proteine e enzimi

Le proteine

Proteine globulari

Le proteine globulari hanno una conformazione più complessa rispetto alle proteine fibrose e svolgono funzioni più elevate. Nella loro attività sono dinamiche e non statiche. Esempi di proteine globulari sono gli enzimi e le proteine di trasporto dell'ossigeno, come la mioglobina e l'emoglobina. Le analisi ai raggi X di queste due proteine hanno permesso di comprendere la relazione tra struttura tridimensionale e funzione biologica, e mettere in relazione queste proprietà con alterazioni che sono alla base di molte malattie.

Proteine coniugate

Le proteine vengono divise in semplici e coniugate: le prime danno, per idrolisi completa, soltanto amminoacidi, le seconde, oltre agli amminoacidi, presentano anche un componente diverso detto gruppo prostetico. Le proteine coniugate vengono invece suddivise nei seguenti gruppi:

• Nucleoproteine, se il gruppo prostetico è un acido nucleico;
• Lipoproteine, se il gruppo prostetico è un lipide;
• Glicoproteine, se il gruppo prostetico è un glucide;
• Fosfoproteine, se il gruppo prostetico è l'acido fosforico;
• Cromoproteine, se il gruppo prostetico è una molecola colorata (pigmento);
• Metalloproteine, se il gruppo prostetico è un metallo.

Le cromoproteine possono essere ulteriormente suddivise in porfiriniche e non-porfiriniche, in base alla natura chimica del gruppo prostetico.

Le porfirine

Le porfirine sono una interessante classe di composti, molto importanti dal punto di vista biologico. Sono contraddistinte da un anello costituito a sua volta da quattro anelli pirrolici uniti da quattro gruppi metinici —CH=, in modo da formare un macroanello planare. Tale struttura ciclica si origina per polimerizzazione di quattro molecole di un'unità di base, chiamate porfobilinogeno.

La caratteristica più rilevante delle porfirine è la facilità con cui esse formano dei complessi di coordinazione (chelati) con molti ioni metallici. Al centro dell'anello della porfina si può sistemare, in maniera energicamente molto stabile, un atomo di metallo che forma:

• Due legami covalenti con due atomi di azoto, sostituendo i due atomi di idrogeno
• Due legami di coordinazione con i due atomi di azoto rimanenti

A causa poi del fenomeno della risonanza, i quattro legami sono perfettamente equivalenti e si forma in tal modo un complesso chelato molto stabile.

Le porfirine isolate da prodotti naturali sono molte e differiscono tra di loro sia per i sostituenti sull'anello della porfina, sia per il tipo di metallo al centro della struttura, che può essere un atomo di ferro, magnesio, rame, zinco e altri ancora. Le porfirine sono molto colorate: il colore di ogni composto dipende dai sostituenti che porta e dalla natura dell'atomo centrale di metallo, se è presente.

Il sistema porfirinico è di grande importanza perché costituisce l'unità fondamentale sia del pigmento rosso del sangue, l'emoglobina e la mioglobina, che del pigmento verde delle foglie, la clorofilla.

Protoporfirina IX

Le protoporfirine sono le porfirine più abbondanti e possono presentare 15 forme isomere diverse, di cui però solo la protoporfirina IX esiste in natura. La protoporfirina IX si trova infatti nelle emoglobine, nelle mioglobine, nella maggior parte dei citocromi (proteine dei mitocondri) e in molti enzimi. In tutti questi casi l'atomo metallico coordinato è il ferro. L'insieme protoporfirina-ferro viene detto eme. Eme-proteine sono definite tutte le proteine che hanno l'eme come gruppo prostetico.

Il gruppo eme

Il gruppo eme è un complesso formato da un atomo di ferro bivalente (Fe²⁺) e da una molecola di protoporfirina IX. L'eme costituisce il gruppo prostetico (cioè la parte non proteica) delle cromoproteine respiratorie come l'emoglobina, la mioglobina e i citocromi, alle quali conferisce il colore rosso e la possibilità di funzionare da trasportatori di ossigeno.

L'atomo di ferro all’interno del gruppo l'eme è nello stato di ossidazione ferroso (Fe²⁺). L'emina è invece la forma ossidata dell'eme. Il ferro allo stato di ossidazione 2+ è in grado di formare 6 legami di coordinazione. All’interno del complesso eme il ferro stabilisce: 4 legami con gli atomi di azoto, questi si trovano sullo stesso piano della porfirina, mentre i 2 legami rimanenti sono perpendicolari al piano e possono fissare il ligando.

In mioglobina ed emoglobina il legame 5 si va a formare con un residuo di istidina presente nella catena di una globina. Il legame 6 può invece essere occupato da ossigeno (ossiemoglobina), da altri ligandi come il monossido di carbonio, oppure non essere occupato. In mioglobina ed emoglobina il ferro non subisce cambiamenti nella valenza, rimane sempre allo stato di ossidazione 2+. Nei citocromi invece i legami 5 e 6 si formano con specifici residui amminoacidici e il ferro cambia stato di ossidazione da Ferro 2+ a Ferro 3+.

L'emoglobina

Struttura generale

L’emoglobina è costituita da 4 subunità, ogni subunità presenta un gruppo eme. L'emoglobina ha una massa molare di 64500 g/mol, è una proteina globulare, quindi ha una forma pressoché sferica e un diametro di 5,5 nm. L’emoglobina A è quella tipica degli adulti e contiene due tipi diversi di globine. È formata da: due catene α (costituite ognuna da 141 amminoacidi) e due catene β (costituite ognuna da 146 amminoacidi).

Per quanto riguarda la struttura tridimensionale, le subunità α e β hanno una organizzazione molto simile, pur avendo strutture primarie molto differenti tra loro. Le catene α e β dell'emoglobina contengono alcuni tratti di α-elica separati da ripiegamenti. Le 4 subunità dell'emoglobina formano interazioni molto forti tra loro. Un attento esame della struttura quaternaria dell'emoglobina mostra che, nonostante vi sia scarso contatto diretto tra catene α e tra catene β, vi sono molti punti di contatto tra le catene α e β omologhe (α1 con β1 e α2 con β2). I punti di contatto sono costituiti per la maggior parte dai gruppi R idrofobici di residui amminoacidici.

Sia l’interfaccia tra le subunità α1 e β1, che quella tra le subunità α2 e β2, è costituita da circa 30 residui amminoacidici ed è abbastanza forte. Le interfacce tra α1 e β2 e tra α2 e β1, invece, comprendono circa 20 residui amminoacidici.

Le catene polipeptidiche dell’emoglobina presentano una forma irregolare, per cui le varie coppie non combaciano con precisione. Infatti è presente un canale centrale aperto, una cavità che decorre lungo tutta la molecola e che si può osservare guardando la molecola dall'alto.

Ossigeno e gruppo eme nell’emoglobina

L'ossigeno, essendo poco solubile in acqua, non può essere trasportato a livello dei tessuti nel plasma sanguigno. Per questo è necessario che l'ossigeno si leghi a qualche molecola nel torrente circolatorio. I metalli di transizione, come il ferro e il rame, hanno una forte tendenza a legare l'ossigeno.

Il ferro metallico (stato di ossidazione 0) forma le specie reattive dell’ossigeno (ROS), che sono radicali liberi che possono danneggiare le macromolecole biologiche. Invece, il ferro in forma ionica e precisamente nello stato di ossidazione +2, è meno reattivo del ferro metallico. Quest’ultimo è incorporato nel gruppo eme dell’emoglobina. I gruppi eme sono piuttosto distanziati tra loro, circa 2,5 nm l'uno dall'altro e orientati con differenti angoli. Ciascun gruppo eme è parzialmente nascosto in una tasca contenente gruppi R di amminoacidi idrofobici.

Come detto, l’atomo di ferro all’interno del gruppo eme può formare 6 legami di coordinazione:

• 4 con gli atomi di azoto facenti parte dell'anello dell’eme
• Uno lega un residuo di istidina dell’emoglobina
• Un ultimo è disponibile per legare una molecola di ossigeno

Eritrociti

Nel corpo di un uomo adulto sono contenuti 5/6 litri di sangue, circa un terzo del volume ematico è costituito da eritrociti che sono sospesi nel plasma sanguigno. I globuli rossi (o eritrociti) contengono l'emoglobina e quindi trasportano e rilasciano l'ossigeno, in particolare il sangue trasporta ogni giorno circa 600 litri di ossigeno dai polmoni ai tessuti periferici. Gli eritrociti normali nell'uomo hanno forma di disco biconcavo e il loro diametro va dai 6 ai 9 micron. Inoltre queste cellule del sangue non possiedono nucleo, mitocondrio e organelli citoplasmatici.

I globuli rossi derivano da cellule staminali chiamate emocitoblasti. Queste cellule precursori, durante il processo di maturazione, perdono i loro organelli intracellulari e formano grandi quantità di emoglobina. Non avendo il nucleo, i globuli rossi non possono replicarsi e sopravvivono per circa 120 giorni.

L'emoglobina presente in 100 ml di sangue può legare in totale circa 20 ml di ossigeno gassoso. Nel sangue arterioso l'emoglobina è satura per circa il 98% di ossigeno, mentre in quello venoso l’emoglobina è saturata in media per il 64%. Quindi il sangue, passando attraverso un tessuto vi lascia circa un terzo dell'ossigeno che trasporta (corrispondente a circa 6,5 ml di gas ossigeno ogni 100 ml alla pressione atmosferica e alla temperatura corporea).

La mioglobina

Struttura generale

La mioglobina è una emoproteina respiratoria presente nei muscoli dei Vertebrati e degli Invertebrati. È una proteina globulare relativamente piccola, consiste di una singola catena polipeptidica formata da 153 amminoacidi (ha quindi un peso molecolare di circa 17.000 uma) e contiene un gruppo eme. La catena polipeptidica consiste per la maggior parte (circa 75%) di segmenti ad α-elica. L'intera catena amminoacidica è disposta in maniera complessa e irregolare a formare un prisma triangolare, piuttosto appiattito. Il gruppo eme è posizionato quasi sulla superficie della molecola, in una tasca formata dal ripiegamento della catena polipeptidica. La sua struttura è analoga a quella di una micella di sapone: l'interno della molecola è interamente occupato da catene laterali amminoacidiche non polari (con l'esclusione di uno o due residui polari con funzioni speciali, come l'istidina che lega il ferro dell'eme); le catene laterali polari si trovano prevalentemente in superficie.

Ruolo della mioglobina

Dopo la sua scoperta, è stato ritenuto che la funzione primaria della mioglobina fosse di servire da riserva intracellulare di ossigeno, alla quale l'organismo attingerebbe quando il consumo temporaneo eccede l'apporto esterno. In tempi più recenti è stato dimostrato che la mioglobina, come l'emoglobina, agisce come un trasportatore di ossigeno e contribuisce al flusso di questo gas verso l'interno delle cellule di molti muscoli che, come il cuore, vanno incontro a prolungate e ripetute contrazioni. La differenza essenziale fra mioglobina ed emoglobina, come trasportatori di ossigeno, sta nel fatto che, mentre il movimento dell'emoglobina rappresenta un trasporto di massa mantenuto dall'azione pompante del cuore, quello della mioglobina dipende da un processo molecolare: la diffusione. Inoltre la mioglobina, a causa della sua alta affinità per l'ossigeno, funziona in una regione di pressioni di ossigeno più bassa di quella dell'emoglobina, iniziando laddove l'emoglobina finisce.

Si conclude infine ricordando che il contenuto di mioglobina dei muscoli aumenta con l'età e con l'uso a cui è sottoposto il muscolo stesso.

Origine dell’emoglobina e della mioglobina

Dai dati strutturali di mioglobina ed emoglobina emerge un principio comune: sembra molto probabile che le due proteine discendano da una proteina comune capace di legare l'ossigeno che potrebbe aver posseduto una singola catena polipeptidica. Poi, ad un certo punto dell'evoluzione della specie, il gene che codificava questa proteina ancestrale potrebbe aver subito una duplicazione e queste due coppie di geni avrebbero infine subito mutazioni in modo indipendente. Cosicché uno di essi avrebbe gradualmente codificato la mioglobina adatta per conservare l'ossigeno e l'altro avrebbe subito una diversa serie di mutazioni per codificare da ultimo le catene α e β dell'emoglobina, adatte al trasporto dell'ossigeno nelle cellule del sangue.

Curve di saturazione da ossigeno

L’immagine illustra le curve di saturazione da ossigeno di mioglobina ed emoglobina, espressioni grafiche della percentuale dei siti leganti ossigeno occupati, quando soluzioni di queste due proteine si trovano in equilibrio con differenti pressioni parziali di ossigeno in fase gassosa.

• In ascisse (x) è riportata la pressione parziale di ossigeno (pO₂), ovvero la sua concentrazione
• In ordinata (y) è rappresentata la percentuale dei siti di legame saturati

Prima di tutto si nota che la mioglobina ha un’affinità per l'ossigeno molto alta. Ad una pressione di soli 2 mmHg è già saturata di ossigeno per il 50%, mentre ad una pressione di 20 mmHg la percentuale dei siti saturati è maggiore del 95%. La curva di saturazione della mioglobina è una curva iperbolica, la stessa curva che rappresenta un semplice equilibrio chimico.

L’ossigeno si lega all’emoglobina più debolmente che alla mioglobina, e infatti la curva di saturazione dell'emoglobina è sigmoide (forma a s). Ciò indica che l'affinità dell'emoglobina nel legare la prima molecola di ossigeno alla pressione di 10 mmHg è relativamente molto bassa (illustrata dalla parte inferiore della s), mentre le successive molecole di ossigeno si legano con un’affinità molto più alta (parte della curva a s che sale a picco). Infatti la prima subunità eme che lega una molecola di ossigeno, comunica questa informazione alle subunità rimanenti che rispondono aumentando in grande misura la loro affinità per l'ossigeno (l’aumento di affinità per l’ossigeno in seguito al primo legame è di circa 500 volte). E, analogamente, il distacco dell’ossigeno da uno dei gruppi eme facilita il distacco dell’ossigeno dagli altri tre. Questa comunicazione tra le quattro catene eme dell'emoglobina è il risultato di interazioni cooperative tra le subunità.

Poiché il legame di una molecola di ossigeno aumenta la probabilità che altre molecole di ossigeno vengano legate alle rimanenti subunità si dice che l'emoglobina ha una cooperatività positiva.

Cooperatività positiva e negativa

Il legame cooperativo richiede che la proteina abbia più di un sito di legame, dal momento che esso dipende proprio dall'interazione che viene a crearsi tra questi siti. Il legame cooperativo fa variare l'affinità della proteina per il ligando in base alla quantità di ligando già legata. Si parla quindi di:

• Cooperatività positiva: se il legame del ligando al primo sito aumenta l'affinità degli altri siti per le altre molecole di ligando. La curva di saturazione caratteristica dei legami cooperativi positivi è sigmoide, come quella dell'emoglobina per l'ossigeno.
• Cooperatività negativa: se il legame di una molecola ligando diminuisce la probabilità che altre molecole di ligando vengono legate.

La mioglobina ha invece un solo gruppo eme e può quindi legare un’unica molecola di ossigeno, non ha legame cooperativo e la sua curva di saturazione è iperbolica.

Quindi, perché emoglobina e non mioglobina?

Nei polmoni, dove la pressione parziale dell'ossigeno è di circa 100 mmHg, l’emoglobina risulta quasi totalmente saturata, e circa il 96% dei siti di legame con l’ossigeno sono occupati. Quando l’emoglobina raggiunge i tessuti e rilascia l’ossigeno, il livello di saturazione scende. In particolare, nei tessuti a riposo (pressione parziale dell’ossigeno ≈40 mmHg) la saturazione scende fino a circa il 75%. Mentre durante un’intensa attività fisica, la concentrazione di ossigeno nelle cellule dei muscoli sotto sforzo può arrivare fino a 20 mmHg e la saturazione dell’emoglobina a circa il 30%.

Quando il sangue passa attraverso i capillari muscolari l'ossigeno viene rilasciato dall'emoglobina dei globuli rossi al plasma sanguigno, e da questo alle cellule muscolari. Il rilascio dell’ossigeno avviene in modo cooperativo e favorisce una completa distribuzione ai tessuti. Quando il sangue ritorna ai polmoni dove la pressione minima parziale è molto più alta, l’emoglobina lega rapidamente ossigeno fino a quando è di nuovo satura al 96%.

Invece, dalla curva di saturazione da ossigeno della mioglobina, vediamo che solo 7% dell'ossigeno legato può essere rilasciato quando la mioglobina passa da pressioni parziali di 100 mmHg (pressione nei polmoni) a 20 mmHg (pressione nel muscolo sotto sforzo). Quindi la mioglobina non è adatta a trasportare l’ossigeno dai polmoni ai tessuti in quanto ha un’affinità molto più alta per l'ossigeno e ne rilascerebbe molto poco alle pressioni parziali fisiologiche che si hanno nei muscoli o negli altri tessuti. La vera funzione biologica della mioglobina all'interno delle cellule muscolari è di legare e conservare ossigeno e renderlo disponibile ai mitocondri, sede del metabolismo aerobico.

Riassumendo, l’emoglobina possiede una composizione particolare che la rende la molecola perfetta per il trasporto di ossigeno nei tessuti.