Proteine ed enzimi - Biochimica

Amminoacidi

Sono le unità di base delle proteine. Le proteine sono polimeri di AA in cui ogni residuo amminoacidico è unito a quello vicino da un legame covalente. Il primo AA scoperto fu l'asparagina, mentre l'ultimo è stata la treonina.

Struttura di un α-amminoacido

Tutti i 20 amminoacidi presenti nelle proteine sono α-amminoacidi. Gli AA standard condividono una struttura comune (gruppo carbossilico + gruppo amminico legati ad un carbonio α) ma differiscono a livello della catena laterale R, sia di dimensione che di carica. Ad ogni AA presente nelle proteine sono state assegnate 3 lettere che ne identificano il nome. In tutti gli AA (tranne la glicina) il carbonio alfa è legato a tutti gruppi diversi, perciò si tratta di un centro chirale. Per ogni AA sono disponibili due stereoisomeri appartenenti alla classe degli enantiomeri perché l'uno è l'immagine speculare dell'altro (non sovrapponibili).

La configurazione assoluta per gli AA semplici (come per gli zuccheri) stabilisce con il sistema D, L (Fisher). Questa si basa sulla configurazione assoluta dello zucchero a tre atomi di carbonio gliceraldeide. Tutti gli stereoisomeri con configurazione simile alla L-gliceraldeide sono designati con la lettera L; i gruppi simili alla D-gliceraldeide sono indicati con D. Nella conversione di Fisher, D ed L indicano solo la configurazione assoluta dei 4 sostituenti intorno al carbonio chirale e non informa sulle proprietà della molecola.

ES. I gruppi funzionali della L-alanina vengono appaiati con la L-gliceraldeide in quanto il gruppo carbossilico della L-alanina occupa la stessa posizione intorno al carbonio chirale del gruppo aldeidico della L-gliceraldeide.

Quasi tutti i composti biologici con un centro chirale, in natura, sono presenti solo in una forma stereoisomerica. I residui degli AA nelle molecole sono tutti stereoisomeri L. Quelli della serie D sono presenti solo in piccoli peptidi. Questo perché i siti attivi degli enzimi sono asimmetrici e le reazioni che catalizzano sono stereospecifiche.

Curva di titolazione di un aminoacido

I gruppi ammidici e carbossilici, con alcune catene R ionizzabili, si comportano da acidi e basi deboli. Un AA con gruppo R ionizzabile, in soluzione acquosa a pH neutro si trova sotto forma di zwitterione (ione dipolare). I composti di questo tipo sono detti anfoterici. La titolazione acido-base consiste nella graduale aggiunta o rimozione di protoni a gruppi funzionali ionizzabili.

• Misura quantitativa dei valori di pK dei gruppi ionizzabili. Il pK di un gruppo funzionale è fortemente influenzato dal suo intorno chimico;
• Relazione tra la carica netta e il pH della soluzione;

Gli AA con un solo gruppo α-amminico, uno α-carbossilico e un gruppo R non ionizzabile hanno una curva di titolazione simile a quella della glicina (due fasi), con valori simili di pK. Gli AA con gruppo R ionizzabile, invece, hanno curve più complesse (tre fasi). La presenza di una carica positiva in un aminoacido facilita la perdita del protone del gruppo carbossilico, perché crea una interazione tra 2 cariche opposte.

Classificazione degli amminoacidi

Gli AA si possono raggruppare in 5 classi, sulla base delle proprietà chimiche delle catene laterali R, nello specifico in base alla loro polarità, ovvero la tendenza a interagire con l'acqua a pH fisiologico (~7.0).

Amminoacidi alifatici non polari

I gruppi R sono non polari, quindi idrofobici. Sono importanti nel promuovere interazioni idrofobiche all'interno delle strutture proteiche. Appartengono a questa categoria Valina, Alanina, Isoleucina, Leucina, Metionina, Glicina e Prolina. Le prime 4 tendono a raggrupparsi all'interno delle proteine e stabilizzano la struttura tramite interazioni idrofobiche. La Glicina ha la struttura più semplice, ha impedimento sterico minimo della sua catena laterale che impartisce flessibilità alla struttura proteica senza però formare interazioni idrofobiche. La Prolina ha una struttura ciclica e un gruppo amminico secondario (imminico), che conferisce una conformazione molto rigida che riduce la flessibilità della catena peptidica. La Metionina contiene nella catena laterale un atomo di zolfo legato ad un gruppo metile.

Amminoacidi aromatici

Sono Fenilalanina, Tirosina e Triptofano. Hanno catene laterali aromatiche e sono quindi relativamente non polari (idrofobiche), e tutti e 3 possono intervenire nelle interazioni idrofobiche. Tirosina e Triptofano sono più polari della fenilalanina per la presenza del gruppo ossidrilico nella Tirosina (che forma legami H) e di un atomo di azoto nell'anello del Triptofano. Gli aminoacidi aromatici sono responsabili dell'assorbimento negli UV delle proteine, in particolare assorbono a 280 nm.

Legge di Lambert-Beer

A = εcdλ Gli spettri di assorbimento sono misurati mediante spettrofotometri. Molte biomolecole assorbono la luce ad una caratteristica lunghezza d'onda. La misura di assorbimento è utilizzata per identificare e valutare la concentrazione delle molecole in soluzione. In questa legge si mettono in relazione l'intensità della luce incidente con l'intensità della luce trasmessa. La legge assume che la luce incidente sia parallela e monocromatica, e che le molecole di soluto e solvente siano orientate in modo casuale. A sta per assorbanza. L'assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione di soluto.

Le basi azotate hanno, invece, un massimo di assorbimento a 260 nm. Di conseguenza, spesso si utilizza il rapporto A260/A280 nm per valutare la purezza del DNA: se è compreso tra 1,8 e 2,0 il DNA è puro; se è minore, ad esempio 1, vuol dire che ci sono molte proteine che assorbono a 280 nm, quindi il campione non è puro.

Amminoacidi polari ma non carichi

I gruppi R sono molto più solubili in acqua dei non polari perché contengono gruppi funzionali che formano legami a H con l'acqua. Questi sono: Serina, Cisteina, Asparagina, Glutammina e Treonina. La polarità di Serina e Treonina è dovuta al gruppo ossidrilico, mentre quella di Asparagina e Glutammina è dovuta ai gruppi ammidici. La cisteina invece ha una polarità modesta, in quanto è un acido debole e può formare legami H deboli con ossigeno e azoto. Inoltre, la cisteina è facilmente ossidabile e forma, mediante un legame covalente, un dimero chiamato Cistina, dove i due monomeri sono uniti da un ponte disolfuro. Questi residui sono idrofobici e i ponti vanno a stabilizzare la struttura della proteina. I ponti disolfuro sono l'unico altro legame covalente esistente nelle proteine, oltre al legame peptidico. Asparagina e Glutammina sono rispettivamente le ammidi di altri due AA quali l'aspartato e il glutammato.

Amminoacidi polari carichi positivamente (basici)

I gruppi R più idrofilici sono quelli che contengono cariche nette. Quelli con carica netta positiva sono: lisina, arginina e istidina. La Lisina è l'unico AA ad avere una catena laterale ionizzabile con un pKa vicino alla neutralità (6.0), quindi può anche essere quasi priva di carica. Gli enzimi che possiedono residui di His facilitano la reazione in quanto i residui fungono da donatori o accettori di protoni.

Amminoacidi polari carichi negativamente (acidi)

Presentano carica negativa netta e sono l'aspartato e il glutammato, ognuno dei quali ha un secondo gruppo carbossilico.

Gruppi non comuni

Le proteine possono anche contenere residui amminoacidici formati per modificazione chimica, ma già incorporati nel polipeptide. Ad esempio, nel collagene si trova la 4-idrossiprolina (derivata dalla prolina tramite una reazione catalizzata dalla propil-idrossilasi) e la 5-idrossilisina (derivata dalla lisina). La reazione per la prolina può avvenire solo in presenza di acido ascorbico (vitamina C) che impedisce l'ossidazione del Fe²⁺ (lo scorbuto è una malattia che colpisce i tessuti connettivi ricchi di collagene dovuta alla carenza di vitamina C).

Alcuni amminoacidi e i loro derivati fungono da ormoni e molecole regolatrici. Ad esempio, l'istamina deriva dall'istidina per decarbossilazione. A volte i gruppi laterali degli aminoacidi reagiscono per formare altri legami covalenti. Ad esempio, la desmosina è una componente dell'elastina che conferisce elasticità al tessuto connettivo (lo stesso in cui è presente abbondantemente il collagene) ed è formata dalla condensazione di 4 residui di lisina. Esistono tanti altri amminoacidi che non fanno però parte delle proteine, come l'ornitina che è un intermedio nella biosintesi dell'arginina e nel ciclo dell'urea.

Il legame peptidico

Dalla condensazione di due amminoacidi si ottiene la formazione del legame peptidico: si tratta di una reazione di condensazione con eliminazione di una molecola di H₂O dal gruppo α-carbossilico di un AA e dal gruppo α-amminico dell'altro. Due molecole di aminoacidi possono unirsi covalentemente formando un legame amidico, chiamato legame peptidico. A pH fisiologico la reazione avviene molto lentamente. La formazione biologica del legame peptidico è mediata da enzimi e richiede la formazione di un intermedio attivato. L'idrolisi del legame peptidico è una reazione esoergonica, ma avviene molto lentamente per l'elevata energia di attivazione. Di conseguenza, i legami peptidici sono abbastanza stabili.

Conseguenze della risonanza del legame peptidico

• Parziale carattere di doppio legame (il legame amidico C-N è più corto di un legame C-N in un'ammina e gli atomi C-N sono complanari);
• Limitata rotazione attorno al legame C-N e ridotto grado di libertà di rotazione dello scheletro peptidico;
• I 6 atomi coinvolti nel legame peptidico tendono ad essere complanari;
• Gli atomi C_α sono disposti in trans;

Peptidi e proteine

Sono polimeri lineari di amminoacidi. In un peptide, i residui amminoacidici alle estremità della catena polipeptidica hanno un gruppo aminico libero, residuo N-terminale, e un gruppo carbossilico libero, residuo C-terminale. La dimensione e la composizione di un polipeptide sono teoricamente illimitate. Questa enorme varietà potenziale è limitata nelle cellule da:

• Efficienza nel mantenere l'informazione che porta alla sintesi proteica;
• Capacità del polipeptide di ripiegarsi per dare origine a una struttura funzionante in tempi brevi;

Le catene polipeptidiche sono sintetizzate sui ribosomi attraverso un processo nel quale l'assemblaggio degli aminoacidi in sequenze precise è dettato dall'RNA messaggero, tramite le triplette del codice genetico. La direzione di sintesi è quella che va dall'N-terminale al C-terminale, per cui il primo aminoacido di una proteina ha un N-terminale libero e l'ultimo un C-terminale libero (questa direzione corrisponde alla direzione 5'-3' dell'mRNA).

Nomenclatura dei peptidi

• Oligopeptide: è costituito da pochi amminoacidi (da 2 a 20);
• Polipeptide: è costituito da poche decine di amminoacidi (da 20 a 100). Dato che il peso molecolare "medio" di un amminoacido è circa 100, un polipeptide ha un peso molecolare inferiore a 10.000 Da o 10 kDa;
• Proteina: è costituita in genere da più di 100 amminoacidi. Le proteine sotto i 25 kDa (circa 250 amminoacidi) sono considerate proteine "piccole", le proteine sopra i 100 kDa (circa 1000 amminoacidi) sono considerate "grandi";

ATTENZIONE! I termini polipeptide e proteina sono a volte usati come sinonimi.

Funzioni delle proteine

• Catalizzano le reazioni biologiche → Enzimi;
• Regolano l'attività di altre molecole biologiche → Proteine di regolazione;
• Ruolo biologico attivo nelle funzioni di difesa e protezione → anticorpi;
• Costituiscono e mantengono le strutture biologiche conferendo resistenza e protezione alle cellule e ai tessuti → Proteine Strutturali;
• Forniscono una riserva di nutrienti essenziali come l'azoto (ovoalbumina, caseina) o il ferro (ferritina) → proteine di riserva;
• Trasportano specifiche sostanze da un luogo all'altro di una cellula o organismo → proteine di trasporto (emoglobina);
• Proteine di segnalazione (ormoni e recettori). Trasmettono segnali da una cellula all'altra;

Proteine

In genere vengono definiti 4 livelli di struttura delle proteine. Tutti i legami covalenti tra i vari AA in una proteina costituiscono la struttura primaria. La struttura secondaria definisce strutture ricorrenti di piccole sequenze amminoacidiche. La struttura terziaria descrive gli aspetti tridimensionali di un polipeptide. La struttura quaternaria definisce una proteina con due o più subunità polipeptidiche.

Struttura primaria delle proteine

È definita come la sequenza degli amminoacidi, ossia tutti i legami covalenti. La sequenza di una proteina è geneticamente determinata. Ogni tipo di proteina ha una sua caratteristica composizione amminoacidica e una sequenza definita. Dalla sequenza amminoacidica dipende la struttura tridimensionale della proteina e quindi la sua funzione. Proteine con funzioni diverse hanno sequenze diverse. Proteine omologhe hanno sequenze simili e svolgono la stessa funzione in specie diverse. Modificazioni (mutazioni) nella struttura primaria determinano alterazioni (anche perdita) della funzione biologica (malattie genetiche). Migliaia di malattie genetiche sono dovute all'alterazione della sequenza primaria, dovute alla delezione di uno o più AA.

Il 20/30% delle proteine umane sono polimorfiche ovvero che mostrano alcune piccole variazioni fra vari soggetti. Molte di queste variazioni non hanno effetto sulla funzione. In alcune regioni la sequenza amminoacidica può variare molto senza influenzare ma la maggior parte contiene AA essenziali per la funzione della proteina, sequenze che devono essere conservate. Queste frazioni essenziali possono variare da proteina a proteina.

Dalla struttura primaria possiamo ricavare informazioni quali:

• Omologie strutturali: ricercando somiglianze con sequenze note, si possono ricavare alcune informazioni utili sulla struttura tridimensionale e la funzione di una proteina ignota;
• Sequenze consenso di tipo funzionale, che servono come segnali per:
• Segnali di localizzazione intracellulare o secrezione;
• Siti di modificazioni chimiche (siti di attacco per gruppi prostetici, fosforilazione e idrossilazione di aminoacidi, ecc.);
• Sequenze segnale per recettori e/o ligandi;
• Relazioni evoluzionistiche;

Il CASP (Critical Assessment of Protein Structure Prediction) è un esperimento condotto ogni 2 anni dalla comunità che si occupa di predizione della struttura di proteine, per valutare la bontà dei loro algoritmi.

Rigidità del legame peptidico

Il legame peptidico è un punto di rigidità della catena. Si ha possibilità di rotazione intorno ai legami C_α-C (angolo di torsione ψ) e C_α-N (angolo di torsione φ). In teoria φ e ψ possono avere qualsiasi valore tra –180° e +180°, tuttavia molti di questi valori non sono permessi a causa di impedimenti sterici tra gli atomi dello scheletro polipeptidico e quelli delle catene laterali.