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Equazione di Michaelis-Menten
TOT TPartendo da qui: k ([E ] - [ES]) [S] = k [ES] + k [ES]1 T 2 -1Ricaviamo [ES]: k [E ] [S] – k [ES] [S] = (k + k ) [ES]1 T 1 -1 2Aggiungendo (k1 [ES] [S]) e semplificando: k [E ] [S] = [ES] (k [S] + k + k )1 T 1 -1 2Risolvendo l’equazione: [ES]= k [E ] [S]1 Tk [S] + k + k1 -1 2Si può ulteriormente semplificare: [ES] = [E ] [S]T[S] + (k + k )/k-1 2 1Il termine (k + k )/k è la Km. Quindi l’equazione si può scrivere:-1 2 1 [ES] = [E ] [S]TKm +V si può esprimere nei termini di [ES] V = K2 [E ] [S]0 [S] 0 TKm + [S]La velocità di massima viene raggiunta a saturazione, quindi [ES] diventa uguale a [E ] e VT max(definita come k [E ]). L’equazione di Michaelis-Menten è quindi l’equazione della velocità di una2 Treazione a singolo substrato catalizzata da un enzima. È la relazione tra V , V e [S].0 maxImplicazioni dell’equazione:• Quando la [S] è bassa, la K >> [S], quindi la [S] a
denominatore si può trascurare.avereun’accurata determinazione di V in funzione di [S].maxConsente una estrapolazione della K e della V più accurata. A bassi valori di [S] si hanno elevatem maxvariazioni di V . Questo tipo di linearizzazione è utile nello studio degli inibitori enzimatici.
0Riassumendo:L’equazione di M-M consente di ricavare dei parametri cinetici facilmente misurabili checaratterizzano un enzima nei confronti di un dato substrato. L’equazione si basa su diverseassunzioni ovvero che la reazione è ad un solo substrato, la velocità della reazione è quella iniziale(quando si è formato poco prodotto), la concentrazione del complesso enzima-substrato è costante(stato stazionario) e che la concentrazione del substrato è molto più grande di quella dell’enzima.
Unità enzimatica: quantità di enzima che catalizza la formazione di una micromole di prodotto inun minuto;
Gli enzimi sono classificati in base al tipo
di reazione che catalizzano. In ogni classe sono state individuate delle sottoclassi e delle sotto-sottoclassi che identificano la reazione catalizzata. Ad ogni enzima corrisponde un numero di classificazione a quattro cifre ed un nome sistematico. I nomi comuni degli enzimi derivano dal substrato che utilizzano e da una o più parole che descrivono l'attività svolta con il suffisso "asi": DNA polimerasi, idrolasi, fosfatasi, chinasi. Dopodiché l'enzima viene individuato da una classificazione a 4 cifre. Tipi di CATALISI: - Catalisi acido-base generale: si ha il trasferimento di protoni. Intervengono le catene laterali di His, Asp, Glu, Arg, Lys, Ser che possono comportarsi, a seconda delle condizioni, sia da donatori che da accettori di protoni. Nel trasferimento si formano intermedi instabili carichi che possono essere stabilizzati mediante trasferimento di un protone per formare specie che si convertono nei prodotti più facilmente.protoni sono trasferiti tra un enzima e un substrato o un intermedio. Il trasferimento di protoni è mediato da acidi e basi deboli diversi dall'acqua;
- Catalisi covalente: si forma un legame covalente transitorio tra l'enzima e il substrato. Avviene la formazione di un intermedio covalente. Ad esempio, le catene laterali amminoacidiche del sito attivo forniscono in genere centri nucleofili che subiscono modificazioni covalenti transitorie;
- Catalisi con ioni metallici (cofattori): i metalli possono agire come centri elettrofili; mediarereazioni di ossido-riduzione; legare il substrato orientandolo correttamente e aumentando l'energia di legame; stabilizzare o schermare cariche di segno opposto;
Un esempio di meccanismo catalitico è la rottura idrolitica di un legame peptidico da parte della chimotripsina. La chimotripsina pancreatica è una peptidasi (o proteasi), cioè un enzima che catalizza la rottura idrolitica dei legami peptidici.
È un esempio sia di catalisi acido-base che di catalisi covalente. È specifica per i legami peptidici adiacenti a residui aminoacidici aromatici (Trp, Tyr, Phe).
Effetto del pH sull'attività enzimatica:
Il riconoscimento enzima-substrato e le risposte catalitiche che ne derivano dipendono largamente dal pH. Tutti gli enzimi hanno un pH ottimale: gli enzimi in genere sono attivi solo entro un limitato intervallo di pH ed hanno un valore di pH ottimale caratteristico, che spesso riflette il loro ambiente fisiologico. A valori più bassi o più alti l'attività enzimatica tende a diminuire. Gli effetti del pH possono essere reversibili o irreversibili. I cambiamenti di pH influiscono su: stato di ionizzazione dell'enzima e/o del substrato, stabilità e solubilità dell'enzima, velocità della reazione se partecipano +ioni H.
Effetto della temperatura sull'attività enzimatica:
Anche la velocità delle
Le reazioni catalizzate da enzimi aumentano con l'aumentare della temperatura. In generale, la velocità di una reazione catalizzata da un enzima raddoppia per ogni aumento di 10°C. La velocità delle reazioni catalizzate da enzimi aumenta con l'aumentare della temperatura fino a raggiungere un massimo in corrispondenza di una certa temperatura definita "ottimale". Al di sopra di questo valore (50/60°C) si ha perdita di attività per denaturazione termica. Non tutti gli enzimi sono ugualmente sensibili alla temperatura.
Principali gruppi coinvolti nelle reazioni catalizzate da enzimi:
- Un nucleofilo prende parte ad una reazione donando un doppietto elettronico ad un'altra specie (a sua volta elettrofila);
- Un elettrofilo prende parte ad una reazione accettando un doppietto elettronico da un'altra specie (a sua volta nucleofila);
INIBIZIONE ENZIMATICA
Gli inibitori sono composti in grado di alterare la cinetica della reazione enzimatica.
Rallentandola obloccandola. Gli inibitori enzimatici interagiscono reversibilmente o irreversibilmente con un enzima alterandone i valori di K e/o di Vmax.
Esistono quindi 2 principali tipi di inibitori:
- Inibitori Reversibili: reagiscono con l'enzima mediante interazioni deboli, sono inibitori competitivi, incompetitivi e misti (o non competitivi);
- Inibitori Irreversibili: interagiscono con l'enzima instaurando legami molto stabili, sono reagenti gruppo specifici, inibitori suicidi e analoghi dello stato di transizione;
Inibitori Reversibili
- Inibitori Competitivi: Sono analoghi strutturali del substrato e competono per lo stesso sito di legame sull'enzima. L'inibitore occupa il sito attivo impedendo il legame con l'enzima. Molti sono strutturalmente simili al substrato e possono formare complessi con l'enzima stesso, senza catalisi. Questi inibitori aumentano la K apparente. A concentrazioni di [S] molto elevate l'inibitore non
influenza la Vmax della reazione;
- Inibitori Incompetitivi: Gli inibitori si legano ad un sito distinto da quello del substrato, ovvero al complesso ES, non all'enzima libero. Non si legano al sito in cui si lega S. L'inibitore competitivo diminuisce la Vmax e la Km appartente ha un valore più basso di quello normale. L'inibizione non può essere contrastata aumentando [S] poiché l'enzima è inattivo quando l'inibitore è legato, ma questo non compete con il substrato. L'inibitore infatti va a rimuovere una frazione della molecola di enzima disponibile, quindi solo ES viene rimosso dalla reazione. L'inibitore influenza la funzione catalitica ma non il legame del substrato;
- Inibitori Misti (non competitivi): Non si legano al sito in cui si lega S, bensì ad un diverso sito attivo. Può comunque legarsi sia a E, sia a ES. L'inibizione non può essere contrastata aumentando [S].
L'inibitore misto modifica i valori di K, la quale può aumentare o diminuire a seconda della forma dell'enzima, e la V, la quale è influenzata al massimo per via dell'inattivazione di una parte dell'enzima;
Inibitori Irreversibili:
- Reagenti gruppo specifici (alterano amminoacidi del sito attivo essenziali per la catalisi). Ad esempio, l'inibizione irreversibile della chimotripsina avviene con il diisopropilfuorofosfato (DIFP) che modifica la serina195 del sito attivo della chimotripsina, impedendo così la catalisi. Spesso questi inibitori sono utilizzati per capire il meccanismo catalitico di un enzima sconosciuto;
- Inibitori suicidi (progettazione razionale di farmaci): sono relativamente stabili fino al legame con il sito attivo. Questi, invece di portare alla formazione del normale prodotto, formano un composto molto reattivo che si combina irreversibilmente con l'enzima;
- Analoghi dello stato di transizione: formano complessi
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