Principi di Biologia molecolare

Principi di biologia molecolare

Assemblaggio nucleosomi

Nell’assemblaggio del nucleosoma si nota che il tetramero H3-H4 è il primo a legarsi al DNA nella parte più alta del nucleosoma stesso. Successivamente, il dimero H2A-H2B si lega dalla parte inferiore e dalla parte superiore. L’ottamero così formato costituisce il core del nucleosoma attorno al quale è avvolto il DNA.

Una volta assemblati i nucleosomi, si possono ottenere due forme di cromatina a seconda della compattatura: l’eucromatina e l’eterocromatina. L’eterocromatina è una struttura altamente compattata che non permette la trascrizione, mentre l’eucromatina, risultando rilassata, permette il processo di trascrizione. La differenza risiede nella presenza dell’istone H1 nell’eterocromatina che, legandosi al linker, permette una maggiore compattazione della struttura, definita come fibra a 30 nm. La fibra a 30 nm esiste in due modelli: il solenoide e lo zig-zag; il primo è molto più compatto mentre il secondo è molto più presente in natura.

Ciclo cellulare

Il ciclo cellulare è composto di due grandi fasi: interfase e mitosi. L’interfase è costituita dalla fase G1, dove la cellula produce gli organelli e le proteine necessari per l'accrescimento della massa cellulare e prepara i complessi enzimatici necessari per la fase successiva. Nella fase S avviene la duplicazione del materiale genetico. A livello delle origini di replicazione, i due filamenti nucleotidici che costituiscono il DNA vengono separati grazie all'azione di un complesso multiproteico chiamato pre-loading complex. Nella fase G2, la cellula continua l'accrescimento della massa ed inizia a prepararsi alla successiva mitosi allestendo altre strutture indispensabili per la divisione. Successivamente si ha la mitosi, anch’essa divisa in fasi.

Complesso del mediatore

Il complesso del mediatore è un insieme di proteine che prendono contatto con i fattori di trascrizione e la polimerasi, oltre che con le proteine attivatrici leganti sequenze di DNA regolatorie: l’insieme dei contatti va a regolare la trascrizione. Poiché il promotore è l’innesco della trascrizione e le sequenze attivatrici o inibenti possono essere lontane dallo stesso, esse per trasmettere il comando alla polimerasi dovranno sfruttare il complesso del mediatore.

DNA polimerasi

La DNA polimerasi è un enzima con direzione di attività 5’→3’. La sua struttura è paragonata a una mano con un pugno semichiuso, dove vengono identificate tre regioni: palmo, pollice e dita. Nella parte alta del palmo si trova il sito catalitico dell’enzima. Durante la catalisi, le dita favoriscono la reazione e il pollice mantiene correttamente la polimerasi sul DNA. Mentre dita e pollice sono costituite da α-eliche, il palmo ha una conformazione a β-foglietto. Nel palmo si ha la formazione del legame fosfodiestereo tra i due nucleotidi ed è di fondamentale importanza la presenza di due ioni bivalenti quali Mg o Zn: mentre il primo si coordina con l’ossigeno in 3’ aumentandone l’affinità per il fosfato, il secondo si coordina con i fosfati permettendo il rilascio del pirofosfato.

Oltre all’azione diretta dei due ioni, la polimerasi riesce a formare legami a idrogeno con il solco minore del DNA stabilizzando il complesso. Le dita si muovono aprendosi e chiudendosi durante il processo di replicazione ed hanno un ruolo fondamentale nello stabilizzare la catalisi: quando non c’è sintesi, le dita sono aperte; quando invece il DNA si posiziona sul sito catalitico, le dita si chiudono e fanno una rotazione di 40° che determina il loro posizionamento sopra il sito catalitico. L’α-elica contiene residui amminoacidici (tirosina, lisina e arginina) che si vanno a posizionare e creare legami con i gruppi fosfato del dNTP entrante, stabilizzandolo e favorendo la catalisi. Una volta effettuato il legame al filamento, le dita si riaprono e il DNA scorre passando al nucleotide successivo. Le dita, aprendosi e chiudendosi, permettono una curvatura del DNA a 90° consentendo un corretto movimento del DNA sulla polimerasi e di esporre un solo nucleotide per volta impedendo il salto di alcuni nucleotidi. Il pollice si occupa principalmente di mantenere nella corretta posizione l’innesco e il sito attivo, stabilizzando inoltre il complesso innesco e DNA polimerasi.

La DNA polimerasi presenta anche attività esonucleasica che le permette di riparare eventuali errori di compilazione. Infatti, se si inserisce un nucleotide errato, l’attività della polimerasi rallenta per la sua diminuita affinità verso il DNA. Il DNA scorrerà sul sito esonucleasico che taglia e rimuove il nucleotide errato: a questo punto il filamento ritorna sul sito catalitico e l’attività può riprendere. Esistono tre tipologie di polimerasi: le polimerasi α, δ, e ε. Poiché la polimerasi α ha una bassa processività, diminuisce la sua affinità verso il DNA e viene sostituita dalla polimerasi ε o δ: l’alta processività di queste ultime è dovuta anche all’aggancio dello sliding-clamp sul filamento.

Elicasi

L’elicasi è l’enzima coinvolto nel processo di apertura della forcella replicativa. Sfrutta l’energia dell’idrolisi dell’ATP per separare la forcella replicativa andando a rompere i legami a idrogeno tra le basi.

Esoni

Gli esoni sono le sequenze legate insieme dopo l’escissione nello splicing dell’RNA e sono solitamente le sequenze espresse dell’RNA.

Frammenti di Okazaki

Poiché la direzione della forcella di replicazione e della DNA polimerasi è 5’→3’, appare evidente che il filamento con direzione 3’→5’ sarà copiato con facilità e celermente (filamento veloce o leading strand) mentre per l’altro filamento il processo risulterà più complesso. Il filamento 5’→3’ (filamento ritardato o lagging strand) sarà sintetizzato a partire da piccole sequenze di DNA dette frammenti di Okazaki, successivamente unite tra loro da un ulteriore enzima.

Genio introni

Un introne è la sequenza che resta fisicamente separata dopo l’escissione nello splicing dell’RNA: può codificare solo per snoRNA o miRNA. Gli introni hanno numerose funzioni tra cui la regolazione dello splicing alternativo, la determinazione dell’aumento della diversità genica; possono contenere enhancer che promuovono la velocità di polimerizzazione della RNA polimerasi oltre che contenere esoni di altri geni (in caso di geni sovrapposti). Una sequenza intronica presenta generalmente due nucleotidi GT in 5’ e due nucleotidi AG in 3’ e, a una determinata distanza dall’estremità 3’, anche 15 pb di polipirimidine oltre che la presenza di una branch site.

Istoni

Gli istoni costituiscono il core interno del nucleosoma. Sono proteine basiche (perlopiù arginina e lisina) che conferiscono stabilità al nucleosoma e sono suddivisibili in cinque differenti tipi: H2A, H2B, H3, H4 che costituiscono il vero e proprio core istonico, e H1 che si collega alla regione linker. H2A, H2B, H3 e H4, sebbene differenti per peso molecolare, mantengono caratteristiche comuni tra cui una coda N-terminale, una regione carbossi-terminale (variabile in lunghezza) e il dominio histone-fold, ovvero la porzione che forma il core istonico (3 domini a α-elica conservati in tutti e quattro gli istoni). Gli istoni H2A e H2B si associano a dare dimeri, mentre una coppia di istoni H3 ed una coppia di istoni H4 si associano a dare un tetramero.

Maturazione dell’mRNA

Le fasi di maturazione dell’mRNA prevedono diverse reazioni chimiche. La prima, la fase del capping, avviene durante l’allungamento del filamento: prevede che al filamento di mRNA in trascrizione venga aggiunta una metilguanina in posizione 5’ al filamento (trifosfatasi defosforila il fosfato in ψ in 5’, guaniltransferasi lega una guanina al fosfato in β, metiltransferasi metila la guanina in 7). Ulteriore fase di maturazione dell’mRNA è costituita dalla poliadenilazione in 3’ della catena. Le proteine CTSF e CPSF giocano un ruolo forza nel processo di poliadenilazione, esse si trovano in coda alla polimerasi e si legano al filamento di mRNA: CPSF taglia l’mRNA mentre CTSF è un fattore di taglio e stimolatorio. Una volta avvenuto il taglio, viene richiamata una PoliA polimerasi che sintetizza numerose adenine e le lega alla coda 3’ del filamento. Teoricamente potrebbero essere inserite infinite adenine, ma un meccanismo a feedback ne permette un massimo di 200 inserzioni.

Mismatch

Una regione di mismatch è una zona del DNA che presenta un errore nell’appaiamento delle basi: se la polimerasi riconosce l’errore e riesce a correggerlo si ritorna alla situazione di partenza, altrimenti l’errore verrà corretto nel secondo ciclo replicativo portando a una mutazione. I meccanismi che portano alla riparazione del mismatch sono molteplici, dal più semplice, come l’attività di proofreading della polimerasi, a sistemi più complessi, come il complesso proteico (Muts, Mutl e Muth). La proteina Muts ha una struttura a forma di chela che scorre sul filamento di DNA, andando a chiudersi sulle regioni di mismatch (processo ATP-dipendente): il legame va a piegare il DNA modificandone la conformazione che favorisce l’ancoraggio delle altre due proteine. Esse si assemblano a monte della regione di mismatch prendendo contatto con Muts formando un complesso: Muth ha attività endonucleasica che va a tagliare il DNA. Un’esonucleasi riconoscerà il taglio e degraderà i nucleotidi fino all’estremo della regione di mismatch: la DNA polimerasi prima e la ligasi dopo andranno a copiare la sequenza corretta dal filamento stampo. Poiché solo il DNA del filamento stampo è metilato, il complesso Mut riconoscerà solo quello come stampo per la correzione e non l’altro (che non risulta metilato). Poiché Muth può portare avanti la degradazione in entrambe le direzioni, posso avere degradazione sia a monte che a valle della regione di mismatch. Il sistema di riparazione del mismatch funziona anche in caso di scivolamenti sulle sequenze nucleotidiche: in caso di ansa di nucleotidi non appaiati, Muts riconosce le anse e attiva il sistema di mismatch richiamando le altre due proteine.

Mitosi

La mitosi è l’ultima fase del ciclo cellulare ed è suddivisa in quattro fasi più una. All’inizio si ha la profase dove il DNA è condensato e si perde la membrana nucleare; a questa segue la metafase dove si forma il fuso mitotico e ciascuna coppia di cromatidi si attacca agli opposti del fuso. Successivamente, nella anafase, si ha perdita di coesione e separazione dei cromatidi fratelli che vengono attratti ai poli del fuso; con la telofase si ha la diminuzione