Proteina prionica, Metodi fisici biochimici

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ricombinante ShaPrP (29-231) analoga al PrP lega due ioni rame bivalenti a concentrazioni

fisiologiche rilevanti, e attraverso studi su un lungo peptide derivato dalle regioni ottaripetute di

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PrP, sono arrivati a ipotizzare che due ottaripetizioni legano ognuna un Cu che induce una corretta

e regolare struttura nella regione flessibile di PrP(29-231).

Le procedure di preparazione ed analisi dei campioni eseguite dai ricercatori richiedono più fasi: la

prima consiste nell'ottenere i diversi campioni che sono il ricombinante ShaPrP (29-231), l'isoforma

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cellulare PrP , i peptidi sintetici SHaPrP (57-91) e SHaPrP (73-91), i quali sono stati ottenuti dopo

diverse fasi di purificazione, concentrazione e altro.

• La prima proteina, come dice il nome stesso, deriva da criceto siriano. E’ composta dai residui che

vanno dal 29esimo al 231esimo, e manca della regione N-terminale presente invece nella forma

nativa. E' stata espressa in un ceppo di E. coli privato di proteasi e sotto il controllo del promotore

della fosfatasi alcalina; le cellule sono state poi omogeneizzate e la porzione insolubile contenente

la proteina (il pellet) è stato recuperato e centrifugato. Il pellet ottenuto così è stato poi solubilizzato

e la proteina è stata purificata attraverso la cromatografia per esclusione di massa. La frazione

contenente la proteina è stata poi liofilizzata e risolubilizzata. Infine per il corretto ripiegamento

questi campioni sono stati diluiti a una concentrazione finale di 100 μg/mL, poi dializzata e

concentrata con ultrafiltrazione.

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• La preparazione di PrP invece è avvenuta attraverso estrazione da una frazione grezza

microsomale di cervello di criceto, seguita da diversi passaggi di purificazione. La prima

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purificazione è stata fatta per cromatografia su colonna, caricata con Cu , e la proteina è stata eluita

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con 150 mM di imidazolo. In seguito le frazioni contenenti PrP sono state purificate mediante

anticorpi attraverso cromatografia con colonna contenente proteina A e precaricata con anticorpi

monoclonali. Infine la proteina è stata concentrata con ultrafiltrazione.

• I peptidi contenenti i residui 57-91 e 73-91 di SHaPrP sono stati sintetizzati a partire da

amminoacidi protetti da Fmoc, per poi essere purificati attraverso la cromatografia HPLC e infine

liofilizzati e risospesi.

• La preparazione di PrP priva di metalli è avvenuta attraverso fasi di dialisi seguite da saggi per

verificare l'effettiva purezza della proteina. E' stata infatti sottoposta a cromatografia per

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assorbimento di fiamma (che ha mostrato una concentrazione di Cu < 0.5 μM), e dopo un ulteriore

ciclo di dialisi, la concentrazione della proteina ( c = A / d ελ ) è stata calcolata attraverso la

spettrometria a 280 nm: il coefficiente di estinzione molare di SHaPrP [29-231] è stato stabilito con

l'analisi degli amminoacidi. A partire da questi campioni sono stati condotti esperimenti di:

Spettroscopia di Dicroismo Circolare, Spettroscopia a fluorescenza di Trp, Equilibro di Dialisi,

Denaturazione con calore, e con i risultati ottenuti è stato modellizzato il sito di legame umano di

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PrP con Cu .

(Domanda1)La spettroscopia a dicroismo circolare (DC) è una tecnica che sfrutta la capacità

degli isomeri ottici di ruotare il piano della luce polarizzata quando questa li attraversa e permette di

misurare la variazione dell'angolo del piano di polarizzazione. Questo comportamento è provocato

da sostanze chirali come le proteine che devono questa proprietà alla loro composizione in

amminoacidi in cui il Cα è il centro stereogenico. Per questo le proteine sono molecole otticamente

attive coinvolte nell'interazione con la luce: in particolare ogni amminoacido provoca un effetto

diverso sulla luce ma in generale quando questa attraversa il campione ne esce polarizzata

ellitticamente. Nel caso delle proteine si calcola l'ellitticità molare, cioè la differenza di

assorbimento da parte di un amminoacido della luce circolarmente polarizzata a destra e a sinistra.

Studiando questo parametro in relazione alla lunghezza d'onda (siamo nel vicino UV), si ottiene lo

spettro del DC da cui si risale alla struttura secondaria di una proteina in base a uno spettro

standard. Questa tecnica mostra infatti la presenza di α-eliche, β-foglietti, β-turn e random coil

presenti in una proteina in soluzione e viene applicata nello studio dei cambiamenti di

conformazione (per esempio da α-elica a β-foglietto, come nel nostro caso) che avvengono durante

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l'interazione con altre sostanze, come il Cu . I cromofori in grado di assorbire la luce nelle proteine

sono il legame peptidico, le catene laterali degli amminoacidi ed eventuali gruppi prostetici. Il

maggior contributo nel vicino UV è dato dal legame peptidico stesso in cui l'interazione con la luce

dà luogo a transizioni (tra gli stati elettronici degli elettroni di legame) che avvengono a certe

lunghezze d'onda: il tipico spettro di DC di un α-elica consiste in una banda negativa a 220 nm e

una coppia di bande positive a 190 nm e negativa a 205 nm; lo spettro di DC di un β-foglietto è

caratterizzato invece da una banda negativa a 215 nm e una positiva a 195 nm.

In questo caso per studiare la capacità della PrP di legare i metalli è stata applicata questa tecnica

sia al ricombinante SHaPrP (29-231) sia alla proteina PrP purificata dal cervello di criceto e in

particolare ci si serve del ricombinante SHaPrP come modello parziale per studiare le proprietà

della proteina nativa PrP. Gli spettri risultanti hanno mostrato andamenti dei grafici quasi

sovrapponibili nel vicino UV da cui si può capire che le due proteine hanno simile struttura

secondaria e terziaria.

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Per capire se il Cu fosse uno dei possibili ligandi sono stati collezionati spettri di DC in presenza e

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assenza di CuCl : è stato così dimostrato che il Cu non solo lega PrP ma ne induce anche

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cambiamenti nella struttura terziaria. Le due forme di SHaPrP (29-231), una complessata e una

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priva di Cu , mostrano entrambe due minimi nello spettro a 208nm e 222nm che sono indicativi di

un α-elica predominante nella struttura secondaria. La forma complessata però mostra una leggera

diminuzione dell'intensità che potrebbe significare un minor ripiegamento o aggregazione di

proteine; si nota inoltre una banda addizionale a 260nm, che indica un cambiamento di struttura

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terziaria nella regione aromatica di SHaPrP in presenza di Cu .

Questo tipo di osservazioni su SHaPrP sono state poi confermate negli studi di spettroscopia a

fluorescenza di Trp che hanno mostrato come con l'addizione di CuCl si ha un'attenuazione

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dell'intensità iniziale della fluorescenza del 30% (domanda 3), formano un secondo massimo

sempre in corrispondenza dei 346.5nm (dove era stato registrato il picco di fluorescenza della

proteina in assenza di rame). Questo tipo di dati ci suggeriscono come il Trp si sia spostato in una

regione più idrofobica e quindi ci sia stato un rimaneggiamento della struttura terziaria.

(Domanda 2)La tecnica della spettroscopia a fluorescenza di Trp è dunque la seconda principale

tecnica utilizzata più volte nel corso di questi studi. Rappresenta un'estensione della spettroscopia a

fluorescenza, o spettrofluorimetria, che si basa sul fatto che gli elettroni coinvolti nei legami in una

proteina a temperatura ambiente si trovano allo stato fondamentale, ma quando vengono eccitati con

fotoni, gli elettroni saltano ad un livello di energia più alto per poi tornare al loro stato

fondamentale. Sia nella fase di eccitazione che nella fase di ritorno è possibile ottenere degli spettri:

il primo è lo spettro di assorbanza, il secondo, che è quello di nostro interesse, è quello di

fluorescenza che consiste nell'emissione di una radiazione di lunghezza d'onda maggiore (e quindi a

contenuto energetico minore) rispetto alla radiazione assorbita. La differenza tra queste due

lunghezze d'onda è detta spostamento o “shift di Stokes”. Con questa tecnica viene quindi misurata

la transizione degli elettroni da un livello energetico maggiore a un livello energetico minore. Se

una sostanza viene eccitata per esempio con radiazione nell'UV, questa emette uno spettro di

fluorescenza nel Visibile. Le molecole organiche sono in grado di emette fluorescenza grazie

all'accoppiamento con molecole non proteiche fluorescenti, come l'ANS o il GFP, o grazie alla

presenza instriseca di fluorofori in regioni specifiche della molecola. I fluorofori sono tutte

molecole caratterizzate da sistemi di doppi legami coniugati e risonanze, importanti

nell'assorbimento ed emissione di uno spettro perché hanno elettroni delocalizzati che sono quindi

suscettibili a salti di livello quando eccitati (e viceversa). Alcuni esempi sono ad esempio le

clorofille, cofattori come NADH e FADH, gli anelli policiclici aromatici, e le proteine grazie agli

amminoacidi Tyr, Phe e Trp. Ovviamente uno spettro di emissione da parte di una molecola, o di un

amminoacido come il Trp, è influenzato dall'ambiente circostante: l'emissione del Trp per esempio

dipende dalla sua localizzazione nella proteina: se è esposto sulla superficie emette con una certa

intensità se si trova in un ambiente più idrofobico, e quindi più nascosto della proteina, la sua

emissione sarà ridotta di molto. Per questo la spettrofluorimetria viene applicata, come nel nostro

caso, allo studio di fenomeni dinamici come le interazione proteina-proteina, proteina-ligando e nei

fenomeni di denaturazione e rinaturazione che comportano cambiamenti conformazionali.

Il Trp è stato preso come riferimento per questa serie di studi sul PrP poiché si registrano spettri di

emissione a 280nm (lunghezza d'onda tipica del Trp) nella proteina SHaPrP (29-231), che attestano

la presenza di questo amminoacido. In particolare ci sono otto Trp nella proteina e, grazie a studi di

NMR, si è visto che sei di questi sono presenti intorno e nell'ottaripetizione della proteina

(PHGGGWGQ) e quindi può dare informazioni sui cambiamenti che avvengono li (domanda 3).

Sono stati condotti anche sui peptidi SHaPrP (57-91) e (73-91) degli studi simili. Il primo ha

mostrato la presenza di quattro Trp e quindi di quattro ottaripetizioni, mentre il secondo contiene

due Trp e quindi due ottaripetizioni. In particolare sono stati incubati con diverse quantità di CuCl 2

per registrare le differenze tra le emissioni e sono stati collezionati anche spettri con aggiunta di

altri ioni metallici e a diversi valori di pH.

Gli studi condotti utilizzando questa tecnica hanno investigato la saturabilità del sito di legame per

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il Cu , la specificit