Patologia molecolare Mackay

Lista oncogeni e oncosoppressori

Oncogeni

Classe 1 - Fattori di crescita

nada

Classe 2.0 - Recettori tirosin-chinasici

• Erbb1 + Erbb2
• Trk
• Trk-T3
• Delta TrkA
• Ros
• Fms
• C-met
• C-ret
• C-kit

Classe 2.1 - Oncogeni tirosin-chinasici non recettoriali

• Famiglia delle Src: c-src, c-yes, fgr, src-2, c-fyn e c-lyn (non rilevanti)
• Famiglia ABL: v-abl (non rilevante) e c-abl
• Fps-fes

Classe 3 - Recettori senza attività tirosin-chinasica

• Mas-1 (non troppo rilevante)

Classe 4 - Proteine G associate alle membrane

• H-Ras
• K-Ras
• N-Ras
• Gsp e Gip (non rilevanti)

Classe 5 - Serin-treonin chinasi citoplasmatiche

• C-raf
• C-mos
• C-pim
• Cot o MAP3K8

Classe 6 - Regolatori citoplasmatici

• Crk

Classe 7 - Fattori trascrizionali

• Famiglia Myc: C-myc, N-myc, C-L-myc
• C-Jun o AP1
• C-fos
• C-Myb
• C-ski
• C-ets
• C-ErbA
• C-Rel + Rel-A + Rel-B

Oncogeni non classificati

• MCF-2 o dbl
• Bcl-2

Lista oncosoppressori

1. APC
2. p53
3. p14ARF
4. NF-2
5. WT-1
6. DCC
7. pRb
8. BRCA-1
9. BRCA-2
10. CDH1 (gene per la E-caderina)
11. VHL
12. RASSF-1A
13. Superossido dismutasi-2
14. miRNA

Definizione oncogene

Un oncogene è un gene che codifica per una proteina, capace di indurre la trasformazione cancerogena di una cellula normale, alterandone la proliferazione e il differenziamento. Gli oncogeni sono presenti normalmente in tutte le cellule in forma non patogena (proto-oncogeni) e la loro attivazione è dovuta a errori spontanei e non riparati durante la replicazione cellulare, all’esposizione a particolari agenti fisici (radiazioni ionizzanti, raggi UV), chimici o a trasduzione virale. Il primo oncogene fu scoperto in un retrovirus dei polli nel 1970 e fu chiamato Src (pronunciato SARC). Molti virus tumorali contengono oncogeni.

Proto-oncogeni

Un proto-oncogene è un gene normale che può diventare oncogenetico a causa di mutazioni, o di un aumento dell'espressione. I proto-oncogeni codificano proteine che regolano il ciclo cellulare e il differenziamento. Possono anche essere coinvolti nella trasduzione del segnale di avvio della mitosi.

Attivazione

Un proto-oncogene diviene un oncogene anche con minime modificazioni delle sue funzioni originali. Tali modificazioni avvengono a carico del DNA. Ci sono tre tipi fondamentali di attivazione:

1. Mutazione puntiforme grave (inserzioni, delezioni, sostituzioni di base, traslocazione o inversione), che produce una proteina diversa o non funzionale (es. tronca), causando:
   • Un aumento dell'attività enzimatica della proteina
   • La perdita dei siti di regolazione
   • La creazione di proteine chimeriche (traslocazione)
   L'effetto delle mutazioni puntiformi dipende da che parte del gene bersaglio colpiscono:
   • Regione codificante: qui possono causare sostituzione di base e quindi sostituzione di aminoacidi. Grazie alla ridondanza del codice genetico, alcune mutazioni puntiformi di questo tipo non causano problemi, in quanto più codoni codificano per uno stesso aminoacido. Nei casi più gravi, si ha proprio la sostituzione consistente di un aminoacido, che è diverso chimicamente e funzionalmente dall'originale. Spesso si ha una proteina non funzionale (che può essere tronca se con la sostituzione si genera un codone di stop precoce).
   • Enhancer/promotore: qui, le mutazioni possono causare l'espressione abnorme fuori tempo e fuori luogo della proteina finale.
   • Mutazioni in UTR 3' non codificante: qui si possono avere problemi con la poliadenilazione, che portano a una proteina non funzionale (la proteina finale, non avendo un'adeguata coda di poli-A, verrà degradata nel citosol), oppure si possono avere problemi con l'interazione mRNA-miRNA (i miRNA legano gli mRNA bersaglio quando questi codificano per proteine già presenti in quantità sufficienti nella cellula; i miRNA legati ai mRNA bersaglio hanno la funzione di reprimerne la traduzione, o di degradarli, quindi se tale legame è impossibilitato, quella proteina verrà abnormemente espressa).
2. Un aumento della concentrazione di proteine, causata da:
   • Un aumento dell'espressione genica (attraverso misregolazione)
   • Un aumento della stabilità (emivita) della proteina
   • Una duplicazione o amplificazione del gene che codifica per la proteina
   Nella maggior parte dei casi, l'attivazione dell'oncogene porta ad amplificazione genica, causata da polisomia, dalla formazione di regioni cromosomiche HSR e/o di cromosomi double minute.

Protein chinasi

Ci sono sette (+1) classi di protein chinasi e di proteine correlate che sono potenziali oncogeni:

1. Fattori di crescita
2. Recettori tirosin-chinasici: diventando oncogeni, divengono costitutivamente (permanentemente) attivati, ad esempio il recettore per il fattore di crescita epidermico (EGFR), il recettore per il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFR), e il recettore per il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGFR).
3. Tirosin-chinasi citoplasmatiche (non recettoriali): es. enzimi tirosin-chinasici della famiglia Src o Abl
4. Recettori senza attività tirosin-chinasica
5. Proteine G associate regolatorie: es. Ras. Mutazioni che attivano in modo permanente Ras si riscontrano nel 20-25% di tutti i tumori umani e fino al 90% in alcuni tipi di tumore, ad esempio pancreatici.
6. Serin/treonin chinasi citoplasmatiche: es. Raf chinasi e chinasi ciclina-dipendente
7. Proteine adattatrici nella trasduzione del segnale (regolatori citoplasmatici): es. CRK
8. Fattori di trascrizione: es. gene Myc, Jun, Fos, Myb, ErbbA

RAS e proteine G monomeriche

RAS è un gene che codifica per la proteina G monomerica RAS stessa. La sua attivazione conduce a segnali che portano a:

• Crescita cellulare
• Stimolo alla progressione del ciclo cellulare

Nel genoma umano, vi sono tre geni che codificano per tre RAS diverse:

• Ki-RAS
• H-RAS
• N-RAS

Come tutte le proteine G, RAS funge da intermediario tra un recettore transmembrana RTK (“recettore accoppiato a proteine G”) e una serie di diversi tipi di chinasi. Il compito di RAS è di attivare queste ultime, affinché queste fosforilino ulteriori fattori di trascrizione citoplasmatici (es. Myc, AP1), i quali produrranno una risposta cellulare come conseguenza dello stimolo iniziale.

Approfondimento - Oncogene RAS (proteina G monomerica)

Meccanismo di funzionamento di RAS (in questo caso, K-RAS)

1. Un ligando (neurotrasmettitore o ormone, ad esempio EGF o PDGF) si lega a un recettore tirosin-chinasico accoppiato a proteine G (TRK), posto sulla membrana cellulare.
2. Il recettore in questione, dopo il legame col ligando, cambia la sua conformazione e si riesce a dimezzare con un altro recettore tirosin-chinasico vicino, questi due recettori si fosforileranno a vicenda, attivandosi.
3. Il primo recettore attivo, tramite una proteina adattatrice, recluta il fattore di attivazione GEF.
4. GEF promuove l'attivazione di RAS, legandosi ad esso e staccando il GDP, in modo che possa essere sostituito dal GTP.
5. Una volta che il GTP è legato a RAS, RAS si è attivato e GEF si stacca.
6. RAS attivo, a sua volta, attiva una serin-treonina chinasi di nome RAF (l’isoforma c-RAF di RAF, è la più comune ed è presente in tutti i tessuti).
7. RAF attivo, a sua volta, fosforila una serie di fattori della cascata citoplasmatica, tra cui le MAP chinasi, che attiveranno una serie di fattori di trascrizione (es. Myc, AP1), i quali produrranno delle risposte cellulari finali allo stimolo iniziale.
8. Una volta svolto il suo compito, RAS viene disattivata. La sua disattivazione è promossa da una proteina avente attività GTPasica, detta GAP.
9. GAP promuove l'idrolizzazione del GTP in GDP + Pi.
10. Il GDP si riattacca a RAS, disattivandolo.

Ma se RAS è mutato?

Se RAS è mutato, non riesce ad essere disattivato, in quanto perde la capacità di interagire con i suoi fattori regolatori GEF e GAP, quindi rimane sempre attivo. Rimanendo sempre attivo, attiva in continuazione i suoi bersagli e di conseguenza si avranno:

• Crescita cellulare abnorme
• Ciclo cellulare continuo e sballato

RAS è frequentemente mutato in molti tipi di cancro, tra cui:

• Cancri ematopoietici
• Carcinoma del colon retto (K-RAS)
• Cancro pancreatico
• Cancro del polmone non a piccole cellule
• Cancro del tratto biliare
• Carcinoma epato-cellulare (K-RAS)

A volte può succedere che ad essere mutato non sia RAS stesso, ma i geni che codificano per GEF e GAP, o, addirittura, il problema potrebbe essere ancora più a monte e colpire i geni che codificano per i fattori regolatori di GEF o GAP (come NGF).

Approfondimento - Proteine G eterotrimetriche

Sono un’altra classe di proteine G, formate da tre subunità:

• Subunità α
• Subunità β
• Subunità γ

A cosa servono le proteine G?

In generale, le proteine G svolgono la funzione di trasmettitore di segnali all’interno della cellula (possono quindi essere considerate come interruttori molecolari, il cui stato di 'acceso' o 'spento' è dovuto al legame e all’idrolisi del GTP). Le risposte finali di trasmissione includono l’inibizione o l’attivazione di enzimi che regolano la produzione di secondi messaggeri. In particolare i bersagli delle proteine G sono:

• Adenilato ciclasi: la cui attivazione porta alla produzione di cAMP
• Canali ionici di membrana: in particolare i canali per il K+ e per il Ca²⁺
• Fosfolipasi C: la cui attivazione porta al rilascio di ioni Ca²⁺ intracellulare

A tal proposito, in base a come agiscono sul secondo messaggero, si distinguono vari tipi di proteine G eterotrimetriche:

• Proteine G stimolatrici (G_s): attivano l'adenilato ciclasi, quindi la sintesi dell'AMP ciclico (cAMP)
• Proteine G inibitorie (G_i): inibiscono l'adenilato ciclasi
• Proteine G_q: attivano la fosfolipasi C, con conseguente produzione dei secondi messaggeri IP3 e DAG. DAG determina aumento del Ca²⁺ intracellulare.

Meccanismo di funzionamento delle proteine G eterotrimetriche

In generale, le proteine G sono:

• Attive quando legano il GTP
• Disattivate quando legano il GDP

Quando un RTK associato a proteina G lega un ligando (ormone, neurotrasmettitore), l’RTK stesso cambia di conformazione e attiva la proteina G.

1. Un ligando si lega al recettore TRK associato alla proteina G.
2. Il recettore cambia di conformazione e tramite una serie di interazioni proteiche, recluta GEF.
3. GEF si lega con la proteina G e fa in modo che il GDP legato alla proteina G sulla subunità α si stacchi, in modo da far legare al suo posto il GTP.
4. Una volta che il GTP si è legato alla proteina G (sempre sulla subunità α), quest’ultima si attiva e GEF si stacca.
5. La proteina G attiva subisce un cambio conformazionale che porta le sue tre subunità a separarsi:
   • Subunità α: lega il GTP ed ha attività GTPasica.
   • Subunità β/γ: sono fortemente associate e non si staccano l’una dall’altra.
6. La subunità α legante il GTP si muove lungo la membrana plasmatica, fino a quando non incontra l’enzima adenilato ciclasi e interagendovi, lo attiva.
7. L’adenilato ciclasi attivo produce sostanziali quantità di AMP ciclico (cAMP) a partire dall’ATP.
8. Il cAMP, che funge da secondo messaggero, va ad interagire con diverse proteine chinasi citoplasmatiche (es. PKA o proteina chinasi dipendente da cAMP), le quali fosforilano altre proteine, producendo una risposta cellulare conseguente allo stimolo ricevuto inizialmente.
9. Svolto il suo compito, la proteina G viene disattivata grazie a GAP, che promuove l’idrolisi del GTP legato alla subunità α, in GDP + Pi.
10. La subunità α legante il GDP torna sulla proteina G e il ciclo si ferma.

Definizione oncosoppressore

Un gene oncosoppressore è un gene che codifica per prodotti che agiscono negativamente sulla progressione del ciclo cellulare, proteggendo in tal modo la cellula dall'accumulo di mutazioni potenzialmente tumorali. Gli oncosoppressori favoriscono la differenziazione cellulare o l'apoptosi in caso di danno irreparabile al DNA. Quando tali geni sono assenti o inattivati (ad esempio in seguito all'insorgenza di una mutazione), la cellula può progredire verso la trasformazione in cellula cancerosa, solitamente in presenza di altre modificazioni genetiche.

Alla base della loro scoperta vi è la two-hit hypothesis (ipotesi dei due colpi), elaborata nel 1971 da Alfred George Knudson in merito a casi di retinoblastoma. Egli ipotizzò che fossero sufficienti mutazioni a carico di un singolo gene, ma che tale gene dovesse essere mutato presso entrambi gli alleli, affinché si manifesti un effetto. Ciò è dovuto al fatto che, qualora un solo allele sia danneggiato, il secondo resterebbe in ogni caso in grado di generare una proteina corretta. Le mutazioni degli oncogeni, invece, coinvolgono solitamente un singolo allele. In altre parole, le mutazioni dei geni oncosoppressori sono solitamente recessive, mentre quelle degli oncogeni sono comunemente dominanti.

Funzioni degli oncosoppressori

I geni oncosoppressori assolvono ad una grande varietà di funzioni, generalmente in contrasto con le funzionalità espresse dagli oncogeni. Se gli oncogeni infatti, nella maggioranza dei casi, presidono a tutti i meccanismi di accrescimento e proliferazione cellulare, gli oncosoppressori si pongono come limite a tali funzioni. Più nel dettaglio, le funzioni degli oncosoppressori possono essere le seguenti:

• Repressione di geni essenziali per la prosecuzione del ciclo cellulare. Se tali geni non sono espressi, la cellula non sarà in grado di progredire verso la mitosi.
• Interruzione del ciclo cellulare in caso di DNA danneggiato. Finché in una cellula è presente DNA danneggiato non riparato, essa non è in grado di dividersi. Solo se il DNA viene riparato, la cellula può proseguire con il ciclo.
• Avvio dell'apoptosi. Se il danno non può essere riparato, nella cellula viene avviata l'apoptosi, un processo di morte cellulare programmata che rimuove il rischio che tale cellula possa nuocere all'organismo.
• Soppressione di metastasi. Diverse proteine coinvolte nell'adesione cellulare sono in grado di impedire alle cellule tumorali di disseminarsi nell'organismo (un processo definito metastasi) e di ripristinare l'inibizione da contatto.

Oncosoppressore p53

p53 è la sigla della proteina codificata dal gene oncosoppressore TP53 localizzato sul cromosoma 17. È un oncosoppressore che fu trovato per la prima volta nell’antigene T del virus SV40. All’inizio si pensava che fosse un oncogene, ma poi la sua vera natura di oncosoppressore è stata verificata grazie al saggio LOH.

Funzioni di p53

1. Arresta il ciclo cellulare in G1 in caso di danno al DNA (così da dare tempo ai meccanismi di riparazione del DNA di sistemare il danno).
2. Promuove l’apoptosi delle cellule (solo se i danni al DNA sopracitati sono irreparabili).

Mutazioni di p53

p53 smette di svolgere le sue funzioni nel momento in cui viene soppresso, ossia quando vi sono:

• Delezione
• Mutazione

Quando p53 è inibita, avremo:

• Apoptosi impedita
• Ciclo cellulare inarrestabile, con proliferazione abnorme

L’assenza di p53 è stata correlata con la sindrome di Li Fraumeni, ossia una patologia caratterizzata dallo sviluppo precoce di tumori diversi (la correlazione tra p53 e sviluppo tumorale si è dimostrata con l’uso di topi knock-out per il gene p53). p53 è, inoltre, il gene più mutato in molti tumori sporadici, come quelli al polmone, ovaio, mammella, cervello, fegato, stomaco, osteosarcomi, prostata e leucemia mieloide cronica.

Come blocca il ciclo cellulare p53?

Quando non vi è danno al DNA, p53 è legato alla proteina MDM-2, la quale ubiquitina p53 e la indirizza al proteasoma per la degradazione (MDM-2 inibisce l’attività di p53). Quando vi è danno al DNA dovuto a un fattore fisico/chimico (es. radiazioni), p53 viene fosforilata a livello dei suoi residui di serina/treonina da ATM o da ATR (i siti da fosforilare si trovano vicino al legame con MDM-2). p53 fosforilata si stacca da MDM-2 ed entra nel nucleo, dove va ad interagire con p21.

p21 funge da fattore di trascrizione, che, una volta attivato da p53, porta al blocco del ciclo cellulare, in quanto blocca il complesso CDK4-CDK6/Ciclina D. Per indurre il blocco nella fase G1, p53 reprime anche la trascrizione di altri geni coinvolti nella regolazione del ciclo cellulare, quali fos e jun (che codificano le subunità del fattore di trascrizione AP1) e il gene RB1. Una volta attivato il blocco del ciclo cellulare, p53 stimola la sintesi di proteine riparatrici del DNA, come GADD-45.

Invece, quando vi sono stimoli iperproliferativi causati da oncogeni (e non danni al DNA), p53 viene attivata dall’oncogene p14ARF, il quale rimuove MDM-2, liberando e stabilizzando p53, affinché possa svolgere il suo ruolo nel modo sopracitato. N.B. p14ARF è un sensore di stimoli iperproliferativi provenienti dagli oncogeni e viene attivato SOLO dagli stimoli prodotti da oncogeni.