Principi di Biologia molecolare

Un repressore è una particolare proteina che, legandosi

all’operatore, inibisce l’espressione di uno o più geni. Un repressore

può legare il DNA blocca l’attacco della RNA polimerasi al promotore

impedendo la trascrizione dei geni nell’RNA messaggero. Un

repressore legato all’RNA invece si lega all’mRNA ed impedisce la sua

traduzione in proteine.

o Ricombinazione omologa (ruolo di Rec e Ruv)

La ricombinazione omologa è un processo di riparazione delle rotture

a doppio filamento che recupera le informazioni necessarie alla

riparazione dal cromosoma fratello (cromosoma omologo): se si ha

un danno al doppio filamento non si ha più il filamento stampo utile

alla polimerasi per sintetizzare i nuovi nucleotidi. Questo è possibile

solo se è già avvenuta la segregazione e quindi si ha disponibilità del

cromosoma omologo in caso contrario si opera con il meccanismo

NHEJ (Non-Homologous End-Joining, giunzione delle estremità non

omologhe). Il meccanismo NHEJ porta inevitabilmente a mutazioni

per spirito di sopravvivenza. La ricombinazione omologa non ha la

sola funzione di riparazione genetica, ma di generale riarrangiamento

tra cromosomi omologhi che si scambiano pezzi di materiale

genetico. In particolare si ricordano le funzioni di mantenimento

della variabilità genetica, recupero delle zone di DNA danneggiate e

regolazione dell’espressione di geni (i cromosomi possono spostare

geni espressi in una zona silente dove non vengono espressi ad una

zona dove invece è funzionalmente attivo) ed è suddivisa in cinque

fasi distinte. ALLINEAMENTO DELLE MOLECOLE DI DNA OMOLOGHE:

se due porzioni di DNA devono scambiarsi i cromosomi omologhi è

necessario che abbiano un’omologia una rispetto all’altra, quindi le

molecole devono allinearsi (omologia totale o almeno 100pb per lo

scambio). INTRODUZIONE DI ROTTURE AL DNA: perché avvenga lo

scambio devo avere DNA a singolo filamento che viene quindi

tagliato e processato, andando a “mangiucchiare” una delle

estremità. INVASIONE DEL FILAMENTO: una volta formato il DNA a

singolo filamento esso costituirà il filamento invasore ed entrerà nel

cromosoma omologo, si legherà quindi alle basi complementari

andando a costituire un eteroduplex. FORMAZIONE GIUNZIONI DI

HOLLIDAY: in seguito all’invasione le due molecole di DNA sono

connesse tra loro da filamenti che si incrociano. Questa struttura

assume il nome di giunzione di Holliday e può scorrere lungo il DNA

(migrazione del chiasma). RISOLUZIONE DELLE GIUNZIONI: l’incrocio

viene risolto e si ricostituiscono i cromosomi mescolati

geneticamente. Nella realtà è possibile avere anche un taglio dei due

filamenti del medesimo cromosoma: si otterrà quindi una doppia

invasione ed un duplice chiasmo.

o Riparazione DNA

I meccanismi che portano alla riparazione del DNA sono di diverso

tipo e prevedono meccanismi ben precisi. La riparazione diretta

porta alla cancellazione del danno, si ricorda la fotoriattivazione (un

danno causato da radiazione UV porta alla formazione di un dimero

di timina e alla contemporanea attivazione della DNA fotoliasi che,

tramite luce visibile, porta alla riparazione diretta del danno) e la

demetilazione (in caso di presenza di metilguanina che può

accoppiarsi con l’adenina, la metiltransferasi trasferirà il metile dalla

base al residuo -SH dell’enzima ripristinando la sequenza corretta. In

caso di riparazione per escissione si rimuove il nucleotide errato ed il

filamento stampo viene usato come base per la riparazione. L’enzima

glicosilasi attacca il legame glicosidico tra base e zucchero e lo

rimuove: si crea quindi un sito abasico. Interviene a questo punto

una nucleasi che taglia il legame fosfodiestereo tra zucchero e

zucchero andandolo a rimuovere: polimerasi e ligasi andranno a

riparare il filamento. È possibile anche rimuovere più nucleotidi, in

questo caso si utilizza un complesso proteico di proteine del gruppo

Uvr che riconoscono la regione di errore sul DNA. Le proteine UvrA e

UvrB si uniscono a formare un tetramero e si vanno ad assemblare

attorno alla regione di distorsione grazie all’idrolisi di ATP. Una volta

agganciate, le UvrA si staccano lasciando che UvrB crei una bolla di

apertura della doppia elica: la bolla richiama UvrC, una nucleasi che,

ponendosi a ponte sopra UvrB, va a tagliare il DNA ai due lati (8 da

una parte e 4-5 dall’altra). Il nick creato richiama UvrD che rimuove il

frammento ed attiva la polimerasi e la ligasi per la riparazione. In

caso di trascrizione del DNA da parte della RNA polimerasi, in caso di

errore nel filamento, la RNA polimerasi si blocca, recluta il complesso

Uvr per la riparazione del danno e poi riprende il lavoro di

trascrizione.

o Risoluzione delle giunzioni di Holliday

Per risolvere le giunzioni di Holliday occorre dapprima immaginare di

ruotare il chiasma nello spazio per renderlo planare e

successivamente effettuare il taglio. Se opero un taglio lungo i

filamenti coinvolti nello scambio otterrò un prodotto patch (minima

ricombinazione) mentre se opero un taglio lungo i filamenti non

coinvolti nello scambio otterrò invece un prodotto di crossing over.

Nella risoluzione delle giunzioni di Holliday, giocoforza è definito dal

ruolo dei complessi proteici Rec e Ruv. Il sistema RecBCD (con

funzione nucleasica ed elicasica) permette di preparare il filamento

invasore: RecB e RecD degradano entrambe i filamenti, mentre RecC

prende contatto con entrambe. Poiché RecB è più lenta di RecD, si

formerà un’ansa. Il processo a doppia velocità continuerà fino a che

RecC non incontra e lega la sequenza χ: il processo si blocca e si

invertono le velocità, ottenendo il frammento libero voluto. A questo

punto la proteina RecA lega il filamento protruso ed inizia l’invasione

del filamento omologo. Il complesso proteico Ruv è invece coinvolto

nella migrazione del chiasma. La proteina RuvA si lega all’altezza del

chiasma prendendo contatto con tutti i filamenti: questo richiama

RuvB che, ponendosi ai lati di RuvA, con un’azione ATP-dipendente,

ruota e fa scorrere il chiasma sul DNA. Il chiasma prosegue la sua

propagazione fino a che non incorre in sequenze specifiche che porta

al distacco del complesso RuvAB e all’attacco di RuvC,

un’endonucleasi che taglia il chiasma ed induce la risoluzione dello

stesso.

o RNA polimerasi batteriche ed eucariotiche

La RNA polimerasi è un enzima costituito da due subunità α, due

subunità β ed una ω: solo le subunità β entrano in gioco nella

polimerizzazione, in quanto centro catalitico dell’enzima. L’enzima ha

la forma di una chela di granchio: il sito attivo è la cavità dove pasa il

DNA e la polimerasi sintetizza l’RNA, qui è contenuto magnesio

bivalente. A differenza della DNA polimerasi non ha bisogno di un

primer per poter iniziare il processo di copiature, ma riconosce

specifici promotori per l’inizio della trascrizione di sequenze di DNA e

sequenze terminatrici per la cessazione della trascrizione. Al

contrario della DNA polimerasi, la RNA polimerasi ha anche azione

elicasica, questo significa che il DNA entra a elica, viene processato

ed esce nuovamente sottoforma di elica. La direzione di trascrizione

è 5’3’ per cui verrà operata la trascrizione del filamento stampo a

dare una copia esatta del filamento codificante.

o Sequenze ripetute in tandem: satelliti, minisatelliti, microsatelliti

Una sequenza ripetuta in tandem è una sequenza ripetuta

esattamente uguale un certo numero di volte: si parla di sequenze

satellite, minisatellite, microsatellite. Una sequenza satellite ha una

localizzazione centromerica, è un prodotto della duplicazione di

piccole sequenze e loro successiva mutazione; sono sequenze grandi

fino a 200pb con una densità differente rispetto al DNA (se

centrifugo in gradiente di concentrazione otterrò una separazione in

bande). Le sequenze minisatellite prevedono una grandezza massima

di 5pb, le microsatellite sono invece inferiori a 4pb.

o Sequenze ripetute interdisperse: trasposoni e retrotrasposoni, LTR,

SINE e LINE

Le sequenze interdisperse possono essere suddivise in trasposoni e

retrotrasposoni. I trasposoni, o trasposoni a DNA, sono elementi

mobili all’interno del genoma che hanno inserito nella propria

sequenza un gene che codifica per la trasposasi, capace di tagliare il

DNA e spostarlo da un’altra parte. I retrotrasposoni, o trasposoni a

DNA, devono essere trascritti in RNA dalla RNA polimerasi e

retrotrascritti dalla trascrittasi inversa in DNA copia (cDNA) che a

questo punto è capace di inserirsi in un nuovo visto bersaglio. I

retrotrasposoni sono suddivisi in tre tipologie: LTR, SINE e LINE). I

retrotrasposoni di tipo LTR (Long Terminal Repeats) sono molto simili

ai retrovirus e si tratta di sequenze terminali lunghe; come i

retrovirus presenta i geni gag (codifica per il capside) e pol (codifica

per la trascrittasi inversa) ma non presenta env (codifica per le

proteine di rivestimento). Le sequenze LINE (Long Interdispersed

Nuclear Elements) sono autonome e in grado di autotrasporsi,

presentano i geni ORF1 e ORF2 ed una coda poliA terminale.

Contrariamente, le sequenze SINE (Short Interdispersed Nuclear

Elements) non presentano i due geni e non sono quindi autonome:

spetta alle LINE fungere da help alle SINE per la trasposizione.

o Sequenziamento DNA

Il sequenziamento del DNA vede nel suo apice il Progetto Genoma

Umano che prevede l’analisi dell’intero genoma umano. Sequenziare

il DNA significa riconoscere ed ordinare tutti i nucleotidi che

compongono il patrimonio genetico così come posizionati nel

genoma. Numerose sono le tecniche per ottenere questo risultato.

Le fasi di sequenziamento sono comuni e comprendono: digestione

del DNA in frammenti, inserzione in plasmidi e amplificazione in

batteri, sequenziamento dei frammenti, allineamento dei frammenti,

sequenziamento.

o Sequenziamento DNA – Maxam Gilbert

A differenza del metodo di Sanger, il metodo Maxam-Gilbert prevede

l’uso di composti chimici dannosi e non è automatizzabile. Questo

metodo parte da DNA a doppia elica, marcato in 5’ o 3’ e

successivamente denaturato. Il DNA viene suddiviso in quattro

campioni e vengono utilizzati reagenti chimici che permettono la

degradazione selettiva di ogni base ottenendo tanti frammenti

quanti sono i nucleotidi. Viene effettuata una corsa elettroforetica e

dalla lastra si ottiene, come per Sanger, una sequenza di basi (5’3’,

bassoalto) che rappresenta però il filamento originale e n