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Proteina prionica, Metodi fisici biochimici Appunti scolastici Premium

Appunti per l'esame a scelta di Metodi fisici biochimici del prof. Pedersen, 3 cfu. Gli argomenti trattati sono i seguenti: Metodi Biochimici, Proteine, Nuove, Fisici, Strutturale, Struttura, spettroscopia a dicroismo circolare (DC), spettroscopia a fluorescenza di Trp.

Esame di Metodi fisici biochimici docente Prof. J. Pedersen

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attive coinvolte nell'interazione con la luce: in particolare ogni amminoacido provoca un effetto

diverso sulla luce ma in generale quando questa attraversa il campione ne esce polarizzata

ellitticamente. Nel caso delle proteine si calcola l'ellitticità molare, cioè la differenza di

assorbimento da parte di un amminoacido della luce circolarmente polarizzata a destra e a sinistra.

Studiando questo parametro in relazione alla lunghezza d'onda (siamo nel vicino UV), si ottiene lo

spettro del DC da cui si risale alla struttura secondaria di una proteina in base a uno spettro

standard. Questa tecnica mostra infatti la presenza di α-eliche, β-foglietti, β-turn e random coil

presenti in una proteina in soluzione e viene applicata nello studio dei cambiamenti di

conformazione (per esempio da α-elica a β-foglietto, come nel nostro caso) che avvengono durante

2+

l'interazione con altre sostanze, come il Cu . I cromofori in grado di assorbire la luce nelle proteine

sono il legame peptidico, le catene laterali degli amminoacidi ed eventuali gruppi prostetici. Il

maggior contributo nel vicino UV è dato dal legame peptidico stesso in cui l'interazione con la luce

dà luogo a transizioni (tra gli stati elettronici degli elettroni di legame) che avvengono a certe

lunghezze d'onda: il tipico spettro di DC di un α-elica consiste in una banda negativa a 220 nm e

una coppia di bande positive a 190 nm e negativa a 205 nm; lo spettro di DC di un β-foglietto è

caratterizzato invece da una banda negativa a 215 nm e una positiva a 195 nm.

In questo caso per studiare la capacità della PrP di legare i metalli è stata applicata questa tecnica

sia al ricombinante SHaPrP (29-231) sia alla proteina PrP purificata dal cervello di criceto e in

particolare ci si serve del ricombinante SHaPrP come modello parziale per studiare le proprietà

della proteina nativa PrP. Gli spettri risultanti hanno mostrato andamenti dei grafici quasi

sovrapponibili nel vicino UV da cui si può capire che le due proteine hanno simile struttura

secondaria e terziaria.

2+

Per capire se il Cu fosse uno dei possibili ligandi sono stati collezionati spettri di DC in presenza e

2+

assenza di CuCl : è stato così dimostrato che il Cu non solo lega PrP ma ne induce anche

2

cambiamenti nella struttura terziaria. Le due forme di SHaPrP (29-231), una complessata e una

2+

priva di Cu , mostrano entrambe due minimi nello spettro a 208nm e 222nm che sono indicativi di

un α-elica predominante nella struttura secondaria. La forma complessata però mostra una leggera

diminuzione dell'intensità che potrebbe significare un minor ripiegamento o aggregazione di

proteine; si nota inoltre una banda addizionale a 260nm, che indica un cambiamento di struttura

2+

terziaria nella regione aromatica di SHaPrP in presenza di Cu .

Questo tipo di osservazioni su SHaPrP sono state poi confermate negli studi di spettroscopia a

fluorescenza di Trp che hanno mostrato come con l'addizione di CuCl si ha un'attenuazione

2

dell'intensità iniziale della fluorescenza del 30% (domanda 3), formano un secondo massimo

sempre in corrispondenza dei 346.5nm (dove era stato registrato il picco di fluorescenza della

proteina in assenza di rame). Questo tipo di dati ci suggeriscono come il Trp si sia spostato in una

regione più idrofobica e quindi ci sia stato un rimaneggiamento della struttura terziaria.

(Domanda 2)La tecnica della spettroscopia a fluorescenza di Trp è dunque la seconda principale

tecnica utilizzata più volte nel corso di questi studi. Rappresenta un'estensione della spettroscopia a

fluorescenza, o spettrofluorimetria, che si basa sul fatto che gli elettroni coinvolti nei legami in una

proteina a temperatura ambiente si trovano allo stato fondamentale, ma quando vengono eccitati con

fotoni, gli elettroni saltano ad un livello di energia più alto per poi tornare al loro stato

fondamentale. Sia nella fase di eccitazione che nella fase di ritorno è possibile ottenere degli spettri:

il primo è lo spettro di assorbanza, il secondo, che è quello di nostro interesse, è quello di

fluorescenza che consiste nell'emissione di una radiazione di lunghezza d'onda maggiore (e quindi a

contenuto energetico minore) rispetto alla radiazione assorbita. La differenza tra queste due

lunghezze d'onda è detta spostamento o “shift di Stokes”. Con questa tecnica viene quindi misurata

la transizione degli elettroni da un livello energetico maggiore a un livello energetico minore. Se

una sostanza viene eccitata per esempio con radiazione nell'UV, questa emette uno spettro di

fluorescenza nel Visibile. Le molecole organiche sono in grado di emette fluorescenza grazie

all'accoppiamento con molecole non proteiche fluorescenti, come l'ANS o il GFP, o grazie alla

presenza instriseca di fluorofori in regioni specifiche della molecola. I fluorofori sono tutte

molecole caratterizzate da sistemi di doppi legami coniugati e risonanze, importanti

nell'assorbimento ed emissione di uno spettro perché hanno elettroni delocalizzati che sono quindi

suscettibili a salti di livello quando eccitati (e viceversa). Alcuni esempi sono ad esempio le

clorofille, cofattori come NADH e FADH, gli anelli policiclici aromatici, e le proteine grazie agli

amminoacidi Tyr, Phe e Trp. Ovviamente uno spettro di emissione da parte di una molecola, o di un

amminoacido come il Trp, è influenzato dall'ambiente circostante: l'emissione del Trp per esempio

dipende dalla sua localizzazione nella proteina: se è esposto sulla superficie emette con una certa

intensità se si trova in un ambiente più idrofobico, e quindi più nascosto della proteina, la sua

emissione sarà ridotta di molto. Per questo la spettrofluorimetria viene applicata, come nel nostro

caso, allo studio di fenomeni dinamici come le interazione proteina-proteina, proteina-ligando e nei

fenomeni di denaturazione e rinaturazione che comportano cambiamenti conformazionali.

Il Trp è stato preso come riferimento per questa serie di studi sul PrP poiché si registrano spettri di

emissione a 280nm (lunghezza d'onda tipica del Trp) nella proteina SHaPrP (29-231), che attestano

la presenza di questo amminoacido. In particolare ci sono otto Trp nella proteina e, grazie a studi di

NMR, si è visto che sei di questi sono presenti intorno e nell'ottaripetizione della proteina

(PHGGGWGQ) e quindi può dare informazioni sui cambiamenti che avvengono li (domanda 3).

Sono stati condotti anche sui peptidi SHaPrP (57-91) e (73-91) degli studi simili. Il primo ha

mostrato la presenza di quattro Trp e quindi di quattro ottaripetizioni, mentre il secondo contiene

due Trp e quindi due ottaripetizioni. In particolare sono stati incubati con diverse quantità di CuCl 2

per registrare le differenze tra le emissioni e sono stati collezionati anche spettri con aggiunta di

altri ioni metallici e a diversi valori di pH.

Gli studi condotti utilizzando questa tecnica hanno investigato la saturabilità del sito di legame per

2+

il Cu , la specificità del sito di legame e gli amminoacidi coinvolti nel legame.

• Nel primo caso la proteina SHaPrP (29-231) è stata incubata con diverse concentrazioni di CuCl ,

2

per ognuna delle quali veniva misurato lo spettro di emissione. Ad alte concentrazioni di rame

l'attenuazione della fluorescenza raggiunge un plateau e a metà altezza massima del grafico

corrisponde una concentrazione di rame di 14 μM. Poiché questi valori, e il grafico da cui sono

tratti (figura 3A), non sono rappresentati da una vera curva sigmoidale, si pensa che il prione abbia

2+

siti di legame per il Cu non equivalenti, cioè con costanti di dissociazione diverse.

Comunque sono state riscontrate curve di titolazione simili per i due peptidi sintetici SHaPrP (57-

91) e (73-91) (figura 3A), entrambi contenenti ottaripetizioni: questo spinge a pensare perciò che il

2+

legame con il Cu avvenga nell'ottaripetizione e che due ottaripetizioni consecutive leghino uno

ione rame. 2+

• Nel secondo caso si è dimostrato che i siti di legame di PrP sono altamente specifici per il Cu .

Ciò è stato visto (figura 3B) monitorando l'intensità della fluorescenza del Trp a 353nm in presenza

2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+

di vari cationi divalenti: Ca , Co , Ni , Mn , Mg , Zn e Cu . Anche incubando il prione in

presenza di grandi quantità di questi ioni, non è stato rilevato nessun cambiamento di spettro tranne

2+

che per il Cu che causa attenuazione dell'intensità (domanda 4). Questo ione, infatti, presenta delle

caratteristiche uniche di coordinazione nelle proteine: il rame preferisce una coordinazione

2+ 2+

ottaedrica o quadrata planare, invece Zn e Co normalmente adottano una geometria di

2+

coordinazione tetraedrica. Tra i metalli presi in esame è stato escluso il Fe (domanda 4).

• Il terzo caso infine associa analisi dello spettro di fluorescenza del Trp a 353nm con curve di

titolazione per capire quali amminoacidi sono coinvolti nel legame con cationi bivalenti e in

particolare con il rame. Il prione è stato incubato con una grande varietà di ioni metallici a diversi

valori di pH: all'aumentare del pH aumenta in modo pronunciato l'attenuazione dell'intensità nel

campione complessato con rame (già a partire da pH 5 inizia un aumento dell'attenuazione). Ciò fa

2+

pensare che il Trp si trovi in prossimità del sito di legame con il Cu . Inoltre osservando che nella

proteina nativa PrP c'è una presenza ricorrente di His e osservando che il legame “titola” a pH 6, si

suppone che, date le caratteristiche acido-base della catena laterale imidazolica dell'His, sia questo

amminoacido a chelare il rame.

(Domanda 5)Un altro importante esperimento condotto è stato la denaturazione con calore della

PrP, monitorando i cambiamenti della sua struttura a temperature elevate con DC a 222 nm (in

relazione all'ellitticità molare). Questo tipo di approccio è stato scelto partendo dalle osservazioni in

studi precedenti che hanno dimostrato la suscettibilità al calore del prione (come tutte le proteine

d’altronde) che in particolare poteva essere convertito da un’α-elica monomerica predominante a

una struttura oligomerica ricca di β-foglietti attraverso il semplice riscaldamento. Quindi sono state

2+

studiate le conformazioni della proteina in assenza e presenza di Cu (a concentrazioni crescenti di

CuCl : 25 μM, 50 μM, 100 μM) sottoponendo i campioni a un aumento di temperatura ogni 0,3°

2

C/min (partendo da 25° C a 76° C ) e registrando le intensità di DC ogni aumento di 0,1° C della

2+

temperatura. In entrambi i campioni (metal-free e a concentrazioni di Cu maggiori di 50 μM) le

strutture mostrano analogie quando sottoposte alle temperature più estreme dell'esperimento (figura

2+

5B-5C): a 25° C, sia la forma priva di metallo sia la forma complessata con Cu , presentano un

picco ampio iniziale e due minimi di intensità a 208 e 222 nm che testimoniano la presenza di un α-

elica predominante; a 76° C invece il picco iniziale è molto ridotto e la presenza del minimo a 217

nm indica l'esistenza di β-foglietti. Ciò che cambia però è il comportamento delle strutture nei due

casi all'interno del range di riscaldamento (figura 5A). Nel caso della proteina priva di metallo c'è

un inizio del cambio conformazionale intorno ai 45° C ma la vera transizione cooperativa (in cui

metà delle molecole hanno cambiato struttura) si ha a 60° C in cui c'è un'inversione dell'andamento

della curva che arriva a plateau intorno ai 74° C. Per studiare l'ipotetica reversibilità della struttura

proteica, si sottopone il campione a raffreddamento (da 76° C a 25° C): il DC mostra graficamente

(figura 5B) come la conformazione assunta in questo caso sia una struttura secondaria intermedia

tra α-elica e β-foglietto; non c'è quindi una reversibilità completa. Per studiare invece l'effetto del

2+

Cu , la proteina è stata preparata con tre concentrazioni crescenti di CuCl : con 25 μM non si

2

osserva un cambiamento significativo, mentre a 50 μM e 100 μM (concentrazioni probabilmente

sovra-fisiologiche) la proteina complessata mostra un cambio cooperativo della struttura simile al

caso metal-free. In particolare si è visto che all'aumentare della concentrazione di CuCl (quindi nei

2

casi di 50 μM e 100 μM) la temperatura del cambio conformazionale scende a 56° C, temperature

inferiore rispetto al midpoint osservato nel caso metal free (60° C). Ciò mostra come il legame con

2+

il Cu tende a promuovere più velocemente il cambiamento in β-foglietto e lo stabilizzi bene, come

si vede dai campioni complessati dopo il loro raffreddamento (eseguito analogamente all'altro caso).

2+

Il legame con il Cu porta quindi a una minore reversibilità della proteina rispetto al caso metal-

2+

free. Se il Cu (o la sua assenza) influenzi la formazione della conversione proteina sana-proteina

malata e come questo meccanismo avvenga è ancora da determinare e chiarire però poiché è noto

che nel meccanismo della malattia del prione interviene un cambio conformazionale simile al caso

visto prima, si solleva la possibilità che il legame con il rame abbia un ruolo nella formazione di

SC

PrP o nel processo patogenico. In alcuni casi di CJD ereditari, sono inserite sequenze ottaripetute

2+

in un allele che codifica per il PrP. Un disturbo del legame di Cu con queste proteine PrP estese

potrebbe partecipare alla patogenesi di questi casi familiari di CJD. E' da notare come la delezione

di un'ottaripetizione non scatena la malattia. Anche nella patogenesi dell'Alzheimer si è ipotizzato

che un ruolo sia svolto dal legame di ioni metallici con il peptide A-β (derivato dal taglio

proteolitico della proteina precursore β-amiloide APP). In particolare recentemente è stato trovato

2+ 2+ +

nell'APP un sito di legame per il Cu in cui avviene la conversione di Cu in Cu . Gli esperimenti

2+

di equilibrio di dialisi invece hanno dimostrato direttamente il legame Cu -Prp e sono serviti per

2+

calcolare il numero dei siti di legame e ottenere la costante di dissociazione dei Cu . Questa

tecnica, in generale, consente di separare sostanze contenute in un liquido sfruttando la loro capacità

di attraversare una membrana semipermeabile guidate dal gradiente di concentrazione: la

membrana, infatti, delimita due scomparti a diversa concentrazione e, agendo da filtro, permette il

passaggio delle molecole solo in una direzione. Per esempio nel caso dello studio del legame

recettore-ligando (dove il ligando è piccolo e capace di diffusione), all'equilibrio la concentrazione

del ligando sarà uguale in entrambi gli scomparti: da una parte però avremo il complesso ligando-


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher mancusiello di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Metodi fisici biochimici e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Tor Vergata - Uniroma2 o del prof Pedersen Jens Zancho.

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