Proteina prionica, Metodi fisici biochimici

Proteina prionica lega selettivamente rame

Oggetto dell’articolo è la proteina prionica PrP, un acronimo che sta per “Proteinaceous Infectious SCOnly”. Molte ricerche sono già state effettuate sulla sua forma infettiva PrP^Sc (l'apice “Sc” sta per “scrapie”, italianizzazione del termine inglese “to scrape”, cioè grattare, sfregare), e ormai conosciamo bene la sua funzione patogenica, che causa malattie neurodegenerative sia nei mammiferi (BSE e scrapie delle pecore) sia nell'uomo (CJD). Nel caso della BSE si è visto nel corso degli ultimi anni come questa malattia possa essere trasmessa all'uomo provocando effetti devastanti nel cervello.

Attraverso una imponente riorganizzazione della struttura secondaria e terziaria della forma cellulare PrP si ottiene questa isoforma malata. Le due proteine, forma cellulare e infettiva, hanno in comune solamente la struttura primaria. Le loro differenze sono evidenti già nella struttura secondaria: PrP è costituita principalmente da α-eliche, mentre PrP^Sc da β-foglietti, configurazione che consente l’adesione con molte altre proteine prioniche formando catene. Da alcuni esperimenti esterni a quelli condotti da questo gruppo di ricerca, si è sviluppata una teoria secondo la quale la PrP interagisce con la proteina normalmente prodotta, causando così la malattia.

Teorie sulla proteina PrP*

In realtà oggi la teoria più accreditata è che esista una proteina chiamata PrP*, forma instabile della PrP^c e prodotta in maniera assolutamente casuale, che rappresenta una fase intermedia tra la PrP^c e la PrP^Sc. PrP^c e PrP* sarebbero dunque isoforme intercambiabili tra di loro, ed è proprio con PrP* che si pensa interagisca PrP^Sc. Legandosi, queste due proteine allungano la catena formando un dimero stabile (PrP*-PrP^Sc che diventa PrP^Sc-PrP^Sc), che va a legare altre PrP*. Questa si accumula così tanto nel lisosoma cellulare che non riesce a digerirla, che finisce per far rompere l’organello, mandando così la cellula in autodigestione.

Le conoscenze del ruolo patogenico di PrP sono infatti cresciute nel tempo, mentre la normale funzione fisiologica di PrP è ancora poco chiara. Si sa per esempio che dopo la replicazione all'interno di domini caveolari, la forma cellulare viene glicosilata post-traduzionalmente in corrispondenza di due residui di Asp per essere poi ancorata sotto forma di dimero alla membrana (generalmente di cellule nervose) a livello C-terminale attraverso il glicofosfatidilinositolo (GPI). Da questo punto in poi la funzione di PrP rimane sconosciuta, ed è proprio qui che intervengono le ricerche di Stoekel e collaboratori, autori dell'articolo.

Studi sulla proteina prionica

Per questi studi è stata presa in esame la proteina prionica ricombinante di criceto siriano [ShaPrP(29-231)], espressa in E. coli e ripiegata in α-elica, sottoposta a tecniche diverse che hanno portato alle seguenti conclusioni. Attraverso studi effettuati con la tecnica del NMR è stata identificata una regione N-terminale (residui 29-124) molto flessibile considerata come possibile sito di legame di PrP con un'altra proteina o con un ligando, andando così a formare un complesso stabile. Gli studi si sono focalizzati su quest'ultima opzione ricercando ioni metallici come possibili ligandi.

Utilizzando come tecniche principali la spettroscopia di dicroismo circolare nel vicino UV (DC) e la spettroscopia a fluorescenza del Trp (spesso complementari e usate per confermare le ipotesi reciproche), i ricercatori hanno individuato l'importanza del Cu²⁺ per la proteina in esame: hanno concluso che questo è il ligando più probabile (dimostrandolo anche grazie a purificazione della proteina ricombinante con cromatografia con un chelante del rame) e si pensa che questo metallo si leghi alla PrP in corrispondenza di un'ottaripetizione (PHGGGWGQ).

Metodi di analisi

In particolare il primo metodo (DC) ha mostrato come questo ligando induce cambiamenti conformazionali del PrP che provocano cambiamenti nello spettro di DC; in particolare il rame permette alla proteina prionica di formare dei β-sheet, e ciò è stato dimostrato anche grazie ad esperimenti di denaturazione con calore. Il secondo metodo ha mostrato che il legame di questo metallo attenua lo spettro di emissione del Trp spostandolo a una lunghezza d'onda minore; i siti di legame del Cu²⁺ sono specifici e saturabili; l'interazione è pH-dipendente. Altre tecniche associate alle precedenti sono: l'equilibrio di dialisi, che ha permesso di individuare la stechiometria del legame (in particolare 2 Cu²⁺ per PrP a concentrazioni fisiologiche rilevanti), e la titolazione del legame di Cu²⁺ e la cromatografia per affinità hanno individuato l'His come chelante del metallo. Inoltre l'NMR ha anche mostrato come il ricombinante SHaPrP (29-231) manca di struttura secondaria e terziaria in assenza di Cu²⁺.

Malattie associate all'interazione PrP-Cu

Molte malattie avvalorano l'ipotesi che dall'interazione errata tra PrP e Cu²⁺ derivano disturbi fisiologici. Queste malattie del CNS, sia negli animali che nell'uomo (malattia di Menkes e malattia di Wilson), sono causate da disordini nell'omeostasi del rame. In entrambi i casi si presentano anormalità nel metabolismo del rame dovute a mutazioni in geni che codificano per trasportatori del rame ATP-dipendenti. Nella malattia di Menkes la carenza di rame causa diffusa morte di cellule neuronali, mentre nella malattia di Wilson il rame si accumula in aggregati all'interno del CNS; in quest'ultimo caso è stato possibile utilizzare il Cuprizone, un chelante del rame, che ha indotto nei topi dei cambiamenti neuropatologici simili a quelli trovati nelle malattie causate da prioni.

I ricercatori con la pubblicazione di questo articolo intendono dimostrare che la proteina ricombinante ShaPrP (29-231) analoga al PrP lega due ioni rame bivalenti a concentrazioni fisiologiche rilevanti, e attraverso studi su un lungo peptide derivato dalle regioni ottaripetute di PrP, sono arrivati a ipotizzare che due ottaripetizioni legano ognuna un Cu²⁺ che induce una corretta e regolare struttura nella regione flessibile di PrP(29-231).

Procedure di preparazione ed analisi dei campioni

Le procedure di preparazione ed analisi dei campioni eseguite dai ricercatori richiedono più fasi: la prima consiste nell'ottenere i diversi campioni che sono il ricombinante ShaPrP (29-231), l'isoforma cellulare PrP^C, i peptidi sintetici SHaPrP (57-91) e SHaPrP (73-91), i quali sono stati ottenuti dopo diverse fasi di purificazione, concentrazione e altro.

• La prima proteina, come dice il nome stesso, deriva da criceto siriano. È composta dai residui che vanno dal 29esimo al 231esimo, e manca della regione N-terminale presente invece nella forma nativa. È stata espressa in un ceppo di E. coli privato di proteasi e sotto il controllo del promotore della fosfatasi alcalina; le cellule sono state poi omogeneizzate e la porzione insolubile contenente la proteina (il pellet) è stato recuperato e centrifugato. Il pellet ottenuto così è stato poi solubilizzato e la proteina è stata purificata attraverso la cromatografia per esclusione di massa. La frazione contenente la proteina è stata poi liofilizzata e risolubilizzata. Infine per il corretto ripiegamento questi campioni sono stati diluiti a una concentrazione finale di 100 μg/mL, poi dializzati e concentrati con ultrafiltrazione.
• La preparazione di PrP^C invece è avvenuta attraverso estrazione da una frazione grezza microsomale di cervello di criceto, seguita da diversi passaggi di purificazione.