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Principi di Biologia molecolare

Schemi utili per il ripasso basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Daniele dell’università degli Studi di Pisa - Unipi, facoltà di Farmacia, Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologie farmaceutiche. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Principi di biologia molecolare docente Prof. S. Daniele

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caso di riparazione per escissione si rimuove il nucleotide errato ed il

filamento stampo viene usato come base per la riparazione. L’enzima

glicosilasi attacca il legame glicosidico tra base e zucchero e lo

rimuove: si crea quindi un sito abasico. Interviene a questo punto

una nucleasi che taglia il legame fosfodiestereo tra zucchero e

zucchero andandolo a rimuovere: polimerasi e ligasi andranno a

riparare il filamento. È possibile anche rimuovere più nucleotidi, in

questo caso si utilizza un complesso proteico di proteine del gruppo

Uvr che riconoscono la regione di errore sul DNA. Le proteine UvrA e

UvrB si uniscono a formare un tetramero e si vanno ad assemblare

attorno alla regione di distorsione grazie all’idrolisi di ATP. Una volta

agganciate, le UvrA si staccano lasciando che UvrB crei una bolla di

apertura della doppia elica: la bolla richiama UvrC, una nucleasi che,

ponendosi a ponte sopra UvrB, va a tagliare il DNA ai due lati (8 da

una parte e 4-5 dall’altra). Il nick creato richiama UvrD che rimuove il

frammento ed attiva la polimerasi e la ligasi per la riparazione. In

caso di trascrizione del DNA da parte della RNA polimerasi, in caso di

errore nel filamento, la RNA polimerasi si blocca, recluta il complesso

Uvr per la riparazione del danno e poi riprende il lavoro di

trascrizione.

o Risoluzione delle giunzioni di Holliday

Per risolvere le giunzioni di Holliday occorre dapprima immaginare di

ruotare il chiasma nello spazio per renderlo planare e

successivamente effettuare il taglio. Se opero un taglio lungo i

filamenti coinvolti nello scambio otterrò un prodotto patch (minima

ricombinazione) mentre se opero un taglio lungo i filamenti non

coinvolti nello scambio otterrò invece un prodotto di crossing over.

Nella risoluzione delle giunzioni di Holliday, giocoforza è definito dal

ruolo dei complessi proteici Rec e Ruv. Il sistema RecBCD (con

funzione nucleasica ed elicasica) permette di preparare il filamento

invasore: RecB e RecD degradano entrambe i filamenti, mentre RecC

prende contatto con entrambe. Poiché RecB è più lenta di RecD, si

formerà un’ansa. Il processo a doppia velocità continuerà fino a che

RecC non incontra e lega la sequenza χ: il processo si blocca e si

invertono le velocità, ottenendo il frammento libero voluto. A questo

punto la proteina RecA lega il filamento protruso ed inizia l’invasione

del filamento omologo. Il complesso proteico Ruv è invece coinvolto

nella migrazione del chiasma. La proteina RuvA si lega all’altezza del

chiasma prendendo contatto con tutti i filamenti: questo richiama

RuvB che, ponendosi ai lati di RuvA, con un’azione ATP-dipendente,

ruota e fa scorrere il chiasma sul DNA. Il chiasma prosegue la sua

propagazione fino a che non incorre in sequenze specifiche che porta

al distacco del complesso RuvAB e all’attacco di RuvC,

un’endonucleasi che taglia il chiasma ed induce la risoluzione dello

stesso.

o RNA polimerasi batteriche ed eucariotiche

La RNA polimerasi è un enzima costituito da due subunità α, due

subunità β ed una ω: solo le subunità β entrano in gioco nella

polimerizzazione, in quanto centro catalitico dell’enzima. L’enzima ha

la forma di una chela di granchio: il sito attivo è la cavità dove pasa il

DNA e la polimerasi sintetizza l’RNA, qui è contenuto magnesio

bivalente. A differenza della DNA polimerasi non ha bisogno di un

primer per poter iniziare il processo di copiature, ma riconosce

specifici promotori per l’inizio della trascrizione di sequenze di DNA e

sequenze terminatrici per la cessazione della trascrizione. Al

contrario della DNA polimerasi, la RNA polimerasi ha anche azione

elicasica, questo significa che il DNA entra a elica, viene processato

ed esce nuovamente sottoforma di elica. La direzione di trascrizione

è 5’3’ per cui verrà operata la trascrizione del filamento stampo a

dare una copia esatta del filamento codificante.

o Sequenze ripetute in tandem: satelliti, minisatelliti, microsatelliti

Una sequenza ripetuta in tandem è una sequenza ripetuta

esattamente uguale un certo numero di volte: si parla di sequenze

satellite, minisatellite, microsatellite. Una sequenza satellite ha una

localizzazione centromerica, è un prodotto della duplicazione di

piccole sequenze e loro successiva mutazione; sono sequenze grandi

fino a 200pb con una densità differente rispetto al DNA (se

centrifugo in gradiente di concentrazione otterrò una separazione in

bande). Le sequenze minisatellite prevedono una grandezza massima

di 5pb, le microsatellite sono invece inferiori a 4pb.

o Sequenze ripetute interdisperse: trasposoni e retrotrasposoni, LTR,

SINE e LINE

Le sequenze interdisperse possono essere suddivise in trasposoni e

retrotrasposoni. I trasposoni, o trasposoni a DNA, sono elementi

mobili all’interno del genoma che hanno inserito nella propria

sequenza un gene che codifica per la trasposasi, capace di tagliare il

DNA e spostarlo da un’altra parte. I retrotrasposoni, o trasposoni a

DNA, devono essere trascritti in RNA dalla RNA polimerasi e

retrotrascritti dalla trascrittasi inversa in DNA copia (cDNA) che a

questo punto è capace di inserirsi in un nuovo visto bersaglio. I

retrotrasposoni sono suddivisi in tre tipologie: LTR, SINE e LINE). I

retrotrasposoni di tipo LTR (Long Terminal Repeats) sono molto simili

ai retrovirus e si tratta di sequenze terminali lunghe; come i

retrovirus presenta i geni gag (codifica per il capside) e pol (codifica

per la trascrittasi inversa) ma non presenta env (codifica per le

proteine di rivestimento). Le sequenze LINE (Long Interdispersed

Nuclear Elements) sono autonome e in grado di autotrasporsi,

presentano i geni ORF1 e ORF2 ed una coda poliA terminale.

Contrariamente, le sequenze SINE (Short Interdispersed Nuclear

Elements) non presentano i due geni e non sono quindi autonome:

spetta alle LINE fungere da help alle SINE per la trasposizione.

o Sequenziamento DNA

Il sequenziamento del DNA vede nel suo apice il Progetto Genoma

Umano che prevede l’analisi dell’intero genoma umano. Sequenziare

il DNA significa riconoscere ed ordinare tutti i nucleotidi che

compongono il patrimonio genetico così come posizionati nel

genoma. Numerose sono le tecniche per ottenere questo risultato.

Le fasi di sequenziamento sono comuni e comprendono: digestione

del DNA in frammenti, inserzione in plasmidi e amplificazione in

batteri, sequenziamento dei frammenti, allineamento dei frammenti,

sequenziamento.

o Sequenziamento DNA – Maxam Gilbert

A differenza del metodo di Sanger, il metodo Maxam-Gilbert prevede

l’uso di composti chimici dannosi e non è automatizzabile. Questo

metodo parte da DNA a doppia elica, marcato in 5’ o 3’ e

successivamente denaturato. Il DNA viene suddiviso in quattro

campioni e vengono utilizzati reagenti chimici che permettono la

degradazione selettiva di ogni base ottenendo tanti frammenti

quanti sono i nucleotidi. Viene effettuata una corsa elettroforetica e

dalla lastra si ottiene, come per Sanger, una sequenza di basi (5’3’,

bassoalto) che rappresenta però il filamento originale e non lo

stampo. La complessità di messa in opera, l’impossibilità di

automatizzazione e l’interazione con sostanze chimiche dannose lo

hanno portato in disuso in favore di altre tecniche di

sequenziamento.

o Sequenziamento DNA – Sanger

Il sequenziamento secondo Sanger è la prima tecnica messa a punto

per ottenere il sequenziamento del DNA. Riduco il DNA a singolo

filamento e lo suddivido in quattro provette contenenti ognuna uno

dei quattro dNTP, la polimerasi ed un ddNTP (e.g. provetta “A”:

ssDNA+dATP+polimerasi+ddATP): se la polimerasi in provetta invece

di legare il dNTP lega il ddNTP impedirà il legame in 3’ bloccando la

catena. Si conduce a questo punto un’analisi elettroforetica

posizionando ogni provetta in un diverso pozzetto: è consigliato

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aggiungere marcatura con il P radioattivo, in tal modo

l’elettroforesi potrà essere marcata direttamente su lastra

fotografica. Leggendo la lastra dal basso verso l’alto le varie bande in

corrispondenza dei diversi pozzetti, otterrò la sequenza

complementare (5’3’, bassoalto): per ottenere la sequenza

originale è sufficiente disegnare il filamento complementare (3’5’,

bassoalto). In alternativa ai quattro pozzetti con marker radioattivi,

si possono utilizzare marker fluorescenti in un singolo pozzetto:

l’analisi con il laser provvederà a separare le varie bande. A questo

punto un sistema computerizzato, basandosi su database esistenti,

proverà a sovrapporre ed ordinare i vari frammenti per ottenere la

sequenza di riferimento.

o Splicing

L’RNA viene trascritto come RNA immaturo che sarà utilizzabile solo

dopo una serie di processi che si attivano già all’uscita della catena

ribonucleotidica dalla polimerasi. Sebbene possa avvenire con più

varianti, lo splicing è di fondamentale importanza perché dà

variabilità genetica: dal medesimo trascritto immaturo posso

ottenere tanti trascritti maturi e di conseguenza diverse proteine. Il

DNA genomico (la porzione che viene codificata in mRNA) è

costituito in parte da esoni, la parte codificante, e da introni, la parte

non codificante: entrambi sono presenti nel pre-mRNA. Sebbene il

numero di introni vari da cellula a cellula, essi vanno comunque

eliminati poiché non hanno un ruolo funzionale: la reazione è detta

di splicing. Esiste lo splicing catalizzato dallo spliceosoma (insieme di

proteine e piccoli RNA nucleari che catalizzano la reazione; è lo

splicing più tipico che si realizza sugli mRNA nucleari preposti alla

codificazione di proteine) e lo splicing autocatalitico. Lo splicing

autocatalitico viene distinto in classe I e classe II: lo splicing di classe

II ha lo stesso meccanismo dello splicing catalizzato dallo

spliceosoma ma è l’introne stesso che funge da catalizzatore. Anche

lo splicing di classe I sfrutta l’introne come catalizzatore ma il

meccanismo differisce leggermente. Su rRNA e RNA degli organelli si

ha splicing alternativo, trans-splicing ed editing dell’RNA. Affinché si

rimuovano gli introni, gli spliceosomi devono riconoscere

determinate sequenze al confine tra introne ed esone: una regione

in 5’ con sequenze conservate GU, un sito accettore in 3’ con

sequenza AG, una sequenza PoliU vicina al sito di splicing in 3’ ed un

punto di ramificazione determinato dalla presenza di adenina. Il

meccanismo di reazione è abbastanza semplice in quanto l’adenina

sul punto di ramificazione lega con l’OH del ribosio in 2’ il sito di

splicing in 5’ andando a liberare l’esone: la struttura si richiude come

un cappio tra l’estremità 5’ con il punto di ramificazione. L’esone che

si è liberato può a questo punto, con l’estremità 3’, andare a legarsi

alla prima base dell’esone successivo andando a sganciare l’introne

dalla catena. Lo spliceosoma è un complesso di proteine e RNA

nucleari detti snRNA indicati con U1, U2, U4, U5 ed U6: durante lo

splicing si assemblano a delle proteine formando i snRNP.

o Struttura del DNA (variazioni strutturali nella conformazione)

o Struttura primaria DNA (basi, zuccheri, legame fosfodiestereo)

Il DNA è una lunga sequenza di basi organiche dette nucleotidi

organizzate lungo un doppio filamento. I nucleotidi presenti nel DNA

sono composti da basi azotate, gruppi fosfato e deossiribosio

(presenza di -OH solo in 3’). Le basi azotate sono quattro, due purine

(Adenina e Guanina) e due pirimidine (Timina e Citosina). Ogni base

può interagire e legarsi con una sola base nel filamento opposto

secondo la regola A-T C-G. Se terminale, lo zucchero presenta in

posizione 3’ il gruppo -OH e in 5’ il gruppo fosfato; se in posizione

interna legheranno entrambi il gruppo fosfato della base precedente

e successiva. Il legame tra nucleotide e nucleotide è detto

fosfodiestereo e coinvolge il fosfato in 5’ e l’OH in 3’.

o Struttura primaria RNA (basi, zuccheri, legame fosfodiestereo)

L’RNA è una lunga sequenza di basi organiche dette nucleotidi

organizzate lungo un singolo filamento continuo. I nucleotidi presenti

nel RNA sono composti da basi azotate, gruppi fosfato e ribosio

(presenza di -OH in 2’ e 3’). Le basi azotate sono quattro, due purine

(Adenina e Guanina) e due pirimidine (Uracile e Citosina). Ogni base

può interagire e legarsi con una sola base nel filamento opposto

secondo la regola A-U C-G. Se terminale, lo zucchero presenta in

posizione 3’ il gruppo -OH e in 5’ il gruppo fosfato; se in posizione

interna legheranno entrambi il gruppo fosfato della base precedente

e successiva. Il legame tra nucleotide e nucleotide è detto

fosfodiestereo.

o Struttura secondaria DNA (conformazione A-B-Z, tripla elica, forcina,

curvatura)

Il DNA assume la caratteristica conformazione a doppia elica grazie ai

legami a idrogeno che si vanno a creare tra base e base tra i filamenti

opposti. In soluzione il DNA si dispone a forma di elica con le basi

rivolte verso l’interno ed i gruppi fosfato all’interno: questo perché le

basi sono idrofobiche. La catena è caratterizzata dalla presenza di

due solchi, uno minore ed uno maggiore. Le basi sono soggette a

movimenti di roll, tilt e twist lungo i tre assi x, y, z. Il DNA può

assumere una delle tre conformazioni B Z o A. La conformazione B è

la più comune e si trova principalmente nella cellula. La

conformazione A (tozza e tarchiata) è presente perlopiù nell’RNA

duplex o negli eteroduplex RNA-DNA. La conformazione Z è

reperibile solo in vitro ed assume una forma a zig-zag. Esistono anche

conformazioni alternative quali la tripla elica (triplex) dovuta a legami

a idrogeno non canonici per presenza di una sequenza di 20-30pb di

sole purine o pirimidine. La presenza di sequenze invertite (e.g. 5’-

TGCGAT|ATCGCA-3’) o invertite ripetute (e.g. 5’-

TGCGAT|ACTC|ATCGCA-3’) in un solo filamento permette la

formazione di strutture a forcina (con un’ansa di sequenza non

ripetuta ed uno stelo formato da sequenze ripetute), se invece la

sequenza è su due filamenti si forma una struttura cruciforme (con

due anse e due steli).

o Struttura secondaria RNA (tetraloop, pseudonodo)

A differenza del DNA, l’RNA si presenta in forma di singolo filamento

per ragioni steriche e repulsione elettroniche per la presenza di -OH

in 2’. Oltre alle strutture già viste nel DNA, l’RNA può presentare

anche anse interne agli steli, regioni di mismatch o gemme, dove si

ha lo spostamento della base verso l’esterno. Le strutture stelo-ansa

possono presentare anche sequenze “tetraloop” con sequenza

UUUU: questo particolare tipo di struttura (un semi ricciolo) risulta

estremamente stabile per le interazioni di impilamento all’interno

della struttura. Un’ansa che presenti basi esterne e complementari al

filamento tali da portare alla formazione di una struttura

tridimensionale per impilamento coassiale è detto pseudonodo.

o Struttura terziaria DNA (superavvolgimento)

Il DNA tende ad assumere una conformazione estremamente

compatta ed avvolta in una struttura detta cromatina. Il

superavvolgimento può essere paragonato agli arrotolamenti del filo

del telefono, già avvolto. Il DNA assume questa conformazione per

compensare le tensioni indotte da modifiche strutturali quali

duplicazione o replicazione. Un superavvolgimento è definito dal

numero di legame (Lk), definito dalla somma dei twist (avvolgimenti)

e dei writhe (arrotolamenti): Lk=Tw+Wr. Se la differenza tra Lk

superavvolto e rilassato è minore di 0, allora si ha un

superavvolgimento negativo, viceversa positivo. Se effettuo una

elettroforesi su gel d’agarosio si vede che più il DNA è superavvolto e

più velocemente si muove ( è più distante dai pozzetti di deposito).

Endonucleasi come le topoisomerasi possono mutare il numero di

legame.

o Telomerasi

La telomerasi è un complesso ribonucleoprotico che copia la parte di

DNA terminale detta telomero: il cromosoma termina con estremità

a singolo filamento con sequenze ripetute (TTAGGG) dette telomeri.

La telomerasi riconosce per complementarerità le sequenze del

filamento singolo e, usando sé stessa come stampo, allunga le

estremità telomeriche. Il processo di allungamento è regolato dalla

presenza di alcune proteine legate ai telomeri (Rif e Rap) che

inibiscono il processo di retrotrascrizione. Per evitare che i telomeri

vengano “riparati” e rimanere quindi nella conformazione a singolo

filamento, essi formano un “cappuccio” andandosi a ripiegare

all’interno della singola elica.

o Topoisomerasi (I e II)

Le topoisomerasi sono enzimi della famiglia delle endonucleasi che

permettono di aumentare il numero di legame e rilassare il

superavvolgimento di DNA. La topoisomerasi II taglia entrambi i

filamenti, srotola l’attorcigliamento e permette Lk+2 tramite la

riduzione dei writhe. La topoisomerasi I invece sfrutta la tirosina per

rompere il legame fosfodiestereo di un solo filamento ed aumentare

Lk+1.

o Transelesione

La sintesi transelesione è l’ultima speranza di riparazione del danno e

sopravvivenza dopo che gli altri tentativi sono falliti: invece di

riparare il danno, la cellula diventa tollerante ad esso. Il processo di

replicazione è condotto da particolari polimerasi di translesione che

differiscono tra procarioti (pol IV e pol V) ed eucarioti (polimerasi Y).

Il processo è il medesimo della replicazione: la polimerasi III copia il

filamento e ad un certo punto trova un danno dovuto ad un dimero

di timina. A questo punto si stacca il complesso della polimerasi

richiamando la polimerasi di translesione che copia il frammento

danneggiato senza troppa specificità. Una volta copiato il frammento

danneggiato, la polimerasi di translesione si stacca e la polimerasi III

riprende il suo lavoro di copiatura

o Trascrizione RNA (ruolo di σ70 come fattore di inizio)

L’intero processo di trascrizione da DNA a RNA può essere riassunto

in tre passaggi fondamentali: inizio, allungamento e terminazione.

All’inizio la polimerasi riconosce il promotore: se il legame tra

promotore e polimerasi, la sequenza di trascrizione può avviarsi. La

polimerasi si aggancia al filamento (complesso chiuso) ed apre il

doppio filamento di DNA formando la bolla di trascrizione

(complesso aperto). In questa fase la polimerasi è in fase abortiva,

cioè rimane adesa al promotore e sintetizza al più nucleotidi.

Successivamente si stacca dal promotore e corre sul DNA; la

polimerasi qui gioca diversi importanti ruoli: catalizza la sintesi dei

nucleotidi, separa e poi riavvolge il DNA, stacca l’RNA dallo stampo e

corregge le bozze. Quando la polimerasi raggiunge determinate

sequenze di terminazione si stacca completamente dal DNA e

termina la fase di trascrizione. Affinché la trascrizione parta è

necessaria la presenza di un promotore, la cui forza è derivata dalla


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologie farmaceutiche
SSD:
Università: Pisa - Unipi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher manuel.grotti di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Principi di biologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pisa - Unipi o del prof Daniele Simona.

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