Sintesi del DNA e destino di una proteina: dalla sintesi alla regolazione post-traduzionale

CS

con la DNA ligasi IV uma-

proteina, XRCC4, che in questo modo interagisce

na indirizzandola verso la rottura a doppio filamento. Bisogna sottolineare

che un taglio a singolo filamento non compromette l’integrità della doppia

elica: infatti il singolo filamento che rimane esposto viene avvolto dalle

proteine PARPI, che lo proteggono dalla rottura e gli impediscono di an-

dare incontro a eventi di ricombinazione indesiderati meccanismo SOS :

Il DNA è altamente danneggiato, quindi la cellula o va incontro ad apopto-

si o tenta di replicare la regione danneggiata nonostante l’errore. le cellule

di E.coli attraverso la risposta SOS assembla un mutasoma che comprende

la DNA polimerasi V e diverse copie della proteina RecA. Quest’ultima

una proteina che lega il DNA a singolo filamento e che riveste i filamenti

danneggiati permettendo alla DNA polimerasi V di sostituire la DNA po-

limerasi III ed effettuare una sintesi di DNA (mettendo nucleotidi a caso)

po-

incline all’errore fino a che stata superata la regione danneggiata e la DNA

limerasi III può riprendere di nuovo il controllo.

A questo punto il genoma coordina le varie azioni della cellula tramite

l’attività coordinata di enzimi ed altre proteine che partecipano ad una se-

rie complessa si reazioni note come Espressione genica. Questa è compo-

sta da varie fasi:

• Accesso al genoma: processi che influenzano la struttura della cro-

matina per rendere i geni accessibili

• Assemblaggio del complesso di inizio della trascrizione e Trascrizio-

ne : i geni vengo copiati in RNA con conseguente formazione del

Trascrittoma ( insieme degli RNA codificanti per proteine)

• Processamento dell’RNA: modificazioni alla struttura dell’RNA pri-

ma che questo venga tradotto

• Degradazione dell’RNA: ricambio controllato delle molecole di RNA

• Assemblaggio del complesso di inizio della traduzione e sintesi pro-

teica: formazione del Proteoma ( l’insieme delle proteine cellulari)

• Ripiegamento e maturazione delle proteine

• Degradazione proteica

Da notare che il trascrittoma indica il solo RNA codificante che va a

costituire circa il 4% di tutto l’RNA. Dell’RNA non codificante fanno

parte:

• Gli rRNA (RNA ribosomiali), che sono parte integrante dei riboso-

mi, le particelle dove ha luogo la sintesi proteica;

• Gli tRNA (RNA transfer), piccole molecole coinvolte nella sintesi proteica,

gli amminoacidi ai ribosomi in modo tale da permette-

che trasportano

re che vengano uniti nell‟ordine specificato dalla sequenza nucleoti-

dica dell‟mRNA.

Inoltre negli eucarioti si può distinguere anche una varietà di corti

RNA non codificanti (quindi oltre a rRNA e tRNA) che viene divisa in

tre categorie sulla base della localizzazione all‟interno

della cellula:

• I snRNA (piccoli RNA nucleari), che sono coinvolti nella maturazio-

ne degli mRNA;

• I snoRNA (piccoli RNA nucleolari), importanti per la maturazione

delle molecole di rRNA;

• I scRNA (piccoli RNA citoplasmatici), molecole con una varietà di

funzioni diverse.

Invece nei procarioti, oltre al tRNA e rRNA, si può individuare un al-

tro tipo di RNA non codificante, l’tmRNA (RNA transfer-messaggero,

che sembra un tRNA legato ad un mRNA, la cui funzione è quella di

aggiungere un breve peptide segnale sulle proteine sintetizzate non

correttamente, marcandole così per un‟immediata degradazione).

TRASCRIZIONE

Gli enizimi che eseguono la trascrizione si chiamano RNA polimerasi,

queste a differenza delle DNA polimerasi possono dare inizio a una

catena di RNA senza un primer in quanto la trascrizione non ha biso-

gno di essere cosi accurata come la replicazione ( l’RNA non conser-

va permanentemente l’informazione genetica). L’RNA pol. compie cir-

ca un errore ogni 10^4 nucleotidi copiati, ha comunque un modesto

meccanismo di correzione, per cui se un ribonucleotide non corretto

viene aggiunto, la polimerasi può tornare indietro ed eseguire una

reazione di escissione. La velocità di trascrizione è 10-15 volte più

bassa della replicazione, di conseguenza i due apparati preposti a

tali attività possono collidere. Quindi la forcella di replicazione pas-

sa attraverso l’apparato di trascrizione senza spiazzarlo. Di conse-

guenza la trascrizione farà una pausa per poter riprendere successi-

vamente.

Nei batteri è possibile distinguere un solo tipo di RNA polimerasi, un

nucleo composto da 4 subunità chiamato Apoenzima. Una subunità

che si può staccare chiamata fattore sigma, si associa al nucleo e lo

assiste; insieme il fattore sigma e l’apoenzima sono noti come Oloen-

zima. Questo complesso aderisce solo debolmente al DNA, tuttavia

quando la polimerasi scivola in una zona della doppia elica chiamata

promotore ( sequenza speciale di nucleotidi che indica il punto di par-

tenza) vi si lega con forza. il legame è reso possibile dal fattore sigma

e ognuno è specifico per una determinata classe di promotori; subito

dopo l’inizio della trascrizione questo fattore si dissocia, infatti l’olo-

enzima è responsabile del riconoscimento del promotore e quindi del-

l’inizio della trascrizione mentre l’apoenzima può allungare il tra-

scritto. promotori batterici degli mRNA sono costituiti da due serie di

sequenze nucleotidiche definite: la regione -35 (5’-TTGACA-3’) la re-

gione -10 (5’-TATAAT-3’). Il segno “-” sta ad indicare la distanza, in

numero di nucleotidi, dal punto di inizio della trascrizione indicato

come +1. Inoltre queste sequenze sono dette consenso in quanto de-

scrivono “la media” di tutte le sequenze di promotori nei batteri.

Dopo che l’oloenzima si è legato al promotore la doppia elica viene

aperta ( in particolare vengono rotte le coppie di basi della regione

-10, TATA box, convertendo cosi il promotore da complesso chiuso ad

aperto); a differenza della DNA elicasi questa apertura limitata non

richiede idrolisi dell’ATP. Dopo che sono stati sintetizzati i primi dieci

nucleotidi il nucleo dell’enzima rompe le sue interazioni con il fattore

sigma e inizia a muoversi lungo il DNA, l’allungamento della catena

avviene ad una velocità di circa 50 nucleotidi/sec. Affinché si verifichi

la terminazione, la polimerasi deve raggiungere una posizione nello

stampo in cui la dissociazione è più favorevole rispetto alla sintesi di

RNA. I batteri usano due strategie per la terminazione della trascri-

zione:

• Terminatore Rho-indipendente (terminatori intrinseci): formazione

di una forcina per appaiamento stabile RNA-RNA dopo aver trascrit-

to una palindrome invertita. Questa forcina ( ricca di sequenze C-G)

riduce il numero di contatti tra lo stampo e il trascritto, indebolendo

l’interazione totale.

• Terminatore Rho-dipendente: questi segnali di solito mantengono la

struttura a forcina sebbene sia meno stabile, la terminazione richie-

de l’attività della proteina Rho che si lega al trascritto partendo dal-

l’estremità 5’ e muovendosi verso la polimerasi. Al segnale di termi-

nazione la polimerasi si ferma ( per la formazione della forcina),

Rho riesce a raggiungerla e, essendo un’elicasi, separa le coppie di

basi tra lo stampo e il trascritto.

Negli eucarioti abbiamo tre RNA pol. : I, II e III. Le tre polimerasi

sono strutturalmente simili fra loro e hanno in comune alcune subuni-

tà, ma trascrivono tipi diversi di geni. Le polimerasi I e III trascrivo-

no geni codificanti per tRNA, rRNA, snRNA e miRNA, la RNA pol. II

trascrive la maggioranza dei geni codificanti per proteine. Mentre la

RNA pol. batterica richiede una singola proteina addizionale ( fattore

sigma) per iniziare la trascrizione, le polimerasi eucariotiche richie-

dono molti fattori generali di trascrizione, indicati con il numero del-

la rispettiva polimerasi. Negli eucarioti, il termine promotore viene

usato per descrivere tutte le sequenze che sono importanti per l’inizio

della trascrizione di un gene. Comprendono non solo il promotore

core, cioè il sito al quale si lega il complesso di inizio, ma anche uno

o più elementi promotori a monte. L’assemblaggio del complesso di

inizio sul promotore core può avvenire in assenza degli elementi a

monte, ma in modo poco efficiente. Ciascuna delle tre RNA polimerasi

eucariotiche riconosce un tipo di sequenza promotore diversa; infatti

è la differenza tra i promotori che definisce quali geni verranno tra-

scritti e quale polimerasi sarà implicata. In particolare:

I promotori della RNA polimerasi I sono costituiti da un promotore

• core, in cui il punto di inizio della trascrizione si può trovare tra i

nucleotidi -45 e +20, e da un elemento di controllo circa 100 bp più

a monte;

• I promotori della RNA polimerasi II sono variabili e possono esten-

dersi per alcune chilobasi a monte del sito di inizio della trascrizio-

ne. Il promotore core è costituito da 2 segmenti, la regione -25 o

TATA box e la sequenza iniziatrice Inr localizzata intorno al nucleo-

tide +1. Talvolta è necessaria anche una sequenza definita CAAT

box a circa -80 nucleotidi e altre sequenza localizzate a -200 basi

possono legare attivatori. Oltre al promotore core, i geni riconosciu-

ti dall’RNA polimerasi II hanno diversi elementi promotore a monte;

• I promotori della RNA polimerasi III sono particolari in quanto

sono localizzati all’interno dei geni di cui promuovono la trascrizio-

ne, e quindi sono costituiti da 2 box promotori ma che si presentano

a valle della posizione +1.

Il legame della RNA pol con le sequenze del promotore avviene in

maniera indiretta tramite l’utilizzo dei fattori di trascrizione. Il primo

fattore è TFIID che lega la TATA box tramite la sua subunità TBP e

almeno 12 fattori associati alla TBP ( fattori TAF che aiutano a de-

compattare la cromatina e legano fattori di trascrizione gene specifi-

ci). Dopo che TFIID ha riconosciuto e legato il promotore si legano

gli altri fattori: TFIIA che stabilizza il legame di TBP al DNA, TFIIB

si lega a TBP e richiama la polimerasi e stabilisce la direzione. Inol-

tre TFIIB è in grado di legare un attivatore posizionato più a monte

dirittamente o indirettamente attraverso un coattivatore. Ciò genera

la formazione di una curva essenziale per la trascrizione. , TFIIF

recluta la polimerasi II e induce una torsione nel DNA, TFIIE attira

una elicasi e insieme srotolano il promotore infine TFIIH fosforila

una delle subunità della RNA polimerasi, CTD, dando l’avvio alla

trascrizione. Negli essere umani il CTD consiste di 52 ripetizioni in