Plasticità cellulare (terza parte)

Metabolomica

Metabolomica è una disciplina che studia il profilo globale dei metaboliti di un sistema nelle diverse condizioni fisio-patologiche. Fa parte delle scienze omiche, insieme alla genomica, trascrittomica e proteomica, impiegate per la conoscenza globale della biologia dei sistemi. Risulta essere più sensibile in grado di rilevare cambiamenti in relazione a rapide variazioni, del contesto fornisce quindi informazioni dello stato attuale e complementari a quelle del genoma e dell'attività delle proteine.

Fenotipo e variabili biochimiche

Un fenotipo può essere definito, oltre che per le caratteristiche morfologiche e fisiologiche, anche da variabili biochimiche come i trascritti, le proteine e i metaboliti.

Metaboloma

Metaboloma è il set completo di metaboliti a basso peso molecolare (< 1500 Da) presenti in un sistema biologico in un dato momento e in determinate condizioni. Non esistono al momento tecniche e tecnologie che consentano di analizzare tutti i metaboliti contemporaneamente. Manifestazione più fedele dell'attività dei geni, infatti, indagare il metaboloma significa risalire alla funzione dei geni (retroazione positiva o negativa).

Fenotipo metabolico

Caratterizzato da una complessa rete metabolica:

• Identificazione e quantificazione dei numerosi metaboliti presenti nel sistema metaboliti risultano essere il risultato dell’interazione del genoma con il suo ambiente, influenzando essi stessi attività proteine e funzionalità geni.
• Misura dei flussi metabolici utilizzando substrati arricchiti con isotopi stabili non radioattivi.

Metaboloma vegetale

Vasto e diversificato, consiste principalmente di due tipi di metaboliti:

• Metaboliti primari
  • Zuccheri, nucleotidi, acidi grassi e proteine.
  • Coinvolti nelle funzioni di base della cellula vivente: crescita, sviluppo e riproduzione, produzione energia, biosintesi amminoacidici e altri composti necessari alla vita cellulare.
  • Importanti per lo studio: crescita e maturazione, resa agricoltura, effetto inquinanti, adattamenti a condizioni di crescita cambiamenti climatici o del suolo.
• Metaboliti secondari
  • Specie-specifici.
  • Non sono essenziali per la sopravvivenza.
  • Un ruolo nell’interazione cellule-ambiente o cellule con altre cellule nell’organismo: attrarre impollinatori, difendersi da insetti, microrganismi e malattie.
  • Importanti per: identificazione aromi, essenze e colori, comprensione meccanismi di resistenza contro patogeni e malattie, campo industriale, nutrizionale e farmacologico.

Presenta grandi difficoltà dipendenti dalla complessità della struttura delle stesse reti metaboliche:

• Vastità e variabilità del metaboloma >200.000 metaboliti secondari ad oggi noti.
• Estesa compartimentazione subcellulare. Traslocazione di precursori, intermedi e prodotti finali.
• Vie metaboliche identiche in diversi compartimenti. Regolazione organello-specifica.

Workflow dell’analisi metabolomica e metodi analitici in metabolomica

1. Preparazione del campione
   • Obiettivo: superare i metaboliti dalla biomassa non necessaria evitando la degradazione enzimatica.
   • Materiale vegetale: semi, tessuti, organi foglie, radici e frutti.
   • Step rapido, economico e semplice.
   • Consta di tre fasi:
     1. Raccolta del materiale vegetale.
     2. Quenching, raffreddamento rapido con azoto liquido.
     3. Estrazione con solventi: metanolo, etanolo, cloroformio e acetonitrile.
2. Analisi del campione
   • Obiettivo: identificare e quantificare i metaboliti.
   • Utilizzo di piattaforme analitiche come:
     • Spettrometria di risonanza magnetica nucleare ad alta risoluzione permette la misura quantitativa contemporanea di numerosi metaboliti.
     • LC-MS cromatografia liquida associata alla spettrometria di massa.
     • GC-MS cromatografia liquida associata alla spettrometria di massa.
3. Analisi e processamento dei dati
   • Obiettivo: classificare i campioni e ridurre la complessità.
   • Consta di tre fasi:
     1. Pre-processamento.
     2. Pre-trattamento.
     3. Analisi statistica dei dati:
        • ANOVA
        • PCA
        • PLS-DA
        • ASCA
4. Identificazione di biomarkers

Spettrometria di massa

La MS è spesso associata a procedure di separazione cromatografica come gas-cromatografia o cromatografia liquida ad alta performance. La gas-cromatografia mostra un'alta sensibilità e risoluzione; ed è generalmente utilizzata per l'identificazione di metaboliti. Questa accoppiata al metodo di spettrometria di massa “time-of flight” (TOF) si sta applicando con buoni successi nella metabolomica per ottenere una più alta accuratezza nell’identificazione dei metaboliti.

Le tecniche spettrometriche associate alla cromatografia liquida sono state utilizzate nell’analisi dei metaboliti polari. Per l'identificazione si impiega principalmente la cromatografia liquida (LC) accoppiata alla spettrometria di massa (MS), vengono utilizzate tecniche come:

• MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/ionization)
• ESI-MS (Ionizzazione elettrospray)

MALDI-TOF

(matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight) è una tecnica di ionizzazione soft usata in spettrometria di massa, condotta sottovuoto. Consiste nell’assorbire il campione su una matrice realizzata in vari materiali. La miscela di peptidi viene disciolta in una matrice costituita principalmente da solventi organici (glicerolo, acido caffeico, acido succinico). Una volta portata in soluzione viene successivamente bombardata con un fascio laser, spesso ad azoto grazie al fenomeno del desorbimento, il campione viene rilasciato in forma “clusterizzata”, ovvero complessato con la matrice. In seguito, questa matrice insieme al campione viene ionizzata e vaporizzata tramite l’energia in eccesso rilasciata secondariamente dalla matrice si ottengono ioni molecolari a singola carica. Questi ioni sono accelerati poi, all’interno di un tubo cavo da un’energia cinetica costante emessa da un generatore (TOF).

Vantaggi:

• Pretrattamento del campione molto ridotto o assente.
• Possibilità di analizzare numerosi campioni (un target MALDI-TOF può ospitare contemporaneamente sino a 96 campioni).
• Elevata rapidità nell’esecuzione dell’analisi.
• Elevata sensibilità (nell’ordine delle picomoli o femtomoli ossia 10^-12 o 10^-15 moli).
• La spettrometria di massa MALDI-TOF è in grado di fornire un fingerprint per ogni campione analizzato, ossia un profilo di peptidi e proteine/metaboliti del campione, ciascuno identificato da un valore di massa/carica. Il profilo ottenuto è caratteristico del campione e può essere utilizzato alla stregua di un’impronta digitale.

ESI (Electron Spray Ionization)

Tecnica utilizzata in spettrometria per produrre ioni utilizzando un elettrospray in cui ad un liquido viene applicata un’alta tensione in modo da creare un aerosol. Precisamente viene utilizzata una sorgente di ionizzazione che utilizza azoto per provocare una nebulizzazione. Il campione sciolto in un solvente passa in un tubo capillare sottoposto ad un campo elettrico, ottenuto applicando una differenza di potenziale. Il campione è nebulizzato e ionizzato. Il solvente evapora, le gocce si riducono in dimensione, fino a che la repulsione elettrica, che aumenta a causa della forte densità, supera la tensione superficiale della goccia. A questo punto la goccia scoppia generando una corrente indirizzata verso l’analizzatore.

Vantaggio: possibilità di formare ioni multicarica permette di analizzare biomolecole di grandi dimensioni, fino ad oltre 1.000.000 di Da.

Riassumendo (spettrometria di massa)

• Spettro di massa di valori m/z dell’analita ionizzato o frammentato.
• Identificazione confronto tra lo spettro di massa ottenuto con uno di quelli presenti in banca dati.
• Quantificazione (relativa - assoluta) altezza picchi.

GC-MS (Spettrometria di massa accoppiata con gas-cromatografia)

Vantaggi:

• Altissima risoluzione cromatografica.
• Alta sensibilità (10^-12 M).

Svantaggi:

• Richiede derivatizzazione per gli analiti non volatili: sostituzione dei gruppi –NH, -OH ed SH, per aumentare la volatilità degli analiti.
• Analisi dei metaboliti secondari complessa.

LC-MS (Spettrometria di massa accoppiata con cromatografia liquida)

Vantaggi:

• Maggiore gamma di metaboliti analizzabili.
• Maggiore sensibilità (10^-12 M).

Svantaggi:

• Buona risoluzione cromatografica.

Spettroscopia NMR

La NMR ha una sensibilità minore rispetto alle metodiche basate su MS, ma la sua applicazione presenta il vantaggio di ottenere un’analisi rapida e dettagliata della composizione biomolecolare (informazioni sulla struttura dei composti basandosi sulle proprietà chimico-fisiche dei nuclei che la compongono) di un estratto crudo vegetale richiedendo solo una preparazione relativamente semplice del campione.

Vantaggi:

• Preparazione semplice del campione.
• Alta risoluzione.
• Analisi rapida e dettagliata.
• Struttura fine dei composti (proprietà chimico-fisiche dei nuclei).
• Altissima riproducibilità.

Svantaggi:

• Minore sensibilità (10^-6 M).

La NMR misura l’assorbimento di radiazione elettromagnetica di frequenza radio in molecole immerse in un forte campo magnetico. Queste radiazioni provocano transizioni di spin nucleare in particolari atomi (tipicamente ¹H o ¹³C). Con la tecnica NMR sono osservabili solo i nuclei che possiedono un momento magnetico nucleare di spin, e che quindi si comportano come l’ago di una bussola che si può orientare in un campo magnetico applicato.

Parametri spettrali NMR

1. Chemical shift: spostamento della frequenza di assorbimento di un atomo per l'interazione con gli atomi circostanti; part., ppm.
2. L’intensità del segnale NMR è proporzionale alla densità nucleare presente, quindi mediante l’aggiunta nel campione di un composto di riferimento a concentrazione nota, sarà possibile analizzare quantitativamente tutti componenti presenti nel campione.

Dallo spettro NMR è possibile risalire a:

• Struttura molecolare (analisi qualitativa).
• Concentrazione (analisi quantitativa).

Analisi multivariata dei dati

I campioni sono raggruppati sulla base dell’analisi multivariata dell’intero campo di metaboliti (pattern recognition) portando eventualmente all’identificazione di metaboliti discriminanti (biomarkers). Tra le tecniche di analisi multivariata più usate abbiamo:

• PCA (Principal Component Analysis)
• PLS (Partial Least Squares)

Principal Component Analysis

• Metodo statistico usato per raggruppare i dati in modo aprioristico (senza imporre alcun vincolo di riconoscimento ai dati).
• Identifica i gruppi di dati con le stesse caratteristiche, riducendo la dimensionalità del data set.
• I dati sono rappresentati da vettori in un iperpiano a più dimensioni, con tante componenti quante sono le variabili originarie, cioè i metaboliti.
• I dati NMR consistono in una matrice di N osservazioni (i campioni) e K variabili (concentrazioni dei metaboliti).
• Ogni spettro NMR o campione è definito come un punto (coordinata) nello spazio.
• Score plot: rivela i possibili raggruppamenti dei campioni sulla base della loro similarità.
• Loading plot: rivela le variabili importanti per la discriminazione, permette di interpretare lo score plot.

Partial Least Squares (PLS)

Si utilizza quando si è alla ricerca di una relazione quantitativa tra una matrice di dati X che contiene i dati spettrali, e una matrice di dati che contiene le informazioni legate al gruppo a cui ogni campione appartiene (controllo e trattato). Applicando la PLS è possibile descrivere un sistema biologico mettendo in risalto la massima separazione tra le classi predefinite.

Le piante e la cosmesi

Già nel 4000 a.C. con gli egizi, passando poi a Greci, Romani, Cinesi e Giapponesi, i cosmetici sono sempre stati utilizzati:

• Olio di argan per la cura della pelle
• Succo di limone per sbiancare
• Estratto di petali di rosa per profumi

Una nuova tendenza della cosmetica sembrano essere le cellule staminali vegetali con potenti proprietà anti-age e di rigenerazione dei tessuti cutanei:

• Dolichos biflorus stimolatore di produzione di collagene
• Nicotiana sylvestris antirughe
• Malus domestica antiossidante
• Nymphea alba antinfiammatorio

Quando le colture cellulari sono un sistema utile per la produzione di metaboliti secondari?

Quando i metaboliti secondari per essere prodotti non necessitano di speciali strutture secretorie o differenziamento di organi. In questi casi è necessario utilizzare colture di organi o indurre rigenerazione di organi da colture cellulari.

Composti fenolici

Più di 4.000 differenti composti fenolici sono conosciuti e molti hanno proprietà biologiche interessanti:

• Flavonoidi ed antociani responsabili del colore di fiori e frutti.
• Flavoni proteggono le cellule dalle radiazioni UV.
• Stilbeni e procianidine sono ROS scavengers.

Vitis vinifera

Composti fenolici in Vitis vinifera:

• Antociani
• Stilbeni resveratrolo e viniferina

Attività antimicrobica dei cosmetici funzionali

Prodotti della cura personale che svolgono azione benefica:

• Cura dei capelli: shampoo antiforfora
• Cura della pelle: prodotti antiacne
• Cura igiene orale: dentifrici
• Igiene personale: saponi e deodoranti

Hair care

Quali microbi causano la forfora? I funghi appartenenti al genere Malassezia causano forfora e/o dermatite seborroica del cuoio capelluto. Nella dermatite seborroica si notano una scala giallastra più grande e un eritema del cuoio capelluto rispetto alla forfora.

Skin care

Malassezia species possono essere anche associati a diversi problemi della cute, come la follicolite. Ci sono evidenze sperimentali che alcuni prodotti antifungini sono benefici in pazienti con problemi di acne alla pelle. Ad oggi ci sono 14 specie conosciute di Malassezia.

Oral health care

Presenza di placca porta a:

• Carie dentali
• Gengiviti
• Malattie dentali

L’assenza di placca comporta:

• Denti puliti
• Alito fresco

Che cos’è la placca dentale batterica e come si forma?

È un insieme di germi (BIOFILM MICROBICO) che aderiscono alla superficie dentale:

1. Dopo alcune ore dal lavaggio dei denti si forma una pellicola di proteine salivari che favorisce l’adesione dei batteri.
2. I batteri in presenza di zuccheri si riproducono formando la placca e producendo acidi ed enzimi.
3. Tali acidi ed enzimi attaccano lo smalto disgregandolo, il che espone la dentina e la polpa dentaria all’attacco dei batteri che causano le carie.

La malattia parodontale è spesso dovuta ad una risposta infiammatoria al biofilm. Biofilm è una comunità strutturata di cellule batteriche racchiuse in una matrice polimerica autoprodotta e adesa ad una superficie inerte o vivente. La letteratura scientifica riporta la formazione dei biofilm da parte di una serie sempre più ampia di specie microbiche: tutti i tipi di superficie, incluso le foglie di piante di prezzemolo, protesi e presidi medici e persino i recipienti di alluminio usati per conservare combustibile nucleare spento, possono essere colonizzate da biofilm microbici. La struttura di un biofilm maturo varierà con la localizzazione, la natura dei microrganismi costituenti e la disponibilità dei nutrienti. La struttura di un biofilm può variare da densi strati confluenti di cellule (placche dentali o biofilm di catetere urinario) a microcolonie disperse o cumuli di cellule che fuoriescono da uno strato basale sottile (biofilm che si formano sulle superfici nelle acque naturali oligotrofiche).

Biofilms in dermatologia

• Acne
• Candidiasi
• Dermatite atopica
• Ferite

Un biofilm contenente differenti specie prende solitamente il nome di consorzio batterico, ed è quantitativamente più frequente di biofilm composti da singole specie. Ogni specie presente nel consorzio svolge differenti funzioni metaboliche e presenta solitamente diverso trofismo, richiesta di ossigeno o nicchia ecologica. In questo modo il consorzio è più efficiente senza che le diverse specie entrino in conflitto tra loro. Il biofilm è tenuto insieme e protetto.