Progettazione e sviluppo del farmaco

STRATEGIE PER SVILUPPARE NUOVI HIT E LEAD

Scegliere la malattia da trattare: malattie che affliggono una persona o comune

oppure rara, trascurata o orfana. In Europa 30 milioni di persone sono afflitte da

malattie rare, e ce ne sono tante, le malattie trascurate sono quelle che trascurano, su

cui non investono, se viene trascurata, non abbiamo cure o farmaci, quindi è orfana di

qualcosa che non possiamo curare. Se la malattia è rara io non investo perché non ho

un ritorno, un esempio classico è la malaria, malattia che ha avuti dei picchi storici, ma

se consideriamo l’incidenza sui paesi occidentali è relativa, non è come altre patologie

più diffuse, è scattato il ritorno quando persone occidentali europee piuttosto che

americane andavano in questi paesi dove era più facile contrarla e se la portavano

indietro.

Per incentivare gli investimenti, a fine 2017 oltre 1000 principi attivi avevano assunto

lo status di orfano, avevano un’esclusività sul mercato di 10 anni.

Dopo aver scelto la malattia c’era anche l’individuazione del bersaglio, primo dato da

considerare è il bersaglio nei riguardi dei quali era possibile cercare la drugability. Il

bersaglio deve essere scoperto ma anche confermato, con la target validation, cioè

effettuando prove in vitro e in vivo, saggi ad alta portata ed efficienza… per identificare

e validare il bersaglio.

I bersagli nel 1999 erano circa 500, nel 2009 circa 18000…. e possono essere: recettori,

enzimi, ormoni e fattori di crescita, canali ionici, acidi nucleici…

Effetto biologico, messaggeri chimici, genetica molecolare… cioè devo individuare i

mediatori chimici (che sono molecole endogene), individuo il meccanismo e faccio

delle modificazioni per andare a bersagliare il target.

Specificità verso il bersaglio e selettività tra specie diverse, nel corpo umano e verso

tessuti e organi, quindi penso a come migliorare l’interazione tra molecola e bersaglio,

la molecola, però potrebbe interagire anche con gli “off-target” e comportare effetti

collaterali, quindi si rende necessaria la selettività verso un particolare sottotipo

recettoriale (si deve anche considerare che una molecola può agire su diversi recettori,

ciò può essere un vantaggio, come nel caso dei farmaci gemelli).

Come in questo contesto si innesta il ragionamento di colui che deve progettare

molecole? Una strategia per fare molecole direzionate è creare pro-farmaci con una

porzione carrier che determina il rilascio del principio attivo in situ, dove mi serve.

In tutto questo io ho la necessità di identificare il saggio biologico opportuno perché

devo prestare la massima attenzione a produrre i dati biologici preliminari in maniera

molto puntuale e fugare qualsiasi dubbio per la bontà dei saggi a disposizione. Quindi

in questo scenario mi muovo facendo delle prove iniziali in vitro e poi in vivo e

ripeterle per confrontare queste prove. Io quando ho il dato deve essere attendibile e

derivato in maniera tale che le varie prove effettuate non si discostino tanto tra loro,

devo avere un margine stretto.

Quindi va messo in atto un processo o originale o presente in letteratura, comunque

un processo standard che segue le evoluzioni del caso. Questa attendibilità può essere

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messa in relazione alla metodologia che metto in atto, rispetto anche all’operatore,

condizioni operative…

Le prove in vivo sono successive a quelle in vitro e ci andiamo quando quella molecola

ha un profilo degno di approfondimento e c’è da capire appunto anche in relazione ad

un bersaglio qual è la bontà di quella molecola, a seconda della patologia. Identifico la

molecola e ipotizzo in base alla relazione qualcosa sul bersaglio, la testo sia su topi

normali che con topi knok-out, ovvero senza quel determinato enzima e vedo, se è

come penso vado avanti.

Saggi ad alta portata ed efficienza (HTS)

Saggi basati sulla risonanza magnetica: si fa leva sui tempi di rilassamento dei vari

principi attivi, posso vedere se la molecola è legata alla proteina o meno facendo un

confronto tra gli spettri (prova in bianco e prova effettuata dopo la somministrazione).

Qualche volta si usa questa strategia perché io ovviamente posso anche andare ad

incrociare i dati, quindi uno dei difetti è che io posso avere anche dei falsi positivi,

risultati un po’ fuorvianti perché il risultato che ho attraverso l’NMR è più misero.

Oppure ho anche la possibilità di fare questo saggio anche non conoscendo la funzione

della proteina e in base a quello che mi viene fuori traggo le mie conclusioni.

Prima di andare nel dettaglio dell’identificazione, dobbiamo tenere a mente che non è

che se io cerco una strategia mi ci ancoro e finisce lì, alcune volte posso applicarne

anche più di una.

Identificare l’hit e il lead

- HTS (con screening a tappeto e mirato): è uno screening applicato a grandi

numeri, ho le potenzialità per ridurre i tempi. Se io riesco a testare le molecole in

tempi più ridotti è un vantaggio. I composti, sono sciolti in dimetilsolfossido,

vengono inseriti nelle piastre e poi sono inviati allo screening. È importante

considerare che queste soluzioni in DMSO sono diluite ad una concentrazione

prefissata con il tampone con cui si effettua il saggio, cioè standardizzate dalla

letteratura. Questi composti sono solitamente testati in duplicato alla stessa

concentrazione. In alternativa, essi possono essere testati a due concentrazioni

diverse. Faccio delle prove e poi confronto i risultati, almeno due prove devo

avere: o facendole alla stessa composizione o variandole. A quel punto, nel

momento in cui devo analizzare il dato sono in grado di selezionare quali sono le

molecole attive da quelle non. 4 5

Con l’HTS io posso testare con l’high throughput 10 -10 composti al giorno,

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mentre con il medium troughput 10 -10 composti al giorno.

I fattori di successo di un HTS:

1. Saggio biologico adatto.

2. Collezione di composti di alta qualità, essi possono derivare da composti

esclusivi sintetizzati nel corso degli anni o da composti commerciali acquistati

dai vari fornitori. Attraverso anche sintesi combinatorie, sono complementari.

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3. Capacità di screenare la collezione nel saggio biologico in modo rapido ed

efficace. Non dobbiamo affrettare i tempi, in maniera di non incorrere in

equivoci.

4. “filtrazione” della collezione dei composti prima dello screening per cercare di

evitare falsi positivi e che si possano presentare problemi di varia natura (es.

proprietà chimico-fisiche sfavorevoli, tossicità…).

5. Lo screening dovrebbe essere condotto in modo da contenere tempi e costi, se

io dilatassi troppo i tempi e dovrei investire troppi soldi, il gioco non varrebbe

la candela.

Come faccio allora ad identificare questi composti? Filtrarli eliminando ad

esempio gruppi tossici… i criteri sono: eliminare composti con pesi molecolari

superiori a 500, eliminare composti a bassa solubilità predetta e ad alta lipofilia e

infine eliminare composti che contengono epossidi, sulfonammidi, aldeidi,

isocianati… che potrebbero garantire tossicità o reattività.

Dopo lo screening dal database esce fuori una tabella, che riporta a quale

collezione appartengano, la % di inibizione di ogni composto, ho messo un valore

di riferimento, lui seleziona tutti quelli che passano la soglia. Successivamente da

questa lista occorre selezionare quali composti inviare alla riconferma che consiste

nella determinazione del valore di IC .

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La selezione può essere basata su: una % di soglia (cut off) di inibizione (> 60%) e

la % di inibizione che è statisticamente significativa. Quindi ottengo uno schema di

tutti gli hit confermati dopo valutazione dell’IC .

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Tra queste molecole vedo se questi hanno elementi strutturali simili, potrei avere

due scenari potenziali, seleziono molecole che hanno caratteristiche strutturali

simili, faccio un’analisi abbastanza approfondita. Andando a fare questa analisi

però mi imbatto in qualcosa che può comunque non essere drugable, non mi

soddisfano dal punto di vista strutturale, faccio delle selezioni. Si tratta una volta

scoperti questi hit di migliorare il profilo della molecola per ottenere dei lead.

Un problema dell’HTS potrebbe essere la presenza di inibitori non specifici o

promiscui, costituiti da molecole con proprietà peculiari che agiscono su bersagli

non propri e determinano dei falsi positivi.

Queste molecole possono anche formare degli aggregati di tipo colloidale che non

inibiscono l’enzima, ma interagiscono sequestrandolo, parlo sempre di inibizione,

però non è positiva perché l’azione che si produce è un sequestro, quindi quando

vado ad elaborare il dato questo non corrisponde al vero.

- Ligand- e structure- based drug design (abbiamo due momenti ben definiti e a

fronte di un ligando una molecola dalla quale partire con una struttura che è

quella del bersaglio da cui partire, possono essere due strade parallele che

possono anche incrociarsi). Per prendere in considerazione le possibilità che

abbiamo dobbiamo introdurre il termine “docking”, si tratta di metodi

computazionali per la predizione della struttura 3D di complessi proteina-ligando.

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È un insieme di tecniche che consentono di simulare le interazioni tra diversi

sistemi (es. una nuova molecola di inibitore con il sito attivo di un enzima) e di

valutare approssimativamente le nuove interazioni che si creano. Attraverso

questi metodi computazionali io simulo l’interazione ligando-bersaglio, dobbiamo

cogliere qual è il miglior modo per attuare questa interazione. La molecola si

dispone in maniera tale da cercare di interagire con gli aa fondamentali del

bersaglio, ho due situazioni: quella della molecola guest che può essere inserita

manualmente (cioè colloco dove voglio la molecola sempre al computer) e in

modo interattivo nella cavità dell’”host”, oppure tramite programmi automatizzati

che guidano alla ricerca di posizioni di minimo energetico reciproco.

Il ligando (rigido o flessibile) è posizionato in siti di legame generalmente rigidi.

Esso cambia la struttura tridimensionale in termini di angoli di torsione per trovare

il miglior adattamento spaziale ed energetico nel sito di legame della proteina. Il

modo corretto di legame è, perciò, trovato tramite il campionamento dello spazio

conformazionale attraverso la valutazione di funzioni (complementarietà tra

superficie; interazioni elettrostatiche ed idrofobiche) che stimano l’energia di ogni

combinazione conformazionale ligando-be