Sintesi del DNA e destino di una proteina: dalla sintesi alla regolazione post-traduzionale

Duplicazione del DNA

La replicazione del DNA richiede la cooperazione di molte proteine. Queste comprendono: DNA polimerasi e DNA primasi per catalizzare la polimerizzazione dei nucleosidi trifosfati; DNA elicasi e proteine SSBP per aiutare ad aprire l’elica del DNA in modo da poterla copiare; DNA ligasi e RNAsi H che degrada gli RNA primer per unire insieme i frammenti di DNA sintetizzati in modo discontinuo e DNA topoisomerasi per aiutare a risolvere problemi di superavvolgimento del DNA. Molte di queste proteine formano un complesso multienzimatico tramite il quale le attività sono coordinate.

La replicazione è un fenomeno che viene definito semiconservativo in quanto una molecola di DNA viene sintetizzata a partire da un filamento “madre” che funge da stampo. Di conseguenza, da una molecola madre di acido nucleico avremo due molecole figlie in cui un filamento sarà parentale e l’altro di nuova sintesi. Perché la sintesi proceda, la doppia elica deve essere aperta. Tuttavia, è molto stabile in condizioni normali; le coppie di basi sono bloccate in posizione in modo così forte che sono necessarie temperature vicine a quella di ebollizione dell’acqua per separare i due filamenti. Per questo motivo intervengono la DNA elicasi e le SSBP che aprono la doppia elica e la mantengono stabile in modo da fornire così lo stampo appropriato.

La DNA elicasi è un anello esamerico, quindi sei subunità identiche che si legano e idrolizzano ATP in maniera ordinata per spingere la molecola come un motore rotatorio lungo un singolo filamento di DNA che passa attraverso il foro centrale; l’elica viene aperta con una velocità di 1000 coppie di nucleotidi/s. Le SSBP si legano al filamento esposto di DNA a singolo filamento senza coprire le basi; aiutano le elicasi stabilizzando la conformazione del singolo filamento. Inoltre, raddrizzano le regioni di DNA impedendo regioni a doppio filamento per parziale complementarità tra le basi. Queste proteine sono formate da due domini che coprono un totale di 8 nucleotidi.

Il primo enzima che polimerizza nucleotidi è la DNA polimerasi, scoperta nel 1957. Nei procarioti le DNA polimerasi sono indicate con i numeri romani (I, II, III, IV e V); l’enzima principale è la DNA pol III, la I ha il compito di sussistere questa, la II, IV e V sono coinvolte nei meccanismi di riparazione. L’attività esonucleasica avviene in direzione 3’ —> 5’, detta anche correttore di bozze: permette alla DNA pol di tornare indietro, eliminare l’errore (il nucleotide errato viene eliminato prima che questo sia stato aggiunto covalentemente alla catena in crescita) e riprendere la sintesi; solo la DNA pol I possiede anche un’attività esonucleasica 5’ —> 3’.

In teoria l’appaiamento scorretto avviene ogni 10⁶ nucleotidi, ma in realtà proprio grazie all’attività di correzione si rileva una frequenza di un nucleotide ogni 10⁹. La DNA pol. III è formata da due nuclei enzimatici composti da 3 subunità: alfa, epsilon e theta; la subunità epsilon è responsabile dell’attività correttore di bozze.

Due pinze ciascuna costituite da 2 subunità identiche: la pinza beta che consente al nucleo catalitico di essere saldamente attaccato al filamento (la maggior parte delle molecole di DNA pol. sintetizzerebbe soltanto una breve sequenza di nucleotidi in quanto ha la tendenza a dissociarsi rapidamente dal DNA, questa è importante nella sintetizzazione dei frammenti di Okazaki perché le permette di essere subito riutilizzata per la formazione di un altro frammento finito il precedente) e la pinza gamma con un caricatore della pinza il quale facilita l’aggancio o lo sgancio dalla pinza beta e quindi della DNA pol. dal filamento di DNA, questo complesso svolge dei movimenti verso l’alto e il basso proprio come una chiave inglese quando si avvita un bullone.

Grazie alla presenza di 2 nuclei (invece di 1) è sufficiente un solo enzima per poter lavorare contemporaneamente sui 2 filamenti di DNA, questi due nuclei sono tenuti insieme da due subunità “tau”.

Inizio della replicazione

La replicazione inizia sul cromosoma batterico a partire da un sito specifico, definito oriC (origine di replicazione di E. Coli), si tratta di una sequenza lunga circa 245 bp, contiene 3 copie di un motivo di 13 nucleotidi. Queste ultime 5 nucleotidi e 5 copie di una ripetizione di 9 copie (in particolare la prima, la terza e la quinta) costituiscono i siti di legame delle proteine iniziatrici.

La DNA-A si aggancia ai 5 motivi, dapprima in rapporto 1:1 con i nucleotidi per poi formare una struttura a rocchetto sul quale si avvolge il DNA. Ciò determina uno stress torsionale scaricato nella regione dei 3 motivi con 13 nucleotidi (sito di legame per la DNA-B che taglia la doppia elica e DNA-C che funge da supporto) formando così una bolla di replicazione. L’apertura è favorita in quella regione in quanto sono maggiormente presenti coppie A-T.

A questo punto nell’oriC intervengono le elicasi che promuovono ancora di più la separazione dei due filamenti, successivamente alle elicasi, intervengono le proteine che si legano al DNA a singola elica (SSBP: Single Strand Binding Proteins). La bolla di replicazione può essere divisa in due forcelle di replicazione (una di destra e una di sinistra): il filamento di DNA sintetizzato in maniera continua è noto come filamento leader, quello sintetizzato in maniera discontinua, in quanto la direzione di sintesi è sempre 5’ —> 3’, è noto come filamento lagging (da notare che per il filamento ritardato, la direzione di polimerizzazione è opposta alla direzione generale di crescita della catena).

La DNA pol. catalizza l’aggiunta di un deossiribonucleotide trifosfato all’estremità 3’ OH di una catena. La reazione è favorita dal rilascio del pirofostato dal nucleotide e della sua successiva idrolisi a due molecole di fosfato inorganico. L’inserzione dei nucleotidi avviene all’estremità 3’ OH libera in quanto la DNA pol. non è capace di una polimerizzazione ex novo, di conseguenza c’è bisogno di un primer, uno solo se si tratta del filamento leader, uno per ogni frammento di Okazaki se si tratta del filamento ritardato.

Il meccanismo coinvolge un enzima chiamato DNA primasi (RNA polimerasi DNA-dipendente) che usa ribonucleotidi per sintetizzare RNA primer. Questi, negli eucarioti, sono lunghi circa 10 nucleotidi prodotti ad intervalli di 100-200 nucleotidi. Alla fine della duplicazione questi primer vengono rimossi dalla DNA pol I grazie alla sua attività esonucleasica esercitata in direzione 5’ —> 3’ (negli eucarioti grazie alla RNAsi H che riconosce in un’elica un ibrido RNA/DNA) e i frammenti di Okazaki vengono uniti tramite la DNA ligasi.

Il motivo dell’uso di un RNA come innesco deriva dal fatto che l’inizio della replicazione possa comportare un numero di errori elevato, accoppiamenti sbagliati di basi: gli RNA usati come innesco verranno eliminati, quindi se vi sono stati errori, questi verranno rimossi con l’eliminazione degli RNA.

Man mano che la forcella si muove lungo il DNA si crea ciò che è stato chiamato “il problema dell’avvolgimento”. Ad ogni 10 coppie di basi replicate a livello della forcella corrisponde un giro completo intorno all’asse della doppia elica creando superavvolgimenti. Lo stress torsionale è allentato dalle topoisomerasi che possono essere di due tipi: la topoisomerasi I (con tirosina nel sito attivo) produce una temporanea rottura a singolo filamento; questa rottura (nick) permette alle due sezioni dell’elica su entrambi i lati del nick di ruotare liberamente usando il legame fosfodiestere nel filamento opposto come perno. L’energia del legame fosfodiestere originale è conservata nel legame fosfotirosinico, rendendo così reversibile la reazione e portando quindi ad una riformazione spontanea del legame precedentemente rotto.

La topoisomerasi II forma un legame covalente con entrambi i filamenti dell’elica producendo una rottura a doppio filamento; la proteina usa ATP, taglia e poi ricongiunge entrambi i filamenti (sullo stesso livello dei due filamenti). Nei batteri i superavvolgimenti del DNA vengono eliminati tramite le girasi, che sono topoisomerasi di tipo II: tagliano, fanno avvolgere queste parti del filamento (scaricando così la tensione torsionale) e poi li riagganciano. A questo punto fra i due filamenti aperti si possono inserire gli enzimi polimerizzanti. È stato verificato che l’intero apparato replicativo si muove sempre e solo nella direzione di apertura della forcella. Ciò è possibile per l’ipotesi che il filamento tardivo formi un’ansa consentendo, così, alla DNA polimerasi III di muoversi nella stessa direzione e di polimerizzare i nuovi filamenti su entrambi gli stampi in direzione 5’ —> 3’. La formazione dell’ansa eviterebbe alla DNA polimerasi un inutile viaggio a ritroso sul filamento tardivo.

Nei procarioti la duplicazione termina in una regione diametralmente opposta al punto di origine definita regione di terminazione grazie alla presenza delle proteine Tus. Sono due proteine composte da una parete interna liscia di foglietti beta e una faccia convessa e frastagliata esposta alla forcella che l’attraversa; tra queste andranno ad “incastrarsi” le due forcelle, dove cioè termina la loro “corsa”. Infatti, quando passa una prima forcina attraverso una proteina Tus, quest’ultima cambia conformazione. La stessa forcina, attraversata la prima proteina Tus, arriverà alla seconda proteina Tus che presenterà una conformazione tale da non permettere il passaggio della forcella di replicazione (faccia liscia), bloccando così la sua progressione lungo il genoma circolare. Lo stesso vale anche per l’altra forcina. Il DNA batterico è sintetizzato a circa 500-1000 nucleotidi/s e permette ad una cellula batterica di dividersi ogni 30 min.

Replicazione negli eucarioti

Negli eucarioti, le DNA polimerasi sono indicate con le lettere dell’alfabeto greco; la polimerasi delta è quella principale aiutata dalla polimerasi alfa nella sintesi dei frammenti di Okazaki mentre il filamento leading è sintetizzato dalla polimerasi epsilon (secondo altri la polimerasi delta è l’enzima principale su entrambi i filamenti, aiutata dalla polimerasi alfa); queste due polimerasi, delta ed epsilon, lavorano in sinergia quasi a formare un unico complesso. La polimerasi gamma lavora nell’ambito del genoma mitocondriale. Le polimerasi zeta ed eta possono consentire la duplicazione anche quando la molecola sia danneggiata senza che siano intervenuti meccanismi di riparazione.

Ci sono diverse origini di replicazione, circa 20mila nell’uomo (repliconi). Le origini di replicazione non sono attivate tutte simultaneamente, quindi il DNA di ciascuna unità di replicazione viene duplicato soltanto in una piccola parte della fase S. Inoltre, l’eterocromatina tende ad essere replicata molto tardi nella fase S, il che suggerisce che il tempo di replicazione sia correlato al compattamento del DNA (le forcelle di replicazione si muovono a velocità simili, è il grado di condensazione a influenzare il momento in cui queste sono iniziate piuttosto che la loro velocità).

L’inizio della replicazione viene assicurato da un complesso primasi/polimerasi alfa che sintetizza l’innesco ibrido RNA/DNA, successivamente PCNA, insieme al fattore di replicazione C (RF-C: facilita il riconoscimento del primer) “sloggia” questo complesso e favorisce il legame della pol. delta ed epsilon con il filamento e ne aumenta la processività (la polimerasi epsilon è favorita rispetto alla polimerasi alfa in quanto questa non riesce a sintetizzare lunghi tratti).

Per quanto riguarda la rimozione dei primer questo può avvenire secondo due modelli: nel modello dell’orecchio, la rimozione degli inneschi avviene grazie ad un fattore noto come FEN-1 (la DNA polimerasi + l’elicasi scostano il primer con un pezzo di DNA e FEN 1 taglia nel punto di ramificazione, i pezzi vengono poi uniti dalla ligasi); nel modello della RNAsi H questa rimuove fino all’ultimo ribonucleotide per poi permettere a FEN 1 di eliminare quest’ultimo ribonucleotide e parte del DNA; i pezzi vengono poi uniti dalla ligasi. La duplicazione dei cromosomi richiede non soltanto che il DNA venga replicato, ma anche che nuove proteine cromosomiche vengano sintetizzate.

Quando un nucleosoma è attraversato da una forcella di replicazione l’ottamero di istoni viene spezzato in un tetramero (H3-H4) e due dimeri (H2A-H2B). Il tetramero resta associato al DNA ed è distribuito casualmente a uno o all’altro dei duplex figli, ma i dimeri sono rilasciati dal DNA. Tetrameri appena prodotti sono aggiunti al DNA appena sintetizzato per riempire gli spazi e i dimeri, metà dei quali sono vecchi e metà nuovi, sono aggiunti casualmente. La rapida aggiunta di nuovi tetrameri e dimeri richiede chaperoni degli istoni, questi complessi si legano agli istoni e si dirigono al DNA appena replicato da un’interazione specifica con il PCNA.

Secondo alcuni, gli ottametri nuovi e vecchi si distribuiscono in modo casuale fra i due doppi filamenti. Il meccanismo di duplicazione dei cromosomi permette di trasmettere ai cromosomi figli gli schemi parentali di modifica degli istoni fornendo così un mezzo di eredità epigenetica. Dopo la replicazione i primer vengono eliminati lasciando delle interruzioni. Gli eucarioti risolvono questo problema mediante una struttura terminale specializzata, il telomero, che richiede un enzima particolare, la telomerasi.

I telomeri consistono di molte ripetizioni in tandem di una breve sequenza, nell’uomo questa sequenza è TTAGGG ed è ripetuta circa mille volte in ciascun telomero. Questa sequenza ricca in guanina può stabilizzare le estremità dei cromosomi formando strutture insolite, composte da unità di quattro basi azotate al posto delle canoniche due. Ciò è dovuto all'interazione tra quattro guanine, che formano una struttura planare che si impila sopra ad altre strutture dello stesso tipo, ad ottenere un filamento stabile definito G-quadruplex.

La telomerasi è costituita da un “core” enzimatico e da proteine associate. Il core dell’enzima risulta formato da una proteina denominata TERT (telomerase reverse transcriptase) ed un piccolo RNA (TERC: telomerase RNA component) complementare alle sequenze ripetute dei telomeri. È dunque chiaro che la telomerasi, che utilizza l’RNA per sintetizzare DNA, è una trascrittasi inversa. La telomerasi estende l’estremità 3’ OH poi la DNA polimerasi può sintetizzare la rimanente parte del filamento di nuova sintesi, riempiendo il “gap” iniziale.

TRF1 è una proteina capace di legarsi ai telomeri; la sua funzione potrebbe essere duplice: regolare la lunghezza delle ripetizioni aggiunte e incappucciare il tratto a singola elica evitando che questo inneschi un segnale di DNA danneggiato. Bisogna infine sottolineare che la telomerasi non è ugualmente attiva in tutte le cellule eucaristiche, ma continuamente attiva solo in quelle in cui è necessario che l’informazione rimanga integra. Quindi le telomerasi sono soprattutto attive in cellule staminali ed in quelle germinali. Invece, l’attività enzimatica telomerasica viene gradualmente a perdersi nelle cellule somatiche: da un continuo accorciamento dei filamenti (a seguito di continue replicazioni) deriva la senescenza.

N.B. Durante la transizione G1-> S vi è una diminuzione dei livelli di ciclina D che liberano il PCNA (alti livelli sequestrano il PCNA e non permettono la replicazione nelle fasi iniziali della G1) consentendo la sintesi del DNA.

Meccanismi di riparo del DNA

Il materiale genetico deve essere in grado di andare incontro a cambiamento; senza variabilità (mutazioni e ricombinazione) gli organismi non sarebbero in grado di mutare e di adattarsi. Ogni tipo di variazione del materiale genetico produce “novità”, contribuendo alla realizzazione della evoluzione biologica. La mutazione è un cambiamento (casuale e stabile) nella sequenza nucleotidica di una regione breve di un genoma, riguarda cioè la qualità, il numero, la sequenza dei nucleotidi del DNA, modificando il significato dell’informazione.

Risulta ovvio, però, che è necessario che sia limitata la frequenza di mutazione e la possibilità che questa esiti sempre in un effetto fenotipico. Se la mutazione interesserà una cellula somatica si parla di mutazione somatica, in cui risulteranno mutate solo le cellule derivanti da tale cellula (mutazione ristretta solo all’individuo in cui insorge, non coinvolgendo le progenie); se interesserà le cellule germinali si parla di mutazione germinale e potrà essere trasmessa alla generazione successiva con la conseguenza che tutte le cellule del nuovo organismo presenteranno la mutazione.

Vi possono essere mutazioni puntiformi (o geniche) se la variazione è in scala nucleotidica, mutazioni cromosomiche se viene alterata la struttura dei cromosomi o, infine, mutazioni genomiche se viene coinvolto il numero di cromosomi. Una mutazione puntiforme può essere dovuta a tre tipi di variazione: sostituzione di basi, inserzione o delezione di nucleotidi. Le mutazioni per sostituzione di base possono essere di due tipi: transizioni e transversioni.