Principi della diagnosi microbiologica

TECNICHE DI MICROSCOPIA:

Esistono diversi tipi di microscopio:

1- microscopio ottico: ha un potere di risoluzione di 0,2 micrometri e permette di vedere

microorganismi e cellule sia vivi che non viventi.

2- microscopio in campo scuro: permette di vedere organismi non viventi.

3- microscopio in contrasto di fase: permette di vedere organismi vivi.

4- microscopio elettronico a trasmissione: permette l'esame ultrastrutturale di cellule e virus

con immagini bidimensionali.

5- microscopio elettronico a scansione: fornisce immagini tridimensionali e consente di

esaminare strutture di superficie.

6- microscopio a fluorescenza: idoneo per osservazioni di preparati microscopici trattati con

sostanze fluorescenti. È usato nel caso di reazioni di immunofluorescenza.

COLORAZIONI PER MICROSCOPIA:

-consentono di vedere i componenti biologici al microscopi e possono essere di vari tipi.

-per esempio: colorazione differenziale di Gram: è quella maggiormente usata in campo

microbiologico e permette ci distinguere i batteri Gram negativi dai batteri Gram positivi.

Consiste nel versare su un vetrino una soluzione di cristal-violetto, successivamente si

sciacqua il vetrino e lo si ricopre con soluzione iodurata di Gram. Poi si usa acetone per

decolorare e l'ultima fase consiste nell'applicare il colorante di contrasto safranina. I batteri

Gram negativi si colorano di rosa mentre i batteri Gram positivi di viola scuro.

ESAME SIEROLOGICO:

È usato sia per effettuare una d.m. diretta ( qualora sia noto l'anticorpo e si ricerchi l'antigene ),

sia indiretta (qualora sia noto l'antigene e si ricerchi l'anticorpo). Si basa sulla capacità che

l'antigene e l'anticorpo di formare un immunocomplesso.

Il test sierologico è caratterizzato da elevata sensibilità e specificità.

Nel caso di saggio sierologico anticorpale si può anche discriminare tra le classi di

immunoglobuline che permette di valutare anche l'arco temporale durante il quale è avvenuto il

contatto tra l'ospite e il microrganismo infettante. Ricordo che le immunoglobuline M sono le

prime ad essere prodotte in risposta all'infezione, mentre le immunoglobuline G sono prodotte

più tardivamente.

Si distinguono diverse reazioni sierologiche:

1) reazione di precipitazione: è un test di d.m. indiretta, si usa un antigene solubile e

l'immunocomplesso formato dall'interazione antigene-anticorpo si presenta come precipitato

insolubile.

2) reazione di agglutinazione diretta: è un test di d.m. indiretta, si usa un antigene

corpuscolato e la formazione dell'immunocomplesso si appalesa con agglutinazione.

3) reazione di agglutinazione passiva: è un test usato per d.m. diretta ( in questp caso ricerco

l'antigene) e per d.m. indiretta ( in questo caso ricerco l'anticorpo). L'anticorpo specifico è

fissato a una particella corpuscolata come sferette di lattice e la formazione

dell'immunocomplesso si manifesta con agglutinazione in ammassi voluminosi.

4) reazione di immunofluerescenza: in base ai reagenti immunologici usati può essere diretta (

si usano anticorpi coniugati con un tracciante fluorescente per cercare l'antigene), o indiretta (

si usano anti-anticorpi coniugati con un tracciante fluorescente. Permette di avere

informazioni sulla localizzazione topografica dell'antigene o dell'anticorpo.

5) reazione immunoenzimatica diretta (ELISA)_ per diagnosi indiretta; reazione sierologica in

cui un siero immune o presunto tale è cimentato con un antigene fissato sul fondo di un

pozzetto. La formazione dell'immunocomplesso si evidenzia dal legame tra l'anticorpo e un

anti-anticorpo coniugato con un enzima in grado di idrolizzare un substrato determinandone

una variazione di colore.

6) reazione immunoenzimatica sandwich ELISA indiretta: per diagnosi diretta, reazione

sierologica in cui un materiale clinico contenente un antigene è cimentato con un anticorpo di

cattura fissato sul fondo di un pozzetto. L'immunocomplesso si forma ed è evidenziato dal

legame dell'antigene con un anticorpo della stessa specificità coniugato con un enzima in

grado di idrolizzare un substrato causandone una variazione di colore.

7) reazione immunoenzimatica WESTERN BLOT: è più specifico della reazione ELISA. È un

test di d.m.indiretta e si ricercano anticorpi specifici per singoli peptidi antigenici separati in

seguito a migrazione elettroforetica. L'agente patogeno è frazionato nei singoli componenti

polipeptidici mediante elettroforesi. Al termine della corsa elettrica, le proteine sono separate

in base al peso molecolare in diverse bande di migrazione e sono trasferite su strisce di

nitrocellulosa. Queste sono cimentate con il siero immune o presunto tale. Gli anticorpi si

legano in corrispondenza delle bande dei polipeptidi antigenici specifici. La formazione degli

immunocomplessi è evidenziata mediante un sistema di rivelazione costituito da

anti-anticorpi.

PRELIEVO DEL MATERIALE CLINICO

È necessario trattare tutti i campioni prelevati come potenzialmente pericolosi per rischio di

infezione, utilizzare dispositivi sterili e idonei per il campionamento e ridurre la possibile

contaminazione.

RICERCA DEI COMPONENTI DELL'AGENTE EZIOLOGICO

Da effettuare qualora l'agente eziologico non sia coltivabile. Si basa sull'ibridazione in situ: il

materiale nel quale si ricerca la presenza di un microrganismo patogeno è portato a

temperatura elevata in modo da provocare la denaturazione delle catene nucleotidiche delle

molecole di DNA. Si aggiunge al preparato una sonda formata da una sequenza

complementare ad una sequenza di DNA esclusiva del genoma ricercato. Si raffredda il

materiale consentendo il riappaiamento delle catene complementari. Se è presente una quota

di sonda molecolare legata al materiale presente nel preparato si dimostra la presenza del

microrganismo, il cui genoma presenta sequenze nucleotidiche complementari alla sonda.

SAGGI DI SENSIBILITÀ IN VITRO DEI MICRORGANISMI AI FARMACI:

L'antibiogramma consente di definire due valori:

1) MCI: minim concentrazione inibente ovvero la più bassa concentrazione in grado di

determinare una inibizione significativa della crescita microbica.

2) MBC e MFC: minima concentrazione battericida e fungicida, ovvero la più bassa

concentrazione del farmaco in grado di uccidere i microrganismi.

L'antibiogramma si può ricavare in due modi: antibiogramma in fase liquida e antibiogramma

in fase solida.

ANTIBIOGRAMMA IN FASE LIQUIDA: consente di determinare sia la mic che mbc mediante il

metodo di diluizione in brodo. Una serie di provette con un terreno di coltura liquido,

trasparente e idoneo per la crescita del batterio, sono inoculate con quantità decrescenti di

antibiotico e una quantità fissa di batteri. Dopo incubazione è valutata la torbidita' della

provetta. La quantità di farmaco contenuta nella prima provetta trasparente corrisponde alla

mic. Per determinare la mbc, sono prelevate delle aliquote di brodo dalle provette limpide e

seminate su piastra. La mancata comparsa di colonie indica la mbc.

ANTIBIOGRAMMA IN FASE SOLIDA:

Permette di valutare la sola mic e non la mbc, mediante il metodo di diffusione in agar

secondo Kirby-Bauer. Su una piastra si seminano i batteri. Sulla piastra si pongono dei