esempio biotinilazione con NHS esters o maleimide seguita dal legame sul chip rivestito di streptavidina. Consente un legame molto stabile, tuttavia non consente di avere il controllo sull’orientazione e il legame potrebbe causare la denaturazione della proteina.
• Affinity tags: prevede l’inserzione di specifici tags tramite ingegneria genetica e il legame del tag sul chip. Questo consente di avere il controllo sull’orientazione, non richiede reazioni chimiche e non rischia di denaturare la proteina oltre a ridurre la variabilità fra gli spot.

Tra le affinity tags le più comuni sono:

• His tag: prevede l’inserzione di una coda di 6 His, esse sono in grado di legare ioni metallici come il Ni²⁺. Il chip viene derivatizzato con acido nitrilo triacetico, anch’esso in grado di legare il Ni²⁺. L’eluzione si ottiene tramite lavaggio con imidazolo.
• Arg tag: prevede l’inserzione di una coda di arginine, esse essendo cariche positive possono legare ioni negativi, per l’eluzione si cambia la forza ionica del sistema (verso pH basici).
• Myc tag: prevede l’inserzione del peptide Myc per cui è disponibile un anticorpo molto specifico che viene legato sulla superficie del chip. Per l’eluzione si può usare un agente denaturante o un’alta concentrazione di peptide Myc.
• Flag tag: inserzione di un peptide in grado di legare il calcio, sul chip è presente un anticorpo in grado di legare Flag quando legato al Ca²⁺. Per eluire è sufficiente aggiungere un chelante di ioni positivi.