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Il+punto+debole+della+PIV+stereoscopica+è+la+calibrazione+perché+se+non+eseguita+correttamente+può+portare+ad+errori+di+

misura+notevoli.+Per+portarla+a+termine+si+utilizza+un+quadrato+nero+con+pallini+bianchi.+

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Per+quanto+riguarda+la+ricostruzione+3D+si+valuta+lo+stesso+punto+nella+due+immagini+acquisite+dalle+telecamere+e+note+

le+componenti+è+possibile+costruire+una+mappa+3D+dei+campi+di+moto.+

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8+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+–+Protesi+Cardiovascolari+

S V

TENT! ASCOLARI!

Lo+ stent+ è+ una+ struttura+ metallica+ cilindrica+ a+ maglie+ che+ viene+ introdotta+ negli+ organi+ a+ lume+ (cioè+ gli+ organi+ cavi+

propriamente+detti+o+visceri,+come+l'intestino,+oppure+i+vasi+sanguigni)+e+fatta+espandere+fino+a+che+il+suo+diametro+è+

pari+a+quello+del+lume.+In+questo+modo+si+può,+per+esempio,+ridurre+una+stenosi,+escludere+un+aneurisma+o+mantenere+

pervio+il+viscere.+

Le+cause+che+possono+portare+all'impianto+di+uno+stent+possono+essere+diverse:+

fumo,+pressione+sanguinea+alta,+tossine+che+causano+danni+all'endotelio+dei+vasi,+

• due+diversi+tipi+di+placche:+

• 1. ateromatose,+

2. fibrose+→+simili+alle+prime+ma+con+tessuto+fibroso.+ 3

Placca

Le+malattie+cardiache+e+gli+infarti+sono+la+maggior+causa+di+morte+nel+mondo+occidentale,+solo+nel+

2001+gli+scompensi+cardiaci+hanno+causato+la+morte+di+oltre+245+mila+persone+nel+Regno+Unito.+

Gli+infarti+si+hanno+quando+alcuni+vasi+coronarici,+che+hanno+compito+di+portare+nutrimento+al+cuore,+si+occludono+per+

cui+manca+perfusione+al+miocardio+e+la+parte+non+irrorata+necrotizza;+se+non+è+letale+è+possibile+riprendere+la+situazione+

riattivando+la+circolazione+con+diverse+tecniche.+

+

Per+consentire+il+passaggio+del+sangue+si+applicano+tecniche+di+rivascolarizzazione:+

bypass3(CABG):+il+cardiologo+anastomizza+la+vena+safena+in+un+punto+a+monte+ed+uno+a+valle++

• dell'occlusione+ così+ da+ ripristinare+ la+ perfusione.+ Uno+ svantaggio+ è+ il+ post^

operatorio+di+circa+una+decina+di+giorni;+

+ 3

CABG

angioplastica3(PTCA):+viene+incisa+o+l'arteria+femorale+o+la+brachiale+poi++

• con+una+guida+si+porta+in+posizione+il+palloncino+che+

viene+ gonfiato+ per+ dilatare+ il+ vaso,+ dopodiché+ il+

palloncino+ viene+ sgonfiato+ e+ rimosso.+ È+ una+

procedura+ poco+ invasiva+ che+ sfrutta+ sonde+

radiopache+ che+ possono+ essere+ guidate+ in+ loco+

attraverso+ l'utilizzo+ di+ strumenti+ radiologici.+

Esistono+ comunque+ complicazioni+ come:+ ristenosi+ 3

PTCA

che+ potrebbe+ portare+ alla+ ripetizione+ della+

procedura,+rottura+della+placca+e+conseguente+formazione+di+trombi+o+rotture+del+vaso.+

Il+vantaggio+è+la+possibilità+di+risolvere+un+problema+senza+operare+o+impiantare+nulla.+

+

impianto3di3stent:+analogamente+all'angioplastica+si+sfrutta+l'espansione++

• di+un+palloncino+per+far+aderire+la+struttura+a+maglia+alla+

stenosi+ dilatando+ così+ il+ vaso,+ il+ palloncino+ viene+

successivamente+ sgonfiato+ e+ rimosso+ lasciando+ in+ sede+

lo+ stent.+ Questa+ procedura,+ a+ differenza+

dell'angioplastica,+ permette+ di+ prevenire+ occlusioni+

gravi,+ha+un+30+^+50%+di+probabilità+in+meno+di+ristenosi+e+ 3

STENT

solitamente+ è+ seguita+ da+ poche+ ripetizioni+ della+

procedura+ di+ rivascolarizzazione.+ Possono+ essere+

impiantati+ in+ arterie+ coronariche,+ biforcazione+

carotidea,+arterie+renali,+femorali+e+possono+anche+

utili+per+contenere+aneurismi.+Recentemente+sono+

stati+ sviluppati+ stent+ a+ rilascio+ di+ farmaci+

antiproliferativi.+ Sono+ entrati+ nella+ pratica+ clinica+

dagli+ anni+ ’80+ ed+ il+ disegno+ serve+ per+ avere+

determinate+proprietà+meccaniche.+ 3

333333Placca33333>>3333333333Stent33333333>>333333Vaso3aperto

Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+–+Protesi+Cardiovascolari+ 9+

Bisogna+tenere+presente+quali+sono+le+quantità3d‘interesse+nel+momento+in+cui+si+progettano+le+maglie+di+uno+stent:+

1. biocompatibilità;+

2. le+ proprietà+ meccaniche+ non+ devono+ alterare+ le+ propriètà+ del+ vaso+ irrigidendolo+ o+ modificando+

l’emodinamica+locale.+Deve+resistere+alla+pressione+del+sangue+ed+essere+abbastanza+flessibilie+da+seguire+la+

parete+rimanendo+adeso.++

3. numero,+spessore+e+larghezza+delle+maglie,+

4. rapporto+di+distribuzione+tra+vuoti+e+pieni,+

5. confronto+della+condizione+di+vasodilatazione+a+riposo+o+massima,+

6. cambiamenti+della+geometria+dello+stent+dovuti+all’adattamento,+

7. bisogna+tenere+conto+delle+forze+di+taglio,+delle+velocità+e+delle+zone+di+ricircolo+

+

+

Quando+si+impianta+lo+stent,+questo+deve+coprire+tutta+la+lunghezza+della+placca+perché+se+fosse+della+stessa+misura+e+lo+

stent+si+accorciasse+la+parte+di+placca+scoperta+si+spaccherebbe;+se+la+placca+fosse+lunga,+invece,+si+utilizzazno+due+stent+

in+serie.+

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+

10+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+–+Protesi+Cardiovascolari+

+

+

+

Come+anticipato+in+precedenza+il+motivo+più+frequente+di+fallimento,+seppur+in+maniera+contenuta,+è+la+ristenosi+ovvero+

il+restringimento+del+vaso.+Si+possono+anche+verificare+delle+stenosi+interne+allo+stent+favorite+da:+

adesione+di+fibrina,+trombi+alla+struttura+dello+stent;+

• fumo,+disordini+metabolici,+diete+eterogenee,+

• diametri+del+lume+ritdotti,+

• disturbi+del+flusso+all’interno+dello+stent.+

+

Un+ ulteriore+ problema+ da+ tenere+ in+ considerazione+ è+ il+ DISACCOPPIAMENTO3 MECCANICO3 STENT>VASO+ perché+ al+

momento+ dell’impianto+ la+ compliance+ al+ centro+ del+ vaso,+ nella+ zona+ dello+ stent,+ potrebbe+ diminuire+ bruscamente+

causando+una+diversa+fluidodinamica+con+ripercussioni+sulle+onde+pressorie.+

Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+–+Protesi+Cardiovascolari+ 11+

!

B IOREATTORI'PER'L’INGEGNERIA'TISSUTALE'

E"PER!LA#MEDICINA#RIGENERATIVA!

Prof.ssa+Diana+Massai+ + + mail:+diana.massai@polito.it+

+

Queste+discipline+si+basano+sull’utilizzo+di+cellule,+materiali+e+metodi+ingegneristici,+fattori+chimici+o+fisico3chimici+per+

migliorare+ funzioni+ biologiche+ o+ riparare+ le+ funzionalità+ di+ tessuti.+ Si+ tratta+ di+ strategie+ terapeutiche+ quindi+ volte+ alla+

cura+del+paziente.+Al+momento+attuale+se+un+organo+non+funziona+lo+si+trapianta+con+i+problemi+di+immunoreazione+che+

ne+conseguono.+

Il+ compito+ dell’ingegneria+ dei+ tessuti+ è+ rigenerare+ in+ vitro+ quella+ parte+

malfunzionante+per+poi+impiantarla.+Si+prendono+le+cellule,+si+mettono+su+

uno+ scaffold+ che+ tipicamente+ è+ tridimensionale+ e+ il+ tutto+ si+ pone+ in+ un+

ambiente+di+coltura+in+cui+aderiscono+allo+scaffold+stesso+e+cominciano+a+

proliferare,+cioè+a+riprodursi+col+fine+di+generare+una+parte+particolare+di+

tessuto+ d’interesse.+ Il+ tessuto+ formato+ sarà+ poi+ impiantato+ nella+ zona+

interessata+per+sostituire+quello+nativo.+

Esempio:+ la+ parte+ del+ miocardio+ che+ si+ trasforma+ in+ cicatrice+ dopo+ un+

infarto+ non+ riesce+ più+ a+ contrarsi+ e+ a+ funzionare+ correttamente+

provocando+delle+disfunzioni+nel+tempo+come+ingrossamento+del+cuore+o+

disfunzione+dei+ventricoli.+

+

Le+componenti+utilizzate+solitamente+sono:+

cellule+(autologo,+cellule+staminali,+...)+

• matrici+(scaffold)+porose+e+costituite+da+biomateriali+riassorbibili,+possono+servire+a+regolare+la+funzione+delle+

• cellule+prima+del+loro+impianto+

regolatori+di+diverso+tipo:+

• chimico:+ad+esempio+fattori+di+crescita+

o meccanico:+ad+esempio,+il+carico+meccanico+e+condizioni+di+flusso+in+vitro++

o (bioreattori)+

+

Ingegneria-Dei-Tessuti

+(TE)+→+rigenerazione+in+vitro+

L'obiettivo+dell’ingegneria+dei+tessuti+è+produrre+il+tessuto+pienamente+formato+in+vitro+mediante+inseminazione+di+

cellule+in+una+matrice+in+biomateriale,+e+successivamente+impiantarlo+nel+corpo.+

+

Medicina-Rigenerativa +(RM)+→+rigenerazione+in+vivo+

A+differenza+dell’ingegneria+dei+tessuti,+in+questo+caso,+la+matrice+biocompatibile+è+impiantata+nel+corpo+con+o+senza+

cellule+seminate+per+facilitare+la+rigenerazione+del+tessuto+in+vivo.+

Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 13+

BIOREATTORI (

Sono+ strumenti+ progettati+ per+ riprodurre+ in+ vitro+ condizioni+ il+ più+ possibile+ simili+ a+ quelle+ fisiologiche+ dei+ tessuti+ nei+

quali+ si+ sviluppano+ processi+ biologici+ e+ biochimici+ in+ condizioni+ strettamente+ controllate+ e+ monitorate+ come,+ ad+

esempio+rimozione+pH,+temperatura,+pressione,+alimentazione+nutrienti+e+scarti.+

Esempio:+la+ricostruzione+del+tessuto+cardiaco+in+vitro+→+le+cellule+del+cuore+sono+continuamente+sottoposte+a+stimoli+

meccanici+ di+ trazione.+ Nel+ cuore+ ci+ sono+ i+ potenziali+ elettrici+ per+ cui+ in+ vitro+ bisogna+ riprodurre+ anche+ il+ passaggio+ di+

questi+in+tutte+le+direzioni.+

+

i+bioreattori+sono+generalmente+utilizzati+in:+

trattamento+delle+acque+reflue,+

• nei+processi+di+fermentazione+industriale,+

• trasformazione+dei+prodotti+alimentari,+

• produzione+di+prodotti+farmaceutici,+

• proliferazione-delle-cellule,-

• ingegneria-dei-tessuti-e-medicina-rigenerativa,-

• -

ed+hanno+due+ruoli+principali:+

1. ingegneria+dei+tessuti+biologici+in+vitro+(ingegneria+tissutale+di+pelle,+tendini,+vasi+sanguigni,+cartilagine,+osso,+...)+

2. fornitura+di+modelli+di+supporto+all’indagine+sulle+funzioni+cellulari+e+di+sviluppo+del+tessuto.+

+

Come+detto+in+precedenza+il+contenuto+del+bioreattore+deve+poter+essere:+

monitorato:+il+dispositivo+deve+permettere+di+misurare+alcuni+parametri+fondamentali+al+processo+di+crescita+-

• quali+il+pH,+la+temperatura,+la+pressione+parziale+dell’ossigeno+ecc.,+per+questo+richiede+sensori+di+

monitoring;+

controllato:+tramite+un+computer+sono+rilevati+i+parametri+e+si+decide+se+sono+corretti,+in+caso+negativo+deve+-

• essere+possibile+riportarli+ai+valori+corretti+(anche+con+feedback+in+tempo+reale).+

Un+bioreattore+ottimale+è+dotato+di+entrambi+i+sistemi+descritti+sopra.+

In+aggiunta+alle+2+caratteristiche+sopra+elencate,+un+bioreattore+deve+essere+in+grado+di:+

fornire-di-stimoli+(chimico,+meccanico,+sforzo+di+taglio,+elettrico,+...),+

• automazione-completa.-

+

Controllando+specifici+parametri+fisico3chimici+della+cultura+a+livelli+definiti,+un+bioreattore+fornisce+i+mezzi+tecnologici+

per+ eseguire+ studi+ controllati+ finalizzati+ alla+ comprensione+ di+ specifici+ effetti+ biologici,+ chimici,+ fisici+ sulle+ funzioni+

cellulari+di+base+in+una+disposizione+spaziale+3D.+

I+bioreattori+evitano+con+successo+la+mancanza+di+precisione+dei+tradizionali+metodi+manuali+e+permettono+la+ripetibilità+

quando+si+guida+lo+sviluppo+di+costrutti+efficaci,+strutturalmente+omogenei+e+funzionalmente+ingegnerizzati.+

+

14+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+

Come+tutti+i+dispositivi+in+circolazione,+anche+i+bioreattori+devono+superare+i+controlli- di- qualità+non+solo+per+le+loro+

funzionalità+ma+anche+per+i+materiali+con+cui+sono+progettati.+Più+un+processo+di+produzione+è+automatizzato,+maggiore+

sarà+la+ripetibilità+del+processo+stesso.+

Il+controllo+di+qualità+è+un+processo+attraverso+il+quale+è+esaminata+la+qualità+di+tutti+i+fattori+coinvolti+nella+produzione,+

al+fine+di+rendere+la+produzione+controllata+e+la+più+sicura+possibile.+

+

La+ Good- Manufacturing- Practice+ è+ parte+ di+ un+ sistema+ di+ controllo+ qualità+ che+ copre+ la+ produzione+ e+ la+

sperimentazione+di+forme+di+dosaggio+farmaceutiche+o+farmaci+e+principi+attivi+farmaceutici,+la+diagnostica,+gli+alimenti,+

i+ prodotti+ farmaceutici+ e+ i+ dispositivi+ medici+ (compresi,+ quindi,+ i+ tessuti+ ingegnerizzati+ e+ prodotti+ di+ medicina+

rigenerativa).+

+

I+principali+obiettivi+della+GMP+sono:+

l’elevata+ripetibilità+del+processo+di+fabbricazione,+

• l’assenza+di+difetti+nei+prodotti.+

+

+

+

+

+ CLASSIFICAZIONE(DEI(BIOREATTORI(

!

Una+ prima+ macro+ classificazione+ dei+ bioreattori+ è+ relativa+ alla+ necessità+ di+ essere+ posizionati+ all’interno+ di+ un+

incubatore+o+meno:+

bioreattori-incubati+→+bioreattori+che+devono+essere+situati+in+un+incubatore,+il+problema+possono+essere+i+tubi++

• +di+fluido+che+devono+uscire+anche+dagli+incubatori,+

+

bioreattori-auto?incubati+→+bioreattori+in+grado+di+controllare+autonomamente+i+parametri+della+cultura,+senza++

• ++un+incubatore.+

+

+

+

+

+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 15+

Incubatori(

!

Un+incubatore+è+un'apparecchiatura+in+cui+le+condizioni+ambientali+di+temperatura,+umidità,+ossigeno+e+tassi+di+biossido+

di+carbonio,+possono+essere+controllate.+Non+necessariamente+devono+essere+sterili+

È+generalmente+utilizzato+in+qualsiasi+procedimento+biochimico+che+ha+bisogno+di+stabilità+nei+parametri+ambientali+(ad+

esempio+la+produzione+di+prodotti+farmaceutici,+batterica+culture,+uova+da+cova+artificiali+o+che+fornisca+le+condizioni+

adeguate+per+una+reazione+chimica+o+biologica).+

- BIOREATTORI(AUTOINCUBATI(

!

I+bioreattori+auto3incubati+non+necessitano+di+un+incubatore.+Il+controllo+dei+parametri+viene+gestito+da+un+sistema+di+

controllo+interno,+devono+essere+rigorosamente+sigillati+per+evitare+contaminazioni.+

+

Una+classificazione+dettagliata+dei+bioreattori+può+essere+la+seguente:+

Bioreattori+non+fisiologici,+prima+forma+di+bioreattori+che+mira+a+

Spinner+Flask,+

• migliorare+la+coltura+classica+delle+cellule+di+laboratorio+

bioreattori+a+pareti+rotanti,+

• !

bioreattori+per+trazione+/+compressione,++

• Bioreattori+fisiologici,+forme+avanzate+di+bioreattori+

bioreattori+a+pressione+idrostatica,+

• che+mirano+a+riprodurre+l'ambiente+fisiologico+

bioreattori+a+flusso+di+perfusione.+

• !

+

Alcune+di+queste+caratteristiche+possono+essere+combinate+per+dare+origine+a+bioreattori+combinati.+

+ Spinner-Flask-

o

In+un+bioreattore+a+“fiasche”,+gli+scaffold+sono+fissati+e+potrebbero+essere+

sospesi+ alla+ fine+ di+ aghi+ in+ una+ “fiasca”+ di+ liquido+ di+ coltura+ mentre+ un+

agitatore+magnetico+(o+simili)+mescola+il+medium.+

Il+ flusso+ sulla+ superficie+ degli+ scaffold+ è+ vorticoso+ e+ nei+ pori+ superficiali+

degli+scaffold+stessi+per+cui+sfruttando+i+vortici,+il+fluido+riesce+a+portare+il+

nutrimento+all’interno+degli+scaffold.+

In+ genere+ le+ “fiasche”+ hanno+ un+ volume+ di+ circa+ 120+ ml+ (anche+ se+ sono+

stati+utilizzate+fiasche+molto+più+grandi,+fino+a+8+litri),+ruotano+a+50+–+80+

giri/minuto+ e+ il+ 50%+ del+ medium+ utilizzato+ in+ esse+ viene+ cambiato+ ogni+

due+giorni,+mantengono+al+5%+il+livello+di+CO +e+tra+95+–+100%+l’umidità.+

2

+

VANTAGGI:+facile+da+usare,+basso+costo+(1803700+euro+nel+2011),+leggero++

miglioramento+rispetto+alla+cultura+statica+(dischi+di+Petri).+

+

SVANTAGGI:+il+trasferimento+di+massa+nelle+“fiasche”+non+è+sufficiente+a+fornire+una+distribuzione+omogenea+delle++

cellule+su+tutti+gli+scaffold+per+cui+le+cellule+risiedono+principalmente+nella+periferia+del+costrutto+(costrutti+

di+ cartilagine+ coltivati+ hanno+ raggiunto+ spessori+ di+ 0,5+ mm,+ troppo+ sottili+ per+ uso+ clinico),+ sono+ critici+ i+

valori+delle+tensioni+di+taglio+che+potrebbero+danneggiare+le+cellule.+

+

Esistono+ bioreattori+ spinner+ flask+ a+ parete+ ondulata,+ la+ cui+ forma,+ è+ stato+

dimostrato,+ migliora+ la+ coltivazione+ del+ tessuto+ cartilagineo+ (parametri+ chiave:+

tempo+ di+ miscelazione,+ la+ distribuzione+ del+ tempo+ di+ contatto+ con+ lo+ scaffold,+ e+

concentrazione+di+ossigeno+disciolto).+

+

16+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+

Bioreattori-a-pareti-rotanti-

o

In+un+bioreattore+a+pareti+rotanti,+le+pareti+della+camera+di+coltura+ruotano+fornendo+

una+forza+idrodinamica+verso+l'alto+che+bilancia+la+forza+gravitazionale+verso+il+basso,+

mantenendo+nel+mezzo+lo+scaffold.+

Il+trasporto+di+fluidi+è+migliore+e+questi+dispositivi+garantiscono+una+distribuzione+più+

omogenea+delle+cellule+rispetto+ad+una+cultura+statica.+

Il+bioreattore+ruota+a+una+velocità+di+15+–+30+giri/minuto,+ma+al+crescere+del+tessuto+

nel+ bioreattore,+ la+ velocità+ di+ rotazione+ deve+ essere+ aumentata+ per+ equilibrare+ la+

forza+ gravitazionale+ e+ garantire+ allo+ scaffold+ di+ rimanere+ in+ sospensione.+

I+sistemi+di+bioreattori+a+pareti+rotanti,+utilizzano+recipienti+(10+ml+o+50+ml)+di+coltura+

monouso,+sono+a+basso+costo+e+facili+da+usare.+

+

+

+

+ BIOREATTORI(FISIOLOGICI(

!

I+bioreattori-fisiologici,+come+detto+in+precedenza,+mirano+a+riprodurre+le+condizioni+ambientali+in+cui+i+tessuti+verranno+

impiantati+una+volta+finita+la+coltura.+Le+cellule,+“sentendo”+stimoli+sono+portate+a+differenziarsi+in+modo+da+rispondere+

allo+stimolo+stesso.+

+ Bioreattori-per-compressione-

o

Questa+classe+di+bioreattori+è+generalmente+utilizzata+nell’ingegneria+tissutale+della+

cartilagine+ e+ dell'osso.+ In+ generale,+ sono+ costituiti+ da+ un+ motore,+ un+ sistema+ che+

fornisce+ movimento+ lineare,+ e+ un+ meccanismo+ di+ controllo+ che+ permette+ di+

applicare+un+carico+sia+statico+sia+dinamico.+

Utilizzano+un+generatore+di+segnale+per+controllare+il+sistema+e+celle+di+carico+per+

misurare+la+risposta+di+carico.+

+

+

+

+

+

+ Bioreattori-per-trazione-

o

Bioreattori+per+deformazione+a+trazione+sono+utilizzati+per+progettare+diversi+tipi+di+tessuto+tra+cui+tendini,+legamenti,+

muscoli+scheletrici+e+il+muscolo+cardiaco.+

Alcuni+ disegni+ sono+ molto+ simili+ ai+ bioreattori+ a+ compressione,+

differiscono+solo+nel+modo+con+cui+è+trasferita+la+forza+al+costrutto+

che,+in+questo+caso,+è+allungato+all'interno+del+bioreattore.+

Invece+di+lastre+piane,+come+in+un+bioreattore+di+compressione,+in+

questo+ tipo+ di+ dispositivo+ è+ necessario+ un+ sistema+ di+ afferraggio+

dello+ scaffold+ affinchè+ la+ forza+ di+ trazione+ possa+ essere+ applicata,+

ciò+ viene+ ottenuto+ utilizzando+ grip+ zigrinate.+ Il+ difficile+ è+ creare+

afferraggi+ che+ non+ rompano+ il+ campione+ quando+ lo+ bloccano+ o+

durante+le+stimolazioni.+

Dato+ che+ è+ possibile+ il+ loro+ utilizzo+ anche+ per+ la+ produzione+ di+

muscoli+ scheletrici+ o+ cardiaci,+ possono+ essere+ dotati+ di+ elettrodi,+

così+ da+ simulare+ l'effetto+ della+ placca+ neuromuscolare,+ al+ fine+ di+

“allenare”+le+cellule+alla+contrazione+sincrona+in+risposta+ad+uno+stimolo+elettrico.+

+

+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 17+

Bioreattori-a-pressione-idrostatica-

o

I+bioreattori+a+pressione+idrostatica+sono+un+caso+particolare+di+

bioreattori+di+compressione.+

Una+camera+di+coltura+riempita+di+medium+è+compressa+da+un+

pistone+ contro+ un’interfaccia+ completamente+ sigillata.+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ Bioreattori-a-perfusione-di-flusso-

o

I+bioreattori+a+perfusione+di+flusso+sono+generalmente+costituiti+da+una+pompa+e+

una+ camera+ scaffold+ unite+ da+ tubo.+ Lo+ scaffold+ è+ mantenuto+ in+ posizione+

attraverso+il+percorso+di+flusso+del+dispositivo.+Il+medium+è+perfuso+attraverso+lo+

scaffold,+migliorando+così+il+trasporto+di+fluidi.+Bioreattori+a+perfusione+di+flusso+

sono+ utilizzati+ sia+ per+ il+ tessuto+ compatto+ (osso,+ cartilagine)+ sia+ per+ il+ tessuto+

cardiovascolare+(vasi+sanguigni,+valvole+cardiache).+

+

+

+

+

+

+

+

+

Un’ultima+classificazione+possibile+dei+bioreattori+è+basata+sul+numero+di+camere+a+disposizione:+

mono?camera+→+bioreattori+con+una+sola+camera+di+coltura,+

• multicamera+→+bioreattori+con+più+di+una+camera+di+coltura+in+parallelo.+

+

Con+bioreattori+mono3camera+è+consentito+un+solo+campione+di+coltura,+ma+sono+meno+costosi+sia+da+realizzare+sia+da+

comprare.+ D'altra+ parte,+ non+ sono+ adatti+ per+ produzione+ di+ massa+ e,+ quando+ vengono+ utilizzati+ per+ esperimenti+ di+

laboratorio,+ sono+ necessarie+ diverse+ colture+ in+ serie+ per+ ottenere+ risultati+ statisticamente+ significativi.+

I+multi3camera,+invece,+consentono+cultura+diversa+campione+in+parallelo,+sono+più+costosi+(ma+l'aumento+di+prezzo+è+

non+ è+ lineare,+ un+ bioreattore+ a+ doppia+ camera+ non+ costa+ il+ doppio+ di+ uno+ mono3camera),+ e+ permettono+ una+

produzione+di+massa+con+conseguenti+risultati+statisticamente+significativi+in+una+sola+cultura.+

18+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+

REQUISITI(DI(PROGETTAZIONE(

!

Un+bioreattore+deve+essere+un+passaggio+chiave+nella+produzione+di+tessuti+ingegnerizzati+perché+rappresenta+la+base+

dell'industrializzazione+ presente+ e+ il+ futuro+ dei+ tessuti+ ingegnerizzati+ stessi.+ I+ processi+ industriali+ devono+ essere+ il+ più+

possibile+ sicuri,+ stabili,+ scalabili+ (in+ due+ sensi,+ produzione+ su+ scala+ e+ adattamento+ delle+ dimensioni)+ e+ convenienti.+

Per+questi+motivi,+il+primo+fondamentale+requisito+è:+

LA+PROGETTAZIONE+DI+UN+BIOREATTORE+DEVE+ESSERE+LA+PIÙ+SEMPLICE+POSSIBILE+

In+ generale,+ in+ ogni+ problema+ d’ingegneria,+ una+ soluzione+ più+ complicata+ del+ problema+ non+ è+ una+ soluzione.+

I+bioreattori+sono,+in+generale,+progettati+per+eseguire+le+seguenti+cinque+funzioni:+

fornire+distribuzione+uniforme+delle+cellule,+

• mantenere+la+concentrazione+desiderata+di+gas+e+nutrienti+nel+fluido+di+coltura,+

• favorire+il+trasporto+di+massa+al+tessuto+ingegnerizzato,+

• esporre+i+tessuti+agli+stimoli+fisici+voluti,+

• monitorare+la+formazione+del+tessuto+ingegnerizzato.+

+ Scelta-dei-materiali+

o

La+scelta+dei+materiali+è+fondamentale+in+quanto+quelli+utilizzati+per+creare+il+bioreattore+non+devono+suscitare+alcuna+

reazione+avversa+del+tessuto+coltivato.+Qualsiasi+materiale+che+è+in+contatto+con+il+mezzo+deve+essere+biocompatibile+al+

punto+da+

non+indurre+una+risposta+infiammatoria,+

• resistere+alla+colonizzazione+batterica.+

+

L’ente+ americano+ Food+ and+ Drug+ Administration+ (FDA)+ classifica+ i+ materiali+ con+ diversi+ "gradi"+ in+ base+ al+ livello+ di+

tossicità+ e+ rilascio+ di+ detriti+ che+ producono+ quando+ si+ trovano+ in+ un+ particolare+ ambiente+ o+ in+ una+ particolare+

applicazione.+

I+due+“gradi”+che+interessano+la+produzione+di+un+bioreattore+sono:++

“Food+Grades”+→+un+materiale+assolutamente+non3tossico,+adatto+per+essere+in+contatto+con+il+cibo+per++

• alimentazione+umana,+

“Medical+Grades”+→+un+materiale+atossico+la+cui+dispersione+di+detriti+è+così+bassa+che+può+essere+utilizzato+per++

• la+chirurgia+o+può+essere+impiantato.+

+

Secondo+ la+ classificazione+ FDA,+ i+ materiali+ utilizzati+ in+ un+ bioreattore+ devono+ essere+ almeno+ “Food+ Grades”,+ se+ non+

fosse+possibile+utilizzare+materiali+di+qualità+medicale.+

La+ camera+ di+ coltura+ di+ un+ bioreattore+ deve+ essere+ un+ ambiente+ sterile+ perché+ la+ coltura+ cellulare+ non+ deve+ essere+

contaminata+ da+ batteri,+ il+ più+ trasparente+ possibile+ al+ fine+ di+ consentire+ il+ controllo+ visivo+ degli+ esperimenti+ e+

l'eventuale+utilizzo+di+strumentazione+di+imaging+per+il+monitoraggio.+

Tutte+le+componenti+del+bioreattore+devono+essere+sterilizzabili.+

+

Riassumendo,+un+materiale+scelto+per+la+progettazione+di+un+bioreattore:+

deve+essere+biocompatibile+(per+uso+alimentare+o+medico),+

• deve+sopportare+il+metodo+di+sterilizzazione+che+l'utente+finale+adotterà,+

• deve+lavorare+facilmente+a+37+°+C,+in+atmosfera+umida+(953100%)+o+in+condizioni+di+bagnato+(immerso+in+terreni+

• di+coltura)+

+ METODI(DI(STERILIZZAZIONE(

! Autoclave-a-vapore-

o

La+ sterilizzazione+ avviene+ riponendo+ il+ bioreattore+ in+ un’autoclave+ che+ sterilizza+ con+

vapore+a+121+°C+per+15+minuti+o+134+°C+per+3+minuti+

Questo+metodo+è+di+facile+utilizzo,+largamente+diffuso+e+molto+economico.+

+

+

+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 19+

Sterilizzazione-a-secco-

-

o

È+ una+ modalità+ di+ sterilizzazione+ basata+ su+ shock+ termici,+ la+ procedura+ può+ essere+

condotta+a+160+°C+per+2+ore+o+190+°C+per+6+minuti.+

Anche+in+questo+caso+è+di+facile+utilizzo,+largamente+diffusa+e+molto+economica.+

+

+

+

+ Ossido-di-Etilene-

o

La+ modalità+ di+ sterilizzazione+ mediante+ EtOx+ prevede+ l’utilizzo+ di+ un+ gas+ tossico+ e+

permette+ di+ sterilizzare+ quei+ materiali+ che+ non+ sopportano+ le+ alte+ temperature+ dei+

procedimenti+precedenti.+

Proprio+ per+ la+ sua+ particolarità+ è+ utilizzata+ negli+ ospedali+ e+ nei+ grandi+ laboratori,+ è+

una+tecnica+molto+costosa.++

+

+

+ Radiazioni-

o

Questo+ tipo+ di+ sterilizzazione+ utilizza+ raggi+ γ,+ raggi+ X,+ UV+ e+ microonde+

(tranne+ per+ i+ metalli!!)+ e+ viene+ eseguita+ solamente+ in+ impianti+ di+

sterilizzazione+su+vasta+scala+e+su+un+gran+numero+di+pezzi.+

+

+ +

+

+

+

Quindi,+riassumendo:+

se+il+bioreattore+ha+componenti+in+metallo,+l'unico+requisito+è+necessario+da+prendere+in+considerazione+è+il+suo+

• grado+(alimentare/medico),+tutti+i+metalli+sono+adatti+a+qualsiasi+metodo+di+sterilizzazione+tranne+le+microonde,+

mentre+se+è+composto+da+materiali+polimerici:+

se+ il+ vostro+ bioreattore+ deve+ essere+ sterilizzabile+ in+ autoclave,+ il+ polimero+ scelto+ deve+ essere+ di+ grado+

• alimentare/medico+e+deve+essere+in+grado+di+resistere+almeno+ad+ambiente+umido+con+temperatura+di+121+°+C,+

se+il+bioreattore+deve+essere+sterilizzato+a+secco,+il+polimero+scelto+deve+essere+di+grado+alimentare/medico+e+in+

• grado+di+resistere+almeno+a+160+°+C+in+ambiente+secco.+

+

Ci+sono+anche+altri+requisiti+di+progettazione+che+è+bene+rispettare+per+la+progettazione+di+un+bioreattore+efficiente+ed+

al+tempo+stesso+di+facile+utilizzo:+

evitare+ l'introduzione+ di+ recessi+ di+ lavorazione+ che+ potrebbero+ raccogliere+ vapore+ condensato+ durante+ la+

• sterilizzazione+in+autoclave+e+diventare+terreno+di+coltura+per+i+microrganismi,+

rapido+da+montare+e+smontare+(evitando+viti,+bulloni,+...),+

• dimensioni+abbastanza+piccole+da+entrare+in+un+incubatore+quando+richiesto,+

• nel+ caso+ in+ cui+ si+ lavori+ con+ fluidi+ evitare+ problemi+ dovuti+ a+ perdite+ delle+ guarnizioni+ e,+ quando+ queste+ sono+

• necessarie+una+buona+progettazione+dovrebbe+diminuire+i+problemi+relativi+ad+esse.+

Se+un+è+stato+progettato+un+bioreattore+prototipo,+è+utile+pensarlo+su+scala+fin+dall'inizio+(progettazione+di+un+

• dispositivo+ semplice+ da+ ingrandire+ senza+ cambiare+ le+ sue+ caratteristiche+ o+ la+ progettazione+ di+ un+ semplice+

dispositivo+in+cui+sia+possibile+coltivare+molti+scaffold+contemporaneamente).+

+

+

+

+

+

+

+

20+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+

TECNICHE(DI(FABBRICAZIONE(

!

Le+tecniche+comunemente+utilizzate+per+ottenere+le+componenti+dei+bioreattori+sono+3:+

fresatura+→+patendo+da+un+materiale+solido+pieno+permette+di+ottenere+parti+con++

• forma+e+geometria+molto+complessa+a+partire+da+un+disegno+CAD+e+con+

buona+ precisione+ di+ taglio+ (circa+ 25+ μm);+ in+ questa+ tecnica+ il+ pezzo+ è+

fermo+e+la+fresa+si+muove+guidata+da+un+sistema+a+controllo+numerico,++

+

tornitura+→+anche+in+questo+caso,+a+partire+da+materiali+solidi+e+pieni,+si+ottengono++

• forme+ assialsimmetriche+ facendo+ ruotare+ velocemente+ il+ pezzo+ attorno+ al+

suo+asse+e+spostando+il+tagliente,+

+

+

+

+

stampaggio+ad+iniezione+→+è+un+processo+di+fabbricazione+per+la++

• produzione+ di+ componenti++

termoplastiche+ o+ termoindurenti;+

adatta+per+produzione+su+larga+scala.+

+

+

+ MONITORAGGIO(DEL(CONTENUTO(

!

Gli+obiettivi+del+monitoraggio+della+cultura+nei+bioreattori:+

analisi+del+processo+di+cultura,+

• comprensione+dei+meccanismi+fisici+e+biochimici+alla+base+dello+sviluppo+del+tessuto,+

• implementazione+di+strategie+con+feedback+di+controllo+volte+ad+ottimizzare+la+progressione+della+cultura,+

• automazione+e+scalabilità+della+produzione+dei+tessuti.+

Il+ monitoraggio,+ per+ esempio,+ della+ pressione+ parziale+ di+ ossigeno+ (O )+ e+ di+ anidride+ carbonica+ (CO )+ nel+ mezzo+ di+

2 2

coltura,+ delle+ concentrazioni+ di+ glucosio+ e+ lattato,+ permettono+ la+ valutazione+ quantitativa+ del+ comportamento+

metabolico+delle+cellule+in+coltura,+sostituendo+così+la+soggettività+e+conclusioni+qualitative+tradizionalmente+ottenute+

semplicemente+osservando+il+colore+del+medium.+

Sulla+base+di+tali+informazioni,+è+quindi+possibile+mettere+in+atto+strategie+(ad+esempio,+l'iniezione+di+medium+fresco+o+

supplementi,+la+modifica+della+portata+media+in+bioreattori+di+perfusione)+finalizzate+ad+adattare+l'ambiente+dinamico+

della+cultura+allo+stato+di+sviluppo+del+costrutto+ingegnerizzato.+

Usando+metodi+di+rilevamento,+è+possibile+progettare+un+sistema+automatizzato+di+controllo+o+la+progettazione+di+un+

software+appropriato.+

In+ generale+ i+ parametri+ fondamentali+ che+ devono+ essere+ adeguatamente+ monitorati+ e+ controllati+ durante+ la+

maturazione+in+vitro+tessuto+possono+essere+classificati+in+due+categorie+principali:+

i+parametri+del+milieu+e+

• i+parametri+del+costrutto.+

• + Milieu- Costrutto-

PARAMETRI-FISICI- temperatura,+pressione,+portata+ rigidezza,+resistenza,+permeabilità+

pH,+O +e+CO +disciolti,+contaminanti+chimici,+e+

2 2

PARAMETRI- composizione+dello+scaffold+e+della+matrice+

la+concentrazione+dei+metaboliti+/+cataboliti+

CHIMICI- extracellulare+di+sviluppo+

quali+glucosio,+lattato,+o+proteine+secrete+ numero+di+cellule+e+di+tasso+di+proliferazione,+

PARAMETRI- contaminazione+batterica+(sterilità)+ la+concentrazione+di+proteine+intracellulari,+e+

BIOLOGICI- !

la+vitalità+cellulare

Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 21+

SENSORI(PER(IL(MONITORAGGIO(DEL(MILIEU (

!

I+requisiti+di+progettazione+di+un+sensore+per+il+monitoraggio+del+milieu+sono:+

piccole+dimensioni,+

• una+durata+di+diverse+settimane,+altrimenti+non+sono+sufficientemente+a+basso+

• costo+da+smaltire+o+sostituire+nel+corso+della+coltura,+

una+ risposta+ stabile+ nel+ tempo,+ poiché+ la+ calibrazione+ ripetuta+ può+ essere+

• difficile+ da+ eseguire+ a+ causa+ della+ limitata+ accessibilità+ ai+ sensori+ durante+ la+

coltura.+

!

I+sensori+per+il+monitoraggio+del+milieu+possono+essere+classificati+in+tre+categorie+a+seconda+della+posizione+della+sonda+

di+rilevamento+rispetto+alla+camera+di+coltura+del+bioreattore:+

Invasivi+→+il+sensore+è+posizionato+direttamente+all'interno+della+camera+di++

• coltura+ del+ bioreattore,+ o+ immerso+ nel+ fluido+ di+ coltura+ o+ in+

contatto+ diretto+ con+ il+ costrutto.+ I+ sensori+ invasivi+ devono+ essere+

sterili+ e+ quindi+ o+ monouso+ o+ in+ grado+ di+ sopportare+ ripetute+

sterilizzazioni.++

VANTAGGI:+elevata+precisione+ed+accuratezza+ottenuto+con+la++

misura.+

SVANTAGGI:+costo+elevato+potenziale+di+sensori+e+taratura+difficile.+

I+ più+ comuni+ sensori+ invasivi+ sono+ basati+ su+ principi+

ottici+e+elettrochimici:+

sensori+basati+su+fibre+ottiche+a+fluorescenza+(ossigeno+disciolto+e+pH),+

• sensori+ elettrochimici,+ ovvero+ membrane+ funzionalizzate+ con+ enzimi+

• appropriati+per+la+rivelazione+di+glucosio+o+lattato+

+ Non?invasivi+→+il+sensore+non+è+in+contatto+con+l'interno+della+camera+di+coltura+ma+è+in+grado+di+misurare++

• parametri+ attraverso+ la+ parete+ bioreattore.+ Sensori+ non+ invasivi+ sono+ solitamente+ basati+ su+

ultrasuoni+o+su+metodi+ottici+quali+spettrofotometria+o+fluorimetria.++

Ciò+ evita+ i+ problemi+ associati+ alla+ sterilità+ dei+ sensori+ invasivi,+ ma+ implica+ che+ la+ parete+

bioreattore+debba+essere+interamente+o+localmente+trasparente.+

A+causa+della+presenza+di+un+materiale+intermedio+tra+la+sonda+e+l'oggetto+di+interesse,+sono+più+

difficili+da+ottenere+un’elevata+specificità+e+sensibilità.+ +

+ .!

Indiretti+→+direttamente+sui+terreni+di+coltura,+ma+tramite+mezzi+di+campionamento Le+due+opzioni+principali++

• !

sono: analisi+offline,+viene+effettuato+un+campionamento+del+medium+manuale+o+automatico+

• on3line+(con+possibili+implicazioni+negative+per+la+sterilità+del+sistema+chiuso)+e+le+analisi+

sono+ condotte+ con+ strumenti+ comuni+ per+ l’analisi+ biologica+ (ad+ esempio,+ analizzatori+

!

gas+nel+sangue)

shunt+in+cui+la+misurazione+viene+effettuata+direttamente+nel+fluido,+guidata+attraverso+

• un+ ciclo+ di+ smistamento/estrazione+ sensorizzato+ e+ successivamente+ o+ restituito+ al+

!

corpo+del+bioreattore+o+scartato.

Poiché+ non+ devono+ essere+ posizionate+ sonde+ all'interno+ della+ camera+ di+ coltura,+ il+

rilevamento+ indiretto+ può+ essere+ effettuato+ per+ mezzo+ di+ strumenti+ avanzati,+ precisi,+

!

con+evidenti+vantaggi+in+termini+di+specificità+e+sensibilità+rispetto+al+metodo+invasivo.

D'altra+parte,+il+ritardo+introdotto+dal+campionamento+può+ostacolare+pesantemente+il+

significato+ della+ misura+ stessa+ (con+ eventuale+ introduzione+ di+ artefatti)+ e+

compromettere+l'efficacia+delle+strategie+per+il+controllo+in+retroazione.+

-

22+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+

MONITORAGGIO(DEL(COSTRUTTO(

!

Monitorare+ la+ funzionalità+ e+ la+ struttura+ del+ costrutto+ sviluppato+ ingegneristicamente+ resta+ un+ campo+ relativamente+

inesplorato+e+un+campo+estremamente+complesso+della+ricerca.+

Sarebbe+riduttivo+usare+il+termine+"sensore"+nel+senso+tradizionale,+poiché+le+tecniche+attualmente+in+fase+di+studio+si+

basano+ su+ tecnologie+ d'avanguardia+ altamente+ sofisticate,+ spesso+ ereditate+ dai+ campi+ collegati+ e+ non+ (ad+ esempio,+

cliniche,+telecomunicazioni)+o+indagini+bioptiche.+

Sistemi+per+il+monitoraggio+non+distruttivo+on3line+dello+stato+del+costrutto+in+sviluppo+consentirebbero+l'ottimizzazione+

continua+ e+ immediata+ del+ protocollo+ di+ coltura+ in+ base+ alle+ esigenze+ effettive+ della+ stessa+ coltura,+ superando+ così+ gli+

!

inconvenienti+ tradizionalmente+ connessi+ all'uso+ di+ metodi+ di+ rilevamento+ di+ endpoint+ o+ analisi+ time3point.

La+ necessità+ è+ una+ caratterizzazione+ in+ tempo+ reale+ delle+ proprietà+ funzionali+ e+ morfologiche+ dei+ costrutti+

ingegnerizzati,+sia+alla+micro+sia+alla+macro+scala.+

+

Il+monitoraggio+del+costrutto+può+essere+suddivisio+in:+

monitoraggio+ di+ proprietà+ funzionali,+ caratterizzazione+ delle+ proprietà+ fisiche+ complessive+ dei+ costrutti+ (per+

• esempio,+ forza,+ modulo+ elastico,+ e+ permeabilità),+ ma+ anche+ il+ monitoraggio+ della+ funzione+ delle+ cellule+

all'interno+del+costrutto+ingegnerizzato+stesso+ ad+esempio,+in+termini+di+proliferazione,+vitalità,+metabolismo,+

fenotipo,+biosintesi+attività+e+forza+adesiva,+

monitoraggio+ delle+ proprietà+ morfologiche,+ valutare+ quantità,+ composizione+ e+ distribuzione+ della+ matrice+

• extracellulare+che+viene+depositata+in+tutto+lo+scaffold+durante+la+coltura+nel+bioreattore.+il+monitoraggio+delle+

proprietà+ morfologiche+ è+ particolarmente+ pertinente+ quando+ la+ funzionalità+ dei+ tessuti+ ingegnerizzati+ è+

strettamente+dipendente+dall’organizzazione+strutturale+della+loro+matrice+extracellulare+(ad+esempio,+ossa+e+

!

tendini)

+

+

+ MONITORAGGIO(DELLE(PROPRIETÀ(FUNZIONALI(DEL(COSTRUTTO(

! Forza-e-modulo-elastico-

o

Una+cella+di+carico+convertire+una+forza+in+un+segnale+elettrico.+

In+ una+ cella+ di+ carico+ è+ possibile+ misurare+ la+ resistenza+ e+ il+ modulo+ elastico+ del+

costrutto+in+tempo+reale.+

+

+

+

+

- Permeabilità-

o

La+ misurazione+ della+ permeabilità+ può+ essere+ effettuata+ indirettamente+ utilizzando+

l'equazione+di+permeabilità+ ! !" +

! = − !

! !"

con+ =portata,+ =permeabilità,+ =viscosità+ dinamica,+ =sezione+ dello+ scaffold,+

! ! ! !

!"=differenza+di+pressione,+!"=altezza+dello+scaffold.+

+

+ Proprietà-morfologiche-

o

Un+metodo+impiegato+con+successo+in+tempo+reale+è+la+Tomografia+ottica+di+coerenza+(OCT)+perchè+non+è+distruttiva,+è+

uno+strumento+non+invasivo+con+cui+monitorare+la+produzione+della+matrice+extracellulare.+

L’OCT+è+analoga+alla+convenzionale+ecografia+clinica,+ma+utilizza+l’infrarosso+vicino+come+sorgente+luminosa+invece+del+

suono,+consente+immagini+ad+alta+risoluzione+(1315+micron+vs+100+3+200+micron)+

La+ tecnica+ è+ compatta+ e+ flessibile,+ nonché+ con+ un+ costo+ relativamente+ basso+ poiché+ può+ essere+ attuata+ con+ fibre+

!

ottiche+commercialmente+disponibili.

Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 23+

ALTRE(COMPONENTI(DEI(BIOREATTORI(

!

+ Attuatori+

o

La+ selezione+ degli+ attuatori+ (motori+ passo3passo,+ motori+ voice+ coil,+ ...)+ avviene+ in+ base+ alle+ esigenze+ di+ stimolazione+

meccanica,+frequenza+di+stimolazione,+la+forza+continua+/+picco+necessaria.+

+ Pompe+

o

Anche+ per+ la+ selezione+ delle+ pompe+ (pompe+ peristaltiche+ di+ computer+ controllati),+ si+ sceglie+ in+ base+ ai+ requisiti+ di+

perfusione+e+molto+cambia+a+seconda+dello+scaffold+utilizzato.+

+

+ BIOREATTORI(PER(IL(TESSUTO(OSSEO(

!

+ Motivazioni-cliniche-

o

Gli+ innesti+ ossei+ sono+ ampiamente+ utilizzati+ a+ scopo+ terapeutico+ per+ il+

trattamento+ di+ difetti+ derivanti+ da+ grandi+ resezioni+ dovute+ a+ cancro,+ malattie+

congenite+o+traumi.+

Più+ di+ mezzo+ milione+ d’interventi+ chirurgici+ di+ innesto+ osseo+ si+ svolgono+ ogni+

anno+negli+Stati+Uniti+con+un+onere+economico+di+circa+2,5+miliardi+di+dollari.+

Approcci+che+sfruttano+l’ingegnerizzazione+di+tessuto+osseo+hanno+il+potenziale+

per+ incidere+ sensibilmente+ sulle+ attuali+ modalità+ terapeutiche,+ fornendo+ una+

fonte+ virtualmente+ illimitata+ di+ innesti+ ossei+ in+ geometrie+ composte+

anatomiche+dello+specifico+paziente,+le+cellule+staminali+autologhe.+Gli+innesti+

ossei+ ingegnerizzati+ di+ dimensioni+ clinicamente+ rilevanti+ richiedono+ un’estesa+

coltivazione+in+vitro+di+costrutti+poi+posti+in+bioreattori.+

+ Struttura-ossea-

o

Il+ tessuto+ osseo+ ha+ una+ forma+ complessa+ altamente+ specializzata+ di+ tessuto+

connettivo+ mineralizzato+ che+ fornisce+ il+ supporto+ interno+ per+ tutti+ i+ vertebrati+

superiori.+Si+sviluppa+per+osteogenesi,+il+processo+di+ossificazione.+

Il+ tessuto+ e+ l’osso+ lamellare+ sono+ i+ due+ tipi+ di+ osso+ osservati+ a+ livello+

microscopico.+

Il+ tessuto+ osseo+ è+ una+ disposizione+ disorientata+ di+ fibre+ collagene,+

24+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+

meccanicamente+deboli+ed+è+la+prima+forma+di+osso+durante+lo+sviluppo+e+nella+riparazione+delle+fratture.+

Dopo+ la+ nascita,+ il+ tessuto+ osseo+ viene+ gradualmente+ sostituito+ dall’osso+ lamellare,+ tranne+ in+ alcuni+ punti+ come+ per+

esempio+le+prese+dei+denti.+

L’osso+ lamellare,+ invece,+ è+ altamente+ organizzato,+ meccanicamente+ resistente+ e+ ha+ fasci+ di+ collagene+ orientati+ nella+

stessa+direzione.+

L’organizzazione+ strutturale+ del+ tessuto+ osseo+ lamellare+ può+ mostrarsi+ o+ come+ una+

massa+solida+in+osso+corticale+(noto+anche+come+osso+compatto)+o+come+un’aperta,+

spugnosa+ rete+ trabecolare,+ nota+ anche+ come+ osso+ spugnoso+ o+ spongioso.+

L’osso+ corticale+ è+ molto+ più+ denso+ con+ una+ porosità+ compresa+ tra+ il+ 5%+ e+ il+ 10%.+ Si+

trova+prevalentemente+nella+diafisi+delle+ossa+lunghe,+sulle+superfici+esterne+di+altre+

ossa+e+forma+il+guscio+esterno+attorno+all’osso+spugnoso+alla+fine+delle+articolazioni+e+

delle+vertebre.+La+sua+struttura+di+base+di+primo+livello+sono+osteoni.+

L’osso+ trabecolare+ è+ molto+ più+ poroso+ con+ porosità+ compresa+ dal+ 50%+ al+ 90%.+ Si+

trova+nelle+apofisi+delle+ossa+lunghe,+in+vertebre+e+in+ossa+piatte+come+il+bacino.+Il+suo+

modulo+e+resistenza+alla+compressione+sono+circa+20+volte+inferiore+a+quella+dell’osso+

corticale+e+la+sua+struttura+di+base+sono+le+trabecole.+

+ BIOMECCANICA(DELL’OSSO(

!

La+responsabilità+primaria+dello+scheletro+è+quello+di+fornire+un+supporto+strutturale+per+il+corpo.+In+questo+ruolo,+lo+

scheletro+è+la+base+della+postura,+resiste+alle+sfide+quotidiane+e+protegge+gli+organi+interni.+

Il+successo+strutturale+dello+scheletro,+ottenuto+attraverso+i+contributi+interdipendenti+della+morfologia+dello+scheletro+

e+ proprietà+ meccaniche,+ è+ determinato+ sia+ da+ determinanti+ genetiche+ dell'architettura+ ossea+ sia+ dalla+ sensibilità+ del+

tessuto+ai+segnali+meccanici.+La+qualità+del+tessuto+è+importante+per+la+struttura+quanto+la+quantità;+la+connettività+e+

l'orientamento+ delle+ trabecole,+ nonché+ la+ resistenza+ dell'osso+ corticale+ a+ microlesioni,+ contribuiscono+ a+ definire+ la+

resistenza+ di+ un+ osso+ al+ fallimento+ indipendentemente+ dalla+ necessità+ di+ aumentare+ la+ massa+ ossea.+

È+ importante+ sottolineare+ che+ una+ diminuzione+ della+ qualità+ strutturale+ dello+ scheletro+ non+ è+ accompagnata+ da+ un+

aumento+ proporzionale+ della+ fragilità+ scheletrica,+ mentre+ anche+ piccoli+ miglioramenti+ nella+ qualità+ ossea+ possono+

comportare+una+significativa+riduzione+del+verificarsi+di+una+frattura.+

+

+

+ Tensione +

o

Quando+una+forza+viene+applicata+a+un+qualsiasi+materiale,+come+l’osso,+si+deforma.+La+quantità+di+deformazione+del+

materiale+ rispetto+ alla+ sua+ lunghezza+ originale+ è+ la+ tensione+ del+ materiale.+ La+ tensione+ è+ un'unità+ adimensionale+

formalmente+definita+come+la+variazione+di+lunghezza+diviso+per+la+sua+lunghezza+originale:+

!"

!! = !

!

Quando+un+materiale+è+tirato,+diventa+più+lungo+(forza+di+tiro),+e+quando+compresso,+si+accorcia+il+materiale+(tensione+di+

pressione).+ I+ picchi+ di+ tensione+ in+ compressione+ nell’osso+ durante+ un’attività+ intensa+ posono+ raggiungere+ anche+ lo+

0,35%+in+compressione,+0,1%+in+tensione,+e+0,15%+a+taglio.+

+

+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 25+

Deformazione +

o

Per+ determinare+ le+ proprietà+ del+ materiale+ di+ osso+ (come+ rigidezza+ o+ resistenza),+ un+ campione+ lavorato+ viene+

sottoposto+ a+ + trazione+ o+ compressione+ con+ un+ carico+ noto.+ Tali+ prove+ indicano+ la+ grandezza+ della+ forza+ in+ termini+ di+

area+di+sezione+trasversale+del+materiale+su+cui+il+carico+è+applicato.+La+forza+per+unità+di+superficie+è+la+deformazione:+

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2

e+viene+riportato+in+N/m +o+Pa.+

La+sollecitazione+di+compressione+provocata+nel+terzo+metacarpale+di+un+cavallo+da+corsa+purosangue+durante+galoppo+

è+dell'ordine+di+63+MPa.+

+

+ Modulo-elastico-

o

Il+ grado+ in+ cui+ un+ materiale+ si+ deforma+ dipende+ non+ solo+ dalla+ grandezza+ delle+ forze+ e+ dei+ momenti+ applicati+ alla+

struttura,+ma+anche+dalla+rigidità+dei+materiali+costituenti.+

Nel+caso+dell’osso,+la+rigidità+è+determinata+dalle+proporzioni+relative+dei+cristalli+d’idrossiapatite+e+le+fibre+di+collagene+

che+costituiscono+il+materiale+composito.+

Durante+le+fasi+iniziali+di+un+test,+vi+è+un+aumento+lineare+della+tensione+all'aumentare+della+deformazione,+noti+come+la+

regione+ elastica.+ Se+ il+ carico+ è+ rimosso+ durante+ questa+ fase+ della+ prova,+ il+ campione+ ritorna+ alla+ sua+ dimensione+

originale+di+forma+e+quasi+immediatamente.+La+relazione+lineare+tra+tensione+e+lo+stress+si+chiama+legge+di+Hooke:+

! +

!! = !

dove+E+è+il+modulo+elastico.+

La+pendenza+della+regione+elastica+della+curva+tensione3deformazione+riflette+la+rigidità+del+materiale,+altrimenti+noto+

come+modulo+di+elasticità+(E).+Più+rigido+è+il+materiale+maggiore+è+la+pendenza+della+linea.+

L’osso+ha+proprietà+meccaniche+distinte+in+direzioni+diverse+quindi+è+anisotropo.+

Il+ modulo+ di+ un+ osso+ corticale+ maturo+ è+ dell'ordine+ di+ 18+ GPa+ nella+ direzione+ longitudinale,+ 12+ GPa+ in+ direzione+

trasversale+e+3,3+GPa+a+taglio.+

Le+ proprietà+ del+ materiale+ di+ osso+ spongioso+ sono+ anche+ più+ complesse+ perchè+ l'orientamento+ trabecolare,+ la+

connettività+ e+ densità+ di+ massa+ (frazione+ di+ volume+ dell'osso)+ influenzano+ notevolmente+ la+ rigidità.+ A+ seconda+ della+

posizione,+il+modulo+elastico+di+osso+trabecolare+può+variare+da+0,1+a+3,5+GPa.+Il+grado+di+mineralizzazione+(ad+esempio,+

osso+immaturo+o+tessuto)+o+porosità+(ad+esempio,+osso+vecchio)+può+compromette+la+rigidità+del+tessuto+osseo+e+quindi+

abbassare+il+modulo+elastico.+

26+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+

MECCANOBIOLOGIA(DELL’OSSO(

!

La+capacità+delle+cellule+ossee+di+rispondere+ai+segnali+meccanici+è+stata+documentata.+

Un+ ambiente+ con+ carichi+ complessi+ è+ riconosciuto+ dalle+ cellule+ ossee+ (attraverso+ meccanorecettori)+ e+ trasdotte+ in+

segnali+cellulari+che+regolano+la+formazione+ossea+e+riassorbimento+relativi+agli+obiettivi+dello+scheletro.+

Tuttavia,+ quali+ sono+ i+ fattori+ specifici+ che+ regolano+ la+ risposta?+ I+ carichi+ derivanti+ da+ attività+ funzionale,+ la+ pressione+

nella+ cavità+ intramidollare+ e+ all'interno+ delle+ cortecce,+ onde+ di+ pressione+ transitorie+ e+ forze+ di+ taglio+ attraverso+

canalicoli+ e+ campi+ elettrici+ anche+ dinamici+ come+ il+ fluido+ interstiziale+ scorre+ attraverso+ i+ cristalli+ ossei+ generano+

tensione+nel+tessuto+osseo.+

Il+ rimodellamento+ osseo+ è+ sensibile+ ai+ cambiamenti+ di+

tensione,+ al+ numero+ di+ cicli+ di+ carico,+ la+ distribuzione+ del+

carico,+ e+ al+ tasso+ di+ deformazione.+ È+ importante+

sottolineare+che+il+segnale+deve+essere+dinamico+(tempo3

variante)+ per+ influenzare+ la+ risposta+ delle+ cellule+ ossee;+

carichi+ statici+ vengono+ ignorati+ dallo+ scheletro,+ e+ il+

potenziale+ anabolico+ di+ un+ regime+ di+ carico+ aumenta+

durante+i+periodi+di+riposo+inseriti+tra+gli+eventi+meccanici.+

Anche+ livelli+ estremamente+ bassi+ di+ tensione+ ossea,+ se+

indotti+ a+ frequenze+ relativamente+ elevate+ quali+

potrebbero+ derivare+ attraverso+ il+ contenuto+ spettrale+ di+ contrattilità+ muscolare,+ hanno+ dimostrato+ di+ essere+

anabolizzanti+per+il+tessuto+osseo,+migliorando+non+solo+la+quantità+di+osso+(massa+ossea),+ma+anche+la+qualità+di+ossea.+

+

La+coltivazione+di+osteoblasti+in+scaffold+tridimensionali+è+stata+riportata+circa+dal+1990.+Questi+primi+esperimenti+sono+

stati+condotti+in+piastre+di+coltura+(dischi+di+Petri)+tradizionali+in+condizioni+di+medium+statico.+

Culture+statiche+sono+insufficienti+per+la+crescita+di+cellule+in+coltura+per+costrutti+di+grandi+dimensioni+e+clinicamente+

rilevanti+ (centimetri)+ così+ come+ la+ limitata+ diffusione+ di+ ossigeno+ e+ nutrienti+ sosterrà+ la+ sopravvivenza+ cellulare+ solo+

attraverso+una+profondità+di+parecchi+100+μm.+

Vari+tipi+di+bioreattori+sono+stati+sviluppati+per+aiutare+la+coltivazione+di+grandi+innesti+3D:+

spinner+flask,+

• a+pareti+rotanti+del+vaso,+

• a+perfusione.+

+

Ognuno+ di+ questi+ tipi+ di+ bioreattore+ è+ stato+ dimostrato+ essere+ uno+ strumento+

efficace+nella+coltura+di+cellule+ossee+per+fini+di+ingegnerizzazione+dei+tessuti.+

Gli+spinner+flask+e+quelli+a+pareti+rotanti+sono+efficaci+nel+creare+una+soluzione+di+

medium+omogenea+all’esterno+dello+scaffold+ma+non+altrettanto+nel+perfondere+la+

struttura+interna.+

+ Progettazione+di+Protesi+ed+Organi+Artificiali+3+Bioreattori+ 27+


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in ingegneria biomedica
SSD:
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher And1.88 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Progettazione di Protesi ed Organi Artificiali e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Politecnico di Torino - Polito o del prof Bignardi Cristina.

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