Patologia sperimentale

Patologia sperimentale

Proff. Rovida, Dello Sbarba, Bianchini

A.A. 2021/2022

Patologia

sperimentale

Prof.ssa Elisabetta Rovida

A.A. 2021/2022

Patologia sperimentale (A.A. 2021/2022)

Parte 1 - Modelli di oncologia cellulare e molecolare

Lez. 1– Introduzione

Indicativamente, sulla base degli ultimi anni le malattie del sistema cardiocircolatorio e i tumori sono equivalenti in

termini di decessi annui. Sono due patologie che si contendono una causa di morte su tre circa. Si tratta di numeri

decisamente importanti, ecco perche è importante parlare di neoplasia. Qualche numero più specifico riguarda i “big

killers”, le prime 5 cause di morte oncologica. Il tumore con più alto tasso di mortalità a livello maschile è sicuramente

il tumore al polmone, poi colon retto al secondo posto e prostata terzo. Nel sesso femminile la causa di morte principale

è il cancro alla mammella, poi sempre colon retto e polmone. Un altro dato interessante è che per le persone più giovani

di 85 anni, dagli inizi degli anni 2000 il cancro è diventata la prima causa di morte.

Facendo un po' di nomenclatura, sia tumore che neoplasia hanno un’accezione neutra e si possono declinare entrambi

in maligno o benigno. Invece cancro e carcinoma sono esclusivamente riferiti a tumori maligno e si usano per indicare

tumori derivanti da epiteli, mentre i tumori di origine mesenchimali sono sarcomi. Altre definizioni riguardano il tumore

maligno come una crescita:

• Afinalistica, ovvero non hanno alcuna finalità nell’ospite, quindi la crescita del tessuto non è un tessuto che

deve accrescere, non ha una finalità fisiologica;

• Atipica, perche l’architettura del tessuto è alterata, fino all’anaplasia addirittura irriconoscibile;

• Autonoma, che di solito la crescita è ben regolata, fino a un certo punto della vita dell’individuo si ha crescita,

dopodiché dovrebbe smettere e inizia una crescita di queste cellule in modo totalmente autonomo;

• Aggressiva, sono condizioni che invadono completamente l’ospite e crescono a sua spesa.

Tra i termini importanti si trova pleomorfismo, molteplicità delle forme delle cellule tumorali, e poi bene ricordare che

oltre alla distinzione benigno/maligno, per avere una valutazione della prognosi e cura di un tumore, si associa anche la

stadazione TNM, dove rispettivamente T sta per dimensione e forma del tumore in cm, mentre N sta per “nodes” (nodi

in italiano) per valutare i linfonodi regionali coinvolti e M per metastasi. Accanto alla stadazione si ha il grading, ovvero

gradazione letteralmente e valuta il differenziamento, le caratteristiche di un tumore, come livello di differenziamento

o mancanza di differenziamento, dove più le cellule sono differenziate e minore è il grado del tumore e viceversa.

Ci avviciniamo agli aspetti che approfondiamo di più, ovvero le basi molecolari, ricordando che affinché si abbia una

neoplasia si deve avere un danno genetico non letale di una cellula dell’organismo. Infatti, se il danno è letale non può

derivare quel clone neoplastico che invece poi ne deriva. Semplificando, possiamo dire che i bersagli molecolari e quindi

i geni le cui mutazioni sono importanti per i fini tumorali, li possiamo racchiudere in poche funzioni tumorali: crescita e

proliferazione (oncogeni e proto-oncogeni) e geni coinvolti in morte cellulare apoptotica (oncosoppressori) e geni

addetti alla riparazione del DNA (è chiaro che se si ha mutazione nei sistemi di riparazione si favorisce l’accumulo

mutazionale e lo sviluppo di un fenotipo mutato). Per questi vari target la tumorigenesi è un meccanismo multistep che

richiede quindi molti anni per svilupparsi. Negli anni sono state identificate varie caratteristiche di un tumore, tra cui:

1. autosufficienza nei confronti dei fattori di crescita,

2. insensibilità a segnali anti-proliferativi (oncosoppressori),

3. invasività locale e a distanza (metastasi), - 1 -

4. potenziale replicativo illimitato (le cellule normali, o perche vanno in contro a morte o per motivi vari di

senescenza, per esempio, smettono di replicarsi in modo fisiologico, ma si riattivano nel caso di trasformazione

tumorale con riespressione dell’attività telomerasica),

5. attivazione dell’angiogenesi,

6. elusione all’evento apoptotico.

Un altro aspetto interessante è il fatto che un tumore non è fatto unicamente di cellule neoplastiche, ma è costituito da

tanti citotipi, di cui sicuramente le cellule tumorali sono una gran parte, ma non la sola. Infatti, è chiaro che il

microambiente (ciò che sta fuori dalla cellula ma nel suo intorno diretto) di un tumore dia un contributo

importantissimo allo sviluppo tumorale e nella visione detta eterotipica (la visione della presenza delle sole cellule

tumorali come unico citotipo viene detta come visione riduttiva) intorno al tumore non ci sono solo cellule del

parenchima del tumore, ma si ha un’influenza di molti fattori, un “cross-talk” con le cellule tumorali. La cellula tumorale

peraltro produce fattori di crescita che stimolano le cellule adiacenti (stimolazione eterotipica) del microambiente che

a loro volta producono vari fattori stimolando la crescita di cellule tumorali.

Ricordare anche che abbiamo i tre step di evoluzione del tumore iniziazione, promozione e progressione. Inoltre, è

importante ricordare la storia dell’evoluzione del tumore, ovvero ciò che succede alla neoplasia e gli effetti sul paziente

e nei tumori maligni si dà un po’ per scontato che se non si interviene dall’esterno l’esito finale è sempre con la morte

del paziente (rivedere slide di ripasso lezione 1 su Moodle). Tra i fattori genetici abbiamo fattori presenti ancestralmente

nei retrovirus e che sono stati trovati in vari organismi e è stato uno dei primi approcci sperimentali che hanno portato

a trovare oncogeni e oncosoppressori umani.

In particolare, vediamo un ripasso sui modi di attivazione degli oncogeni. In un gene si trova una regione detta

regolatoria in cui si legano fattori di trascrizione (fattori sia positivi che inibitori, il cui output netto definirà l’espressione

o meno del gene) che sta a monte del protoncogene (vale nel caso anche di un oncosoppressore). Si possono avere

mutazioni o delezioni nella sequenza genetica per cui la proteina codificata ha struttura o funzione alterata, sia in

positivo, aumentata, che negativo, diminuendone l’attività. Tali mutazioni possono portare a iper/ipo-espressione

proteica, oppure si ha una traslocazione genica per cui una sequenza regolatoria regola un altro gene diverso

dall’originale in modo diverso dalla condizione normale fisiologica originale. Altre ricombinazioni possono anche portare

a produrre proteine di fusione dette onco-proteine, con funzioni che possono essere sia aumentate che diminuite.

Ora vediamo una serie di alterazioni nel meccanismo di inattivazione di oncogeni: l’aumento del numero di copie del

gene (dunque iperespressione genica) e l’iperespressione delle proteine:

• Aumento del numero di copie di un gene verso la sua sovra-espressione. Ci interessa infatti capire quanta

proteina viene prodotta da un gene e bisogna capire come si può aumentare tale livello di espressione. L’effetto

citato di amplificazione genica consiste nell’aumento del numero di copie di un gene, quindi quasi

invariabilmente si ha aumento di produzione proteica. Si parla di casi di CNV, ovvero copy number variation

con guadagni o perdite di sequenze genetiche e si possono verificare con arrangiamenti strutturali di

cromosomi, che si dividono in arrangiamenti sbilanciati, come duplicazione in tandem o invertite, oppure

inserzione o delezione, ma abbiamo anche alterazioni come inversione e traslocazione che sono arrangiamenti

di tipo bilanciati. Si può però avere anche casi di aneuploidia/polipoloidia con aumento del numero di

cromosomi e quindi aumento del numero di copie. Per capire e vedere la presenza di queste variazioni di

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aumento del numero di copie di un gene si può fare analisi del DNA genomico, per vedere quanti mRNA sono

espressi da una cellula.

• Iperespressione proteica, invece, a differenza dell’aumento del numero di copie del gene, può essere dovuta

ad un’alterazione di una regione regolatoria o di fattori di trascrizione che la regolano, ma anche dall’instabilità

dell’mRNA oppure da alterazioni a carico della stabilità invece della proteina direttamente (aumento

dell’emivita proteica). In questo ambito si può fare analisi del tipo analisi del cDNA e analisi di proteomica.

Quindi, per prepararci a capire come possono alterarsi i segnali per indurre sostenuta proliferazione nelle cellule

tumorali, abbiamo finora visto i meccanismi di attivazione di oncogeni o inattivazione di oncosoppressori., con aumenti

“grossolani” del materiale genetico e vediamo quelle che sono le mutazioni possibili. Ci sono le mutazioni silenti in cui

per esempio si hanno la formazione di alleli equivalenti. Oppure abbiamo le mutazioni non senso che introducono

codoni di stop e ci sono almeno tre, poi le missenso che invece portano alla sostituzione amminoacidica e quindi la

sequenza della proteina sarà diversa e poi le mutazioni di tipo frame-shift che da quasi sempre la comparsa di un nuovo

codone di stop prematuro. In particolare, possiamo vedere che alcuni tumori presentano frequenza di mutazione

altissima, tra cui in primis il melanoma, con mutazioni spesso date da raggi UV. La mutazione di fatto ha un’accezione

sempre con evento non ben visto diciamo, però è molto importante questo carico mutazionale perché ad oggi, nel

cercare di sfruttare più approcci possibili, in tumori che portano a tantissime mutazioni, sono proprio sfruttate, a causa

dei tantissimi antigeni che vengono a crearsi, per l’immuno-terapia in cui si cerca di stimolare il SI per eliminare cellule

che esprimono qualcosa di diverso dal solito, in cui ci sono soprattutto neo-antigeni. Ma vale per esempio anche per i

tumori intestinale che hanno alta variabilità e tumori ricchi di eventi mutazionali. Andando a vedere le varie mutazioni

nelle varie neoplasie, infatti, si nota che di fatto ci sono tumori in cui si ha un’importante prevalenza di tumori frame-

shift, contrariamente per esempio ad altre come nel colon-retto in cui si ha soprattutto mutazioni non senso. Ed in

generale ci sono geni come TP53 (cromosoma 17) è mutato in quasi tutte le neoplasie, così come il gene Rb (cromosoma

13), ma analogamente con tutta la mole di dati individuata dallo studio dei vari tumori sono anche stati trovati tanti altri

geni fino ad oggi non conosciuti e notando che alcuni sono propri di alcune patologie e non di altre.

Come si diceva, ci sono varie mutazioni possibili, e da notare è che nella oncologia le mutazioni silenti non sono sempre

del tutto silenti, questo perché le mutazioni è qualcosa a livello del Dna che passa a livello dell’RNA e tanti altri step. Ci

sono varie regioni necessarie a questi step di processamento del DNA ed è importante ogni gradino, in particolare

soprattutto la sequenza del pre-mRNA, nonostante non sia l’mRNA maturo. In queste regioni si possono proprio avere

mutazioni funzionali che portano a variare l’emivita soprattutto dell’mRNA, he significa andare a far variare la quantità

di espressione del trascritto stesso. Di fatto geni molti importanti come TP53 o oncogeni, la cui attivazione dipende dalla

quantità della proteina, questi meccanismi, quando vedono soprattutto mutazioni nelle regioni UTR-3’ possono portare

a aumento del prodotto proteico e attivazione di molti oncogeni.

Fra le mutazioni non senso ci sono geni, come APC, oncosoppressore coinvolto nella FAP, ma anche il gene CDH1

codificante per la E-Caderina, ovvero una proteina adesiva di membrana che di solito è importante per il mantenimento

delle giunzioni cellula-cellula a livello epiteliale, tessuto in cui i legami date dalle giunzioni tra le cellule hanno due

funzioni importantissime: inibizione da contatto per inibire la crescita quando il tessuto è già formato, e poi ostacolano

il processo di transizione epitelio-mesenchima, che quando avviene permette alle cellule di rendersi autonome e

acquistare anche motilità e invasività. Dunque, la perdita di E-Caderina chiaramente a si che si abbia l’avvio di questa

EMT avviando segnali di proliferazione, auto-mantenimento, invasività, motilità, migrazione e differenziamento. Infatti,

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di solito quando le cellule epiteliali se si distaccano vanno in contro a morte fisiologica detta anoikis, una forma di

apoptosi, mentre le cellule tumorali acquistano tutta questa serie di caratteristica. Quindi la E-Caderina avrebbe un

ruolo simil-oncosoppressore. L’altra mutazione tipica come detto è a carico del gene APC, tipica per la poliposi

adenomatosa familiare, e così come la E-Caderina si parla di oncosoppressori che rientrano tra le malattie autosomiche-

dominanti, ovvero in cui si eredita una prima mutazione, il classico first-hit, a livello unicamente germinale che poi porta

a rendere sufficiente a livello somatico una seconda mutazione per generare il fenotipo tumorale e il passaggio della

cellula da una condizione sana a una tumorale patologica. Questo è ciò che avviene proprio nella FAP, in cui APC spesso

viene mutato con mutazioni non senso, ma a volte non è raro che avvengano mutazioni frame-shift. Citiamo anche la

forma HNPCC del cancro al colon che avviene quando ci sono mutazioni ereditate per via germinale e che vedono geni

di riparazione del DNA (ricorda le mutazioni MSI, di instabilità a livello dei microsatelliti).

Un’altra cosa molto improtante sono le mutazioni missenso che causano la formazione di un codone diverso da quello

originale. Un esempio è la proteina BRAF appartenente alla famiglia di proteine RAF, e si può avere transversione di una

T in una A e si sostituisce una Val in acido glutammico in posizione 600 e lo troviamo nel 50% dei pazienti con melanoma.

Questo tipo di mutazione in BRAF è tipica anche nei néi, però vanno in senescenza senza andare in contro a melanoma.

Di fatto si parla di una driver-mutation, ovvero una mutazione che crea un vantaggio selettivo al tumore per la sua

crescita e proliferazione. Ovviamente dicevamo che questa mutazione non è una cosa buona, ma la presenza di “geni

del cancro” e quindi tutte le anomalie tipiche di un tumore, spesso li usiamo anche per cercare dei target terapeutici, e

in particolare la proteina BRAF mutata è proprio un fattore antigenico perche sono stati identificati fattori capaci proprio

di bloccare questa proteina, ma NON la proteina BRAF wt, in cui per esempio diamo i farmaci Dabrafenib o Vemurafenib

che inibiscono selettivamente UNICAMENTE le forme mutate di BRAF, ma non la forma wt. La mutazione V600E è molto

comune anche se ci sono tante varianti, come la V600K in cui la sostituzione avvien con una Lys invece di acido

glutammico, anche se la V600E (Val-Acido glutammico) è la più frequente di gran lunga. Di fatto quindi una driver-

mutation si differenzia da una passenger-mutation, dove queste ultime sono quelle mutazioni che ci sono ma non

danno un vantaggio selettivo alla proliferazione, mentre quelli che lo danno solo detti driver mutations e sono anche

detti cancer-genes.

Lez.2 - Segnali proliferativi sostenuti nel tempo

Ricordiamo che nella cellula i segnali arrivano dall’ambiente extracellulare e è vero quasi sempre, soprattutto parlando

dei recettori per i fattori di crescita, fattori di origine peptidica ed è importantissimo ricordarlo perché un polipeptide

non attraversa una membrana plasmatica che invece potrebbe fare una molecola piccola o lipidica. Quindi questo fa sì

che si necessiti di un recettore di membrana attraverso cui si verifica il contatto ligando recettore e trasdurre il degnale

della cellula a livello citosolico e poi in fine al nucleo. Quindi tutto questo passaggio vede alterazioni specifiche in ciascun

attore della trasduzione del segnale. Ricordiamo anche un'altra cosa, le cellule contattano tra loro in modo endocrino,

paracrino, autocrino, yuxtacrino e intracrina. Endocrina quando la cellula o il tessuto che produce il fattore di crescita è

lontano dalla cellula target; infatti, ricordiamo che ce sempre una cellula che produce e una che riceve il segnale e si

sfrutta il torrente ematico per il trasporto. Si indica in modo paracrino quando si ha una vicinanza tra le due cellule e

quindi la molecola si può anche muovere per diffusione, poi yuxtacrina quando le cellule sono accanto l’una all’altra,

autocrina e intracrina quando la cellula stimola sé stessa, nel primo caso quando il fattore stimola un recettore di

membrana extracellulare, ma a volte succede che il ligando contatti il recettore direttamente nella cellula in modo

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intracrino. Inoltre, segnaliamo un’altra cosa improtante da ricordare, ovvero avere presente che i fattori di crescita

possono essere dimerici e si capisce bene come per esempio il recettore di tipo Tyr-chinasici debbano dimerizzare per

funzionare, in altri casi i recettori sono monomerici e è proprio il ligando che permette di indurre l’aumento di affinità

tra recettori per dimerizzare.

E ricordiamo come avevamo detto della stimolazione eterologa all’interno della cellula e come si era detto nella lezione

precedente, all’interno di un singolo tumore ci sono tantissime cellule che ci fanno proprio capire la complessità dei

fattori di crescita ritrovabili nel tumore e che caratterizzano proprio il tipico microambiente tumorale.

Tutto questo ci fa capire che i vari segnali che derivano e che stimolano una cellula tumorale sono tantissimi che portano

alla generazione di una forma di autoinsufficienza dei segnali proliferativi che portano in ultima istanza al potenziale

replicativo illimitato e quindi iper-proliferazione. Vediamo i vari step più importanti che si verificano proprio per

generare questo stato tipico delle cellule tumorali:

• Intanto quindi si ha il passaggio da una produzione regolamentata di questi vari fattori a una produzione

sostenuta nel tempo o cron