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patologia generale ed immunologia

Facoltà di Odontoiatria: Appunti di patologia Generale approfonditi su: Ipertrofie ed iperplasie Tumori: classificazione, diagnosi, cancerogenesi (virale, da agenti fisici, chimica...), gli oncogeni, crescita tumorale, metastasi, tumori ed ormoni, terapia, Immunologia (Anatomia, genetica, la risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata), cellule staminali, proteine plasmatiche, Anemie, Allergie. Vedi di più

Esame di Immunologia e patologia generale docente Prof. R. Perego

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proteine coinvolte nella morte cellulare programmata: non avviene il processo apoptotico e l’anomalia

genetica viene trasmessa alla progenie cellulare.

Esame Citodiagnostico:

Le caratteristiche morfologiche delle cellule neoplastiche vengono studiate con l’ausilio del microscopio

ottico sia su sezioni sitologiche che su cellule dissociate. Nel primo caso di parla di istodiagnostica e nel

secondo di citodiagnostica, esame che si sta rivelando di grande importanza in quanto permette l’analisi di

cellule presenti in liquidi di versamento, secrezioni, broncolavaggio e di cellule neoplastiche insorte in un

sito anatomico accessibile mediante l’introduzione di un ago sottile. Il primo esame citodiagnostico fu

effettuato nel 1928 mediante strisci allestiti con materiale prelevato dalla vagina con l’uso di una spatola.

L’utilità di tale esame fu non solo nella possibilità di rintracciare cellule neoplastiche, ma anche alterazioni

cellulari raggruppate sotto il termine generico di Lesioni pre-neoplastiche. Col tempo, sotto tale nome

generico furono raggruppate altre terminologie, riferite a differenti morfologia cellulari sempre di natura

pre-cancerogena:

-Displasia: definita come “variazione delle dimensioni, aspetto e organizzazione delle cellule differenziate

presenti in quel tessuto”. Tali displasie, a seconda dell’entità delle atipie cellulari e del coinvolgimenti dei

vari strati dell’epitelio, possono essere classificate in differenti modi . Alcuni citopatologi differenziano la

displasia lieve dalla moderata e dalla severa, mentre altri definiscono la displasia lieve e moderata come

“borderline lesions”, ovvero alterazioni al confine della malignità, e quella severa come “carcinoma in situ”.

Quest’ultima definizione può essere identificata come “neoplasia intraepiteliale” e corrisponde ad una

neoplasia di origine epiteliale non invasiva e confinata nell’epitelio in cui è insorta, senza che la membrana

basale che divide l’epitelio dal derma sottostante sia stata superata. Tale carcinoma in situ è tuttavia

suscettibile del rischio di diventare invasiva se le cellule neoplastiche superano la membrana basale.

Un esempio di displasia è quello che può verificarsi a livello cutaneo, dove a livello dello strato superficiale

si possono localizzare le cellule indifferenziate tipiche strato basale.

Figura 1 (in altro a SN): Esame citologico di un Pap test: se si nota la presenza di numerose cellule dotate di

un grande nucleo e di una scarsa presenza di citoplasma, si è di fronte ad una displasia.

Figura2 (in alto a DX): Carcinoma in situ.

-Metaplasie: Anomalia del processo di differenziazione. Per metaplasia infatti si intende il cambiamento

sotto l’aspetto morfologico di un determinato citotipo, in un altro con diversa differenziazione nell’ambito

della stessa categoria tissutale. Un esempio è la trasformazione dell’epitelio cilindrico ciliato bronchiale in

epitelio pavimentoso o dell’epitelio cilindrico monostratificato dell’endocervice con epitelio piatto

pluristratificato (quest’ultima metaplasia si manifesta spesso in processi flogistici cronici).Il segnale che

provoca ciò è definito “Aberrante” ed un esempio può essere il fumo di sigaretta.

Figura 5 Metaplasia: in questa immaginesi può notare come cellule ghiandolari di tipo intestinale si trovino a livello esofageo.

-Leucoplachia (ipercheratosi o paracheratosi): E’ la trasformazione a carico di un epitelio pluristratificato,

che può andare incontro ad una corneificazione, laddove tale corneificazione non è normalmente prevista.

Nella cervice uterina tale fenomeno può manifestarsi in caso di infezioni da papilloma virus (HPV) o di

prolasso uterino.

In generale, dall’esame citodiagnostico, è possibile risalire a tre classi:

Classe I: striscio costituito da cellule normali

Classe II: striscio caratterizzato sotto l’aspetto morfologico da modeste alterazioni citoplasmatiche e

nucleari, non compatibili con una condizione neoplastica.

Classe III: striscio con cellule che presentano anomalie nucleari e citoplasmatiche di dubbia interpretazione

le quali, per questo motivo, danno adito al sospetto di probabile presenza di un processo neoplastico.

Classe IV: striscio nel quale si individua la presenza di cellule neoplastiche in numero contenuto.

Classe V: striscio nel quale si individua la presenza di numerose cellule neoplastiche.

Tumori:

Le popolazioni cellulari di un organismo possono subire, in seguito a mutazioni genetiche, l’alterazione della

funzione delle proteine coinvolte nei segnali per la proliferazione. Tali popolazioni, generalmente di origine

monoclonale, subiscono così una trasformazione neoplastica poiché infatti la caratteristica principale delle

cellule neoplastiche è l’anomalia a livello della proliferazione, che diviene autonoma ovvero non risponde

più ai segnali che la regolano. Normalmente, in seguito a mutazioni a livello del DNA, si innescano una serie

di regolazioni che ne permetterebbero la riparazione o, nel caso in cui il danno non risulti essere riparabile,

la morte dell’intera cellula per apoptosi. Nel caso di cellule tumorali il processo apoptotico che si genera in

caso di danno genetico non riparabile, viene inibito, con conseguente proliferazione di cellule aventi

mutazioni geniche.

I tumori possono insorgere in tutti i tessuti, anche laddove la proliferazione cellulare è molto ridotta o

persino nulla. Questo avviene perché tutte le cellule presentano gli stessi geni sebbene citotipi specifici

esprimano geni specifici. In caso di anomalie genetiche, cellule che normalmente non si dividono possono

incominciare a proliferare in maniera incontrollata. E’ questo il caso del neuroblastoma, un tumore maligno

che insorge a livello dei tessuti nervosi soprattutto negli infanti ed in generale nei bambini in età prescolare,

che coinvolge cellule normalmente incapaci di dividersi, i neuroni appunto, ma che una volta riacquisita tale

capacità subiscono una trasformazione neoplastica.

In seguito a biopsia ed attraverso l’analisi di specifici parametri biologici, è possibile suddividere i tumori in

due grandi gruppi, a seconda delle proprie caratteristiche morfologiche, delle attività proliferative e del

comportamento biologico nei confronti dei tessuti limitrofi:

-Tumori benigni:

Grado di differenziazione : le cellule che lo costituiscono presentano un grado di differenziazione

o elevato, presentandosi con caratteristiche morfologiche e funzionali molto simili alle cellule normali

dello stesso tessuto.

Modalità di sviluppo: l’accrescimento è lento ed espansivo e proprio per la loro graduale crescita

o espansiva , quando un tumore benigno insorge in un tessuto parenchimatoso può provocare

compressione delle cellule parenchimali normali limitrofe, inducendone una ipertrofia o atrofia.

Contemporaneamente a ciò il connettivo stromale, più resistente, si addensa formando una

capsula definita appunto “capsula peritumorale” .

Atipie cellulari e citoarchitettoniche: le cellule che costituiscono il tumore benigno non presentano

o né atipie cellulari o citoarchitettoniche né funzionali.

Mitosi: tali cellule non subiscono un incremento di divisioni mitotiche.

o Vasi tumorali: le cellule tumorali benigne producono fattori di crescita per il connettivo e per

o l’endotelio vascolare, formando dunque un proprio stroma ed un proprio letto vascolare, che

garantiscono a tali cellule sostegno meccanico e nutrizionale. Le cellule tumorali comunque

essendo benigne ne rispettano i limiti anatomici e non entrano in circolo per diapedesi.

Metastasi: essendo i tumori benigni in situ, non sono presenti metastasi.

o Recidive: raramente si manifestano recidive dopo l’asportazione del tumore benigno.

o Cachessia: assente.

o

-Tumori maligni:

Grado di differenziazione: sono costituiti da cellule aventi un grado di differenziazione più o meno

o imperfetta e che si presentano differenti alle cellule normali facenti parte dello stesso tessuto, da

un punto di vista morfologico, funzionale e comportamentale. Talvolta le cellule tumorali maligne

sono definite anaplastiche o fortemente indifferenziate, se il grado di differenziamento delle cellule

che lo costituiscono è talmente basso da non consentire, sotto l’aspetto morfologico, di identificare

il citotipo da cui ha preso origine.

Modalità di sviluppo: l’accrescimento delle cellule è rapido e di tipo infiltrativo. Con quest’ultimo

o termine si fa riferimento alla capacità delle cellule tumorali di oltrepassare le barriere anatomiche

ed invadere spazi occupati da cellule dei tessuti sani limitrofi. Un esempio è il tumore maligno che

può generarsi a livello dell’epitelio di rivestimento della cute, le cui cellule possono incominciare a

proliferare ed espandersi sino a superare le barriere della membrana basale sottostante, andando

ad invadere il derma e persino tessuti più profondi.

Atipie cellulari e citoarchitettoniche: le atipie morfologiche cellulari sono frequenti e interessano

o forma e dimensioni dell’intera cellula e degli organuli in essi contenuti. Nessuna alterazione

citologica presente nelle cellule tumorali è specifica per la condizione di malignità, ma l’accumularsi

di tali anomalie, se riscontrate nell’esame istodiagnostico o citodiagnostico, permette al patologo di

formulare la diagnosi di tumore maligno. Alle atipie morfologiche si affiancano notevoli atipie

funzionali.

Mitosi: la divisione mitotica risulta essere notevolmente aumentata.

o Metastasi: le cellule neoplastiche maligne possono anche superare le barriere anatomiche

o costituite dall’endotelio vasale, con conseguente raggiungimento del circolo sanguigno e linfatico.

Tale invasività a livello circolatorio può provocare l’invasione da parte delle cellule neoplastiche di

siti lontani da quello in cui è insorto il tumore primario. Se, una volta arrestatesi in tali siti ectopici,

le cellule dovessero riprendere la propria attività proliferativa, si verrebbero a formare metastasi.

Recidive: poiché, in seguito alla asportazione chirurgica del tumore primitivo, non è sempre

o possibile effettuare la rimozione di tutte le cellule che costituiscono il tumore primario in quanto il

tumore maligno ha una elevata capacità infiltrativa, tali cellule superstiti non di rado possono dare

origine a recidive, ovvero alla formazione di un nuovo tumore.

Vasi sanguigni: spesso non rispettati (vedi metastasi).

o Cachessia: ovvero un progressivo e rapido decadimento dell’organismo, che va incontro ad un

o massiccio calo ponderale e manifestazioni di astenia ed apatia, che spesso si riscontra nei pazienti

affetti da tumore maligno. Non è direttamente correlabile con le dimensioni del tumore e con il

momento di insorgenza in quanto tali fenomeni possono manifestarsi all’inizio della malattia o nella

fase terminale.

In generale è possibile distinguere sotto alcuni aspetti, cellule normali e cellule tumorali, poiché infatti le

cellule tumorali:

-Presentano un elevato numero di cellule proliferanti.

-Hanno nuclei larghi e dalla forma variabile.

-Variano nella forma e nelle dimensioni.

-Perdono la loro forma differenziata.

-Si arrangiano tra di loro in maniera disordinata.

-Generalmente non presentano dei confini definiti nella loro organizzazione, in quanto presentano un

elevata capacità invasiva.

Figura 6: Confronto tra tessuto ghiandolare normale e polipo adenomatoso (a Dx-> tumore benigno).

Figura 7: Carcinoma a livello del colon. Si noti il "disordine cellulare" che emerge dal preparato istologico.

Classificazione dei tumori:

In base alla stadiazione:

La classificazione del tumore al momento della diagnosi risulta essere molto importante allo scopo di

determinare la prognosi e l’approccio terapeutico al paziente. Può avvenire attraverso due sistemi, che

utilizzano parametri differenti: il sistema Grading e TNM.

Sistema Grading: permette la classificazione del tumore maligno, in base alle caratteristiche citologiche e

istologiche della neoplasia, in livelli o gradi. I livelli sono indicati con la numerazione romana e vanno da I

(tumori ben differenziati) a IV (tumori molto indifferenziati). Se nel contesto della neoplasia vi sono zone

con diverse differenziazioni, la gradazione del tumore è espressa in base all’area con gradazione più

elevata.

Quindi:

G1: tumori costituiti da cellule molto differenziate

G2: tumori costituiti da cellule con differenziazione di medio grado

G3: tumori costituiti da cellule con differenziazione di basso grado

G4: tumori costituiti da cellule indifferenziate

GX: tumori costituiti da cellule il cui grado di differenziamento non è definibile

Tale sistema di classificazione avviene in base a:

-Grado di differenziazione

-Frequenza di mitosi: permette di avere un parametro di valutazione della potenzialità invasiva della

neoplasia

-Pleomorfismo cellulare: caratteristica delle cellule ad elevata gradazione e riguarda le variazioni di forma e

di dimensioni delle cellule e dei nuclei, oltre che di colorabilità di entrambe.

Sistema TNM: sistema utilizzato a livello internazionale al fine di descrivere l’estensione locale del tumore

e la sua diffusione a distanza. Prende in considerazione tre parametri:

-T (=Tumore): estensione del tumore primitivo nella sede anatomica in cui è insorto

-N (=linfoNodo): invasione o meno da parte delle cellule tumorali dei linfonodi regionali e juxtaregionali

-M (=Metastasi): assenza o presenza di metastasi a distanza

L’aggiunta di numeri alle lettere permettono una classificazione ancora più precisa:

Lettera T: A seconda della zona di insorgenza del tumore, tale numerazione può assumere differenti

significati:

Adenocarcinoma gastrico:

T1=invade lamina propria o sottomucosa

T2=invade muscolaris propria o sottosierosa

T3=penetra nella sierosa

T4=invade strutture adiacenti (milza, diframma,

pancreas, parete addominale)

Carcinoma cutaneo:

T1=diametro maggiore 2 cm o meno

T2=diametro maggiore tra 2 e 5 cm

T3=diametro maggiore più di 5 cm

T4=invade muscolo, cartilagine, osso

Vi sono tuttavia altre sigle: T0: se, in presenza di metastasi, non si è giunti alla identificazione del tumore

primario; TX: nel caso in cui, in presenza di metastasi, manchino i requisiti minimi per giungere alla

definizione di tumore primario; T : per indicare il carcinoma in situ.

is

Lettera N: N0: indica l’assenza di interessamento linfonodale

N1, N2, N3: indicano il coinvolgimento progressivo dei linfonodi regionali

N4: indica l’interessamento dei linfonodi juxtaregionali

NX: indica la mancanza di requisiti minimi per definire lo stato dei linfonodi regionali

Lettera M: M0: indica l’assenza di metastasi

M1: presenza di segni di metastasi: a sua volta la sede di localizzazione è specificata con le prime

tre lettere del nome in lingua inglese dell’organo sede della metastasi: PUL (polmoni);

OSS (scheletro); BRA (encefalo); HEP (fegato); LYN (linfonodi); SKY (cute).

MX: presenza di metastasi non accertabili

Nomenclatura:

I tumori benigni sono divisibili in base alla localizzazione della loro insorgenza in:

-Polipi e papillomi: sorgono a livello degli epiteli di rivestimento (cute e mucose)

-Adenomi: sorgono a livello dei tessuti ghiandolari (fegato, mammella, tiroide, ghiandole sudoripare…)

In genere nella nomenclatura, per definire i tumori benigni si utilizza il suffisso –oma al tipo cellulare, per

esempio se il citotipo coinvolto è il fibroblasto si parla di fibroma, se è il condrocita si definise condroma, se

l’osteocita osteoma….

Anche nella nomenclatura dei tumori maligni tuttavia si utilizza il suffisso –oma:

-Tumore maligno degli epiteli di rivestimento: Carcinoma

-Tumore maligno degli epiteli ghiandolari: Adenocarcinoma

-Tumore maligno del tessuto connettivo: Sarcoma-> il termine sarcoma si aggiunge al citotipo coinvolto:

fibrosarcoma, osteosarcoma, miosarcoma…

NB: I termini Mieloma (tumore del midollo osseo); linfoma (tumore dei linfociti); melanoma (tumore dei

melanociti): sebbene finiscano in –oma, sono comunque tumori maligni.

Cancerogenesi:

Per cancerogenesi si intendono i meccanismi molecolari con cui una cellula da normale diventa neoplastica.

In condizioni di normalità, infatti, fattori di crescita esterni si legano a specifici recettori posti sulla

membrana plasmatica che mediante una cascata di segnali intracellulari permette l’attivazione di specifici

enzimi in grado di attivare a livello nucleare fattori di trascrizione che stimolano la proliferazione, il

differenziamento e la morte cellulare.

I fattori che principalmente possono essere causa di cancro sono:

-Virus

-Sostanze chimiche: come ad esempio particelle immesse nell’aria durante l’attività industriale od il fumo di

sigaretta.

-Radiazioni

-Dieta e stili di vita

-Metabolismo cellulare

-Ereditarietà: talvolta la predisposizione ai tumori può essere trasmessa geneticamente, in quanto possono

trasmettersi geneticamente mutazioni a carico delle molecole di DNA coinvolte nella regolazione dei

processi di proliferazione, differenziamento e morte cellulare. A subire mutazioni responsabili

dell’insorgenza del cancro sono gli oncogeni, oncosopressori e micro-RNA. Tali alterazioni sono di solito

eventi somatici, sebbene vi siano casi di mutazioni genetiche a livello germinale in grado di predisporre un

individuo a tumori ereditari o famigliari. Generalmente la trasformazione neoplastica di una cellula è

dovuta all’accumulo di mutazioni geniche nella cellula stessa e raramente ad una unica mutazione. Per

questo motivo i tumori infantili sono più rari di quelli in individui adulti, la cui incidenza sta aumentando

notevolmente con l’aumentare dell’età media della popolazione.

Gli oncogeni:

I geni coinvolti nell’insorgenza dei tumori (potenzialmente TUTTI), in condizioni di normalità sono definiti

proto-oncogeni ovvero geni cellulari, altamente conservati durante l’evoluzione, che codificano per

proteine coinvolte nei processi fisiologici di proliferazione (fattori di crescita), sopravvivenza (recettori di

membrana) e differenziamento (proteine coinvolte nella trasduzione cellulare a fattori di trascrizione)

cellulare . Gli oncogeni sono invece delle varianti alterate di tali proto-oncogeni e possono essere definiti

come tutti quei geni che, in seguito ad eventi molecolari che ne determinano un guadagno di funzione,

favoriscono la trasformazione e progressione neoplastica.

Isolamento degli oncogeni:

Circa cento anni fa, Peyton Rous descrisse per la prima volta l'esistenza di un virus che sembrava causare

una forma di tumore dei polli trasmissibile, un'idea difficilmente accettabile in quel periodo, quando ancora

non si pensava che il tumore potesse essere causato da un agente infettivo. Furono tuttavia svolti degli

esperimenti che consentirono a Rous di verificare la sua ipotesi: i fibrosarcomi (tumori del tessuto

connettivo) venivano asportati dai polli, frantumati e centrifugati in modo da eliminare le cellule e le

componenti cellulari. Il campione ottenuto veniva filtrato attraverso una membrana con pori molto piccoli,

in modo da non far passare nemmeno microrganismi di dimensioni infime; il filtrato veniva così iniettato

nei polli causando l’insorgenza del sarcoma.

Qualsiasi dubbio in merito alla trasmissibilità del tumore dovuto ad un virus fu definitivamente risolto negli

anni '50, quando venne chiaramente dimostrato che il Rous Sarcoma Virus (RSV), un retrovirus così

chiamato in onore del suo scopritore, poteva causare la trasformazione tumorale delle cellule che infettava.

Negli anni '70 venne identificato nel suo genoma virale il gene responsabile della trasformazione (v-src),

successivamente clonato. Tuttavia, alla fine degli anni '70, la sequenza di v-src fu trovata in maniera molto

conservata anche all'interno del genoma del pollo e di altri vertebrati. Questa scoperta fece ipotizzare che il

gene v-src potesse derivare da un normale gene presente nel genoma di un qualsiasi vertebrato, che, a

causa di un evento di ricombinazione, era stato incorporato nel genoma del virus durante la sua

replicazione in cellule eucariotiche. In realtà, il gene v-src e il gene c-src (il suo omologo presente nel

genoma dei vertebrati) non sono perfettamente identici, ma esistono mutazioni puntiformi a livello di tutta

la sequenza codificante, oltre ad una delezione nella regione C-terminale. Tale delezione comprende un

dominio che inibisce la funzione della proteina per cui l'assenza di questa regione regolatrice comporta più

alti livelli di attività della proteina conferendole capacità trasformante. Diversamente da v-src, c-src ha

infatti un minore potere trasformante in accordo con il suo ruolo di proto-oncogene che, se attivato, può

diventare un oncogene. Si ritiene che il gene cellulare inizialmente integrato da RSV abbia subito mutazioni

che lo hanno trasformato in oncogene.

In conclusione, la scoperta dell'esistenza di una relazione tra il proto-oncogene cellulare e l'oncogene virale

ha rappresentato un punto fondamentale nella storia della ricerca sul cancro, dimostrando che il cancro

può essere indotto dalla mutazione di geni normali.

Ma come può avvenire l’integrazione di geni virali all’interno del genoma della cellula ospite? A tale quesito

si rispose nel 1965, quando fu scoperto l’enzima trascrittasi inversa nei retrovirus, ovvero virus ad RNA

appartenenti alla famiglia dei retroviridae. Quando infatti il retrovirus prende contatto con la membrana

plasmatica della cellula ospite, il retrovirus vi inocula il proprio materiale genetico e gli enzimi necessari per

la replicazione virale, tra cui l’enzima trascrittasi inversa in grado di catalizzare a livello citoplasmatico la

sintesi di una molecola di DNA a partire dal genoma del retrovirus, ovvero una molecola di RNA.

Il DNA così formatosi (detto anche pro-virus) penetra in seguito nel nucleo e, grazie alla presenza

dell’enzima integrasi in grado di riconoscere delle sequenze del DNA virale definite LTR (long terminal

redundancy-repeats), viene integrato nel genoma della cellula ospite, permettendo in seguito la

trascrizione e traduzione di proteine virali. Dalla seguente trascrizione ne deriverà dunque una molecola di

RNA avente non solo sequenze del genoma virale, ma anche quelle cellulari della cellula infettata. Alcuni

ceppi virali della sottofamiglia oncovirinae, integrano nel genoma umano oncogeni in grado di provocare

nell’organismo l’insorgenza di cancro. Per questo motivo vengono definiti oncovirus o retrovirus oncogeni.

Azione degli oncovirus: L’azione degli oncogeni è studiabile a partire da:

-retrovirus acuti: virus ad RNA in grado di trasformare le cellule in coltura, di indurre in animali in cui

vengono iniettati diverse neoplasie dopo un breve periodo di latenza (1-2 setttimane) e che tipicamente

presentano un difetto nella replicazione in quanto mancano dei geni pol e env (per questo motivo per la

replicazione necessitano dell’aiuto di virus detti “helper”).

-retrovirus cronici: virus ad RNA non in grado di trasformare le cellule in coltura, in grado di indurre, se

inoculati, neoplasie di tipo cronico dopo un periodo di latenza di circa 3-18 mesi e che sono autonomi nella

replicazione.

I retrovirus acuti derivano infatti da retrovirus trasformanti cronici in seguito a inoculazioni seriali in animali

da esperimento: il retrovirus trasformante cronico viene iniettato in una cavia che successivamente viene

sacrificata. Dai loro organi viene dunque prelevato il retrovirus cronico, in un secondo momento ri-

inoculato in un’altra cavia. La ripetizione seriale di tale procedimento consentì l’isolamento finale di

retrovirus dotati di capacità trasformanti maggiori rispetto a quello di partenza: il retrovirus da cronico

incomincia ad assumere le caratteristiche acute. L’analisi comparativa del genoma di retrovirus cronici ed

acuti portò alla dimostrazione che i secondi derivano dai primi in seguito ad un processo di ricombinazione

col genoma dell’ospite. Questo processo portava infatti all’acquisizione da parte del genoma virale di un

proto-oncogene di origine cellulare (processo definito “trasduzione”), responsabile dell’attività oncogena

del virus, a discapito di uno o più geni necessari per la replicazione virale (geni gag, pol, env). Ciascun

oncogene virale, definito in generale come v-onc, venne designato con un acronimo di tre lettere, in base al

virus in cui era contenuto o al tipo di tumore di cui provocava l’insorgenza (per esempio il v-onc del virus

del Sarcoma di Rous venne definito src (o v-src).Il corrispondente proto- oncogene cellulare viene definito

con c-onc.

Il retrovirus cronico inizialmente inoculato non presenta ancora geni v-onc, ma sono comunque in grado di

indurre neoplasia in animali da esperimento (sebbene i lunghi tempi di latenza). Questo perché, in seguito

all’inoculazione e alla trasformazione dell’RNA virale in pro-virus, il DNA virale si integra a livello nucleare

nel genoma della cellula ospite, in siti di integrazione preferenziali che si trovano in prossimità di geni c-

onc.

I siti di integrazione specifici vengono selezionati dal legame con la sequenza ripetuta virale (LTR), che è in

grado di indurre elevati livelli di espressione dei geni cellulari in prossimità dei quali si trovano. Quando tale

stimolazione riguarda geni cellulari coinvolti nella proliferazione, provoca un incremento della sintesi di

proteine (come i fattori di crescita), coinvolti in tale processo. In generale la stimolazione dell’espressione

genica nella cellula ospite è coinvolta nella cancerogenesi nel caso in cui tali geni siano coinvolti nella

regolazione della proliferazione, differenziamento e morte cellulare.

Nel seguente processo di replicazione retrovirale vi saranno virus contenenti all’interno del proprio capside,

un genoma avente l’oncogene v-onc.

NB: il proto-oncogene (gene in condizioni normali) c-onc inserito nel genoma virale diviene un v-onc e

spesso va a sostituire un gene pol, responsabile della replicazione dei retrovirus.

NB: Degli oncogeni fu poi scoperta l’attività tirosin chinasica, quando attivati.

Gli oncosoppressori:

Il cancro è provocato dall’accumulo di mutazioni a carico di specifici geni: gli oncogeni e gli

oncosoppressori. Nel primo caso le mutazioni provocano un guadagno di funzione (gain-of-function),

mentre nel secondo si parla di mutazioni inattivanti (loss-of-function).

Retinoblastoma:

Negli anni 70 fu poi scoperto un altro gene, il retinoblastoma, la cui mutazione risulta essere responsabile

della trasformazione neoplastica delle cellule pigmentate della retina nei bambini. Tale tumore maligno può

presentarsi in forma sporadica oppure familiare e nel secondo caso l’insorgenza può avvenire anche al di

sotto dei 6 anni di età. La scoperta avvenne grazie agli studi di Alfred Knudson, che notò la presenza di 1

singolo evento genetico (1 hint= 1 mutazione) nell’insorgenza della forma familiare del retinoblastoma e di

due eventi genetici (2 hint= 2 mutazioni) nell’insorgenza della forma sporadica, in una medesima cellula.

Egli ipotizzò allora che il retinoblastoma fosse causato da 2 “hint” a carico dello stesso gene, definito

appunto RB: nella forma familiare la mutazione era unica in quanto una prima mutazione era già presente

in tutte le cellule, in quanto precedentemente avvenuta a livello germinale. La seconda mutazione avveniva

invece in quelle cellule retiniche che andavano incontro a trasformazione tumorale; nella forma sporadica

invece entrambe le mutazioni avvenivano in una stessa cellula, a livello somatico. Si arrivò dunque alla

conclusione che la mutazione RB fosse recessiva e che, per provocare la manifestazione del tumore,

dovesse manifestarsi su entrambi gli alleli del gene RB

La scoperta di questo gene fu molto importante in quanto fu il primo oncosoppressore identificato: in

alcuni casi di retinoblastoma infatti la regione cromosomica (13q14) che lo conteneva, risultava essere

deleta. La sua delezione, ovvero una loss-of- function, confermava l’ipotesi che il RB fosse un

oncosoppressore. Poiché con l’introduzione di un gene Rb normale (ne basta uno solo in quanto tale

malattia è recessiva) si scoprì che la cellula ritornava allo stato di normalità, inizialmente si pensava che Rb

fosse responsabile del blocco della cancerogenesi cellulare. Solo in un secondo momento si scoprì che

l’oncogene fosse coinvolto nella regolazione dell’entrata della cellula nel ciclo cellulare (per questo

l’alterazione dunque di tale proteina è responsabile di una divisione cellulare incontrollata).

Tale gene codifica infatti per una proteina, la p110RB, in grado di arrestare il ciclo cellulare controllando il

punto R (punto di restrizione) alla fine della fase G1 del ciclo cellulare.

Azione del Retinoblastoma:

La proteina p110RB codificata da RB è una proteina nucleare che col suo sito A/B pocket interagisce con

fattori trascrizionali e con enzimi in grado di rimodellare la cromatina, reprimendo così la trascrizione. I

fattori trascrizionali più noti che legano p110RB sono quelli della famiglia E2F, in particolare E2F1 che,

insieme ai fattori DP1, stimolano la trascrizione di geni codificanti per proteine coinvolte nella progressione

del ciclo cellulare (tra cui la ciclina E). RB, al contrario, ne blocca la funzione non permettendo così il

superamento del punto di restrizione.

Quando tuttavia la proteina RB viene fosforilata, si stacca da E2F e ne libera la capacità di promuovere il

ciclo cellulare. Questo processo di fosforilazione si innesca quando specifici fattori di crescita stimolano a

livello nucleare la trascrizione della ciclina D, in quanto sono proprio i complessi D-CDK4 o D-CDK6 (ovvero

le due chinasi ciclino dipendenti legati alla corrispondente ciclina) a forsforilare la proteina p110RB. Quando

tale fosforilazione è ancora ridotta ma comunque sufficiente a liberare una certa quantità di E2F, viene

stimolata da tale fattore la trascrizione della ciclina E. La ciclina E si lega poi alle protein chinasi CDK2 e così

il complesso E-CDK2 innesca una fosforilazione più intensa di p110RB. La proteina del RB così

iperfosforilata libera definitivamente E2F ed innesca l’entrata della cellula dalla fase G1 alla fase S, con

conseguente innesco della proliferazione cellulare.

Bloccando il ciclo cellulare, p119RB è anche coinvolta nell’arresto irreversibile della proliferazione cellulare,

ovvero della senescenza, meccanismo molto importante nell’azione di soppressione tumorale esercitata da

RB. Il meccanismo si innesca soprattutto in caso di invecchiamento cellulare, di danno al DNA o

sollecitazioni proliferative inappropriate.

NB la proteina p119RB è coinvolta anche nel differenziamento cellulare, regolando fattori di trascrizione

tessuto- specifici.

Regolazione del ciclo cellulare:

Proteina p53:

Fu scoperta nel 1979, come proteina in grado di formare complessi proteici con l’antigene Large T nelle

cellule trasformate dal virus SV40. Fu annoverata nella famiglia dei geni oncosoppressori solo in seguito al

rilevamento della sua presenza in molti tumori ed alla scoperta che mutazioni a carico del gene che

codificava per tale proteina fosse di tipo loss of function. Infatti, mutazioni inattivanti di p53 sono molto

frequenti in tumori umani sporadici ovarici, dell’esofago, del colon, del pancreas, del polmone, dell’utero,

della mammella e anche in alcuni casi di sarcomi. Tali mutazioni tuttavia non seguono il modello “hint” di

Knudson, in quanto la trasformazione tumorale si manifesta spesso in eterozigosi.

E’ una fosfoproteina nucleare che, una volta attivata da stress cellulari (come l’ipossia, il danno al DNA,

l’attivazione di oncogeni, la privazione di nutrienti…) , si lega a sequenze specifiche del DNA agendo da

fattore di trascrizione stimolando l’espressione di geni coinvolti in risposte biologiche coinvolte nella

sopravvivenza quali l’apoptosi, l’arresto del ciclo cellulare, il riparo del danno del DNA e la senescenza

cellulare. In condizioni normali, nelle cellule che non hanno subito danni l’emivita della proteina p53 è

molto breve (dai 6 ai 20 minuti) ed i suoi livelli intracellulari sono molto bassi.

E’ stato scoperto che nei sarcomi le mutazioni di p53 sono per lo più delezioni, inversioni o traslocazioni

mentre nei carcinomi sono più frequenti le mutazioni puntiformi di tipo missense ( sostituzione di una base

azotata in modo tale che l’intera tripletta aminoacidica venga modificata). In particolare, tali mutazioni

missense colpiscono spesso il dominio centrale della proteina p53, ovvero il dominio DBD adibito al legame

col DNA, impedendo di conseguenza la funzione trascrizionale di p53.

Regolazione di P53: Il processo di regolazione che controlla l’emivita della proteina p53, è un meccanismo a

feedback negativo e coinvolge le proteine della famiglia MDM, in particolare MDM2 e MDMX/MDM4.

In assenza di stress cellulari, p53 è soggetta ad ubiquitinazione e quindi degradata proteoliticamente da

proteasomi e la proteina MDM2 si lega ai suoi domini proteici di transattivazione della trascrizione genica

(TAD), mascherandoli e riducendo l’attività trascrizionale di p53: quindi all’aumentare dei livelli di p53,

aumentano quelli di MDM2. Per questo motivo, per esempio, nell’ambito del carcinoma della cervice

uterina è possibile osservare che nelle cellule HPV negative la percentuale di geni p53 inattivati è del 100%.

Al contrario, essendo anche MDM2 un bersaglio trascrizionale di p53, in presenza di stress cellulari che

danneggiano il DNA, si assiste ad una diminuzione dei livelli di MDM2 ed un conseguente accumulo di

proteine p53 a livello nucleare. In risposta al danno al DNA infatti aumenta l’attività di alcune protein

chinasi che fosforilano direttamente o indirettamente il dominio TAD di p53, bloccandone il legame con

MDM2. Le proteine p53 non vengono quindi degradate ed entrano nel nucleo dove agiscono da fattori di

trascrizione per geni coinvolti nei processi biologici sopra detti, volti a riparare il danno o all’apoptosi.

Mutazioni di p53 nei tumori: all’interno dei tumori il gene p53 può subire delezioni, inversioni, traslocazioni

o mutazioni missenso provocandone l’alterazione di alcuni specifici domini. In altri tumori, p53 può non

subire mutazioni ma risulta comunque essere inattivata da meccanismi indiretti: l’amplificazione della

proteina MDM2 o difetti nella sua proteina inibitrice (p14ARF) determina l’accelerazione della

degradazione di p53; le chinasi che normalmente fosforilano p53 permettendone l’attivazione, in alcuni

tumori vengono inattivate, provocando la conseguente inattivazione di p53; alcune oncoproteine virali,

come E1B dell’adenovirus o E6 del Papillomavirus legano ed inattivano p53. E6 di HPV, inoltre, favorisce il

riconoscimento di p53 da parte dell’enzima ubiquitino-ligasi E6AP, che provoca a sua volta la degradazione

di p53.

In generale esistono due categorie di geni oncosopressori:

Gate-keeper: ovvero geni oncosoppressori che hanno la capacità di contrastare in maniera diretta

o l’acquisizione del fenotipo neoplastico, svolgendo una azione opposta rispetto a quella degli

oncogeni. E’ infatti possibile elencare le caratteristiche fondamentali del fenotipo tumorale,

designate col termine “hallmark”: proliferazione autonoma, insensibilità agli stimoli-

antiproliferativi, resistenza all’apoptosi, resistenza alla senescenza, invasività e metastasi,

angiogenesi. I due geni oncosoppressori gate-keeper sono il RB e p53.

Care-taker: sono geni che contribuiscono a mantenere l’integrità dell’informazione genetica,

o riparando i danni subiti dal DNA ad opera di stress cellulari. Sopprimono dunque la cancerogenesi

in maniera indiretta, riducendo il rischio che la cellula sviluppi mutazioni a carico di oncogeni ed

oncosoppressori. La perdita di funzione dei geni care-taker non causa di per se una crescita

incontrollata della cellula ma, facilitando l’accumulo di mutazioni a carico dei geni gate-keeper,

accelera il processo di tumorogenesi.

E’ dunque la mutazione a carico di questi due geni a predisporre alla insorgenza di cancro:

Di solito tuttavia non si parla di singole mutazioni, ma di mutazioni accumulate nel tempo (in genere sulle

15 mutazioni dei geni SENSIBILI, ovvero coinvolti nella trasformazione cellulare.).

Quindi i geni coinvolti nella cancerogenesi sono: proto-oncogeni, oncosopressori, geni riparatori del DNA.

E’ inoltre possibile individuare alcune proteine, coinvolte nei processi di proliferazione, differenziazione e

morte cellulare, la cui mutazione è la principale responsabile della trasformazione neoplastica delle cellule:

-Fattori di crescita

-Recettori di membrana e nucleari

-Proteine citoplasmatiche di trasduzione del segnale

-Proteine nucleari trascrizionali

- Proteine di controllo dell’apoptosi

-Proteine del ciclo cellulare cellulare

-Proteine di riparazione del DNA

Gli oncogeni ed i geni oncosoppressori sono normalmente funzionanti nella cellula, ma come mai i proto

possono indurre l’insorgenza dei tumori in alcuni soggetti? Attraverso particolari modificazioni geniche:

-Traslocazioni cromosomiche: esempio nelle leucemie e linfomi, che induce un aumento dell’attività tirosin

chinasica e della proliferazione cellulare, in seguito alla sintesi conseguente di proteine aberranti.

-Amplificazioni geniche: esempio del gene myc, che può provocare neuroblastomi e di Erb2, con

conseguente insorgenza del tumore mammario.

-Delezione: esempio la delezione di Rb-1 può provocare retinoblastoma e cancro alla vescica.

-Inversioni: responsabile spesso dell’insorgenza di leucemie.

-Mutazioni puntiformi: comprendono errori di appaiamento o ripetizioni.

La mancata riparazione di tali modificazioni geniche a carico di geni codificanti per le sette proteine dette

sopra, può indurre con elevata probabilità all’insorgenza di tumori.

Cancerogenesi virale:

L’azione dei virus oncogeni è diversa a seconda delle loro caratteristiche biologiche e strutturali, sebbene vi

siano alcuni principali punti in comune:

La trasformazione cellulare è un processo “a colpo unico” nel senso che basta anche solo

o l’interazione di una singola particella virale con una cellula bersaglio suscettibile per indurre la

trasformazione.

La trasformazione cellulare è associata alla presenza nella cellula di tutto o di parte del genoma

o virale integrato nel DNA cellulare (il processo di trasformazione è dunque una alterazione genetica

irreversibile). Vi sono tuttavia alcuni virus che inoculano nella cellula ospite un DNA che circolarizza

e permane nella cellula sotto forma di episoma, non integrandosi dunque nel DNA cellulare.

La trasformazione cellulare è accompagnata dalla continua espressione di un numero limitato di

o uno o più geni virali ed è sufficiente per mantenere la cellula nello stato alterato.

Gli studi all’interno di colture cellulari hanno permesso di comprendere la capacità dei virus oncogeni di

rendere le cellule infettate “trasformate” o “immortalizzate”. Nel primo caso le cellule trasformate sono

caratterizzate dalla mancata capacità di regolare la propria crescita, proliferando, in coltura, anche in

condizioni normalmente limitanti per la mitosi quali l’elevata densità cellulare, l’assenza di fattori di crescita

e la mancata presenza di un terreno solido sul quale crescere. In coltura tali cellule hanno le stesse

caratteristiche delle cellule tumorali ottenute da tumori spontanei o indotti da cancerogeni.

Le cellule immortalizzate invece sono definite tali in quanto sono in grado, in coltura, di crescere

indefinitamente. Sebbene condividano alcuni aspetti morfologici delle cellule tumorali, si differenziano

tuttavia da quest’ultime in quanto non sono in grado di provocare tumori se inoculate in topi nudi

,presentano una discreta necessità di fattori di crescita in coltura per proliferare e mantengono la

dipendenza da substrato e l'inibizione della proliferazione in seguito a contatto con altre cellule tipica di

cellule primarie. Tali caratteristiche infatti vengono perse totalmente o in larga parte da cellule tumorali

che possono iperproliferare causando crescita incontrollata della massa tumorale.

Nell’uomo i virus possono contribuire allo sviluppo di tumori umani mediante svariati meccanismi che

possono variare dalla stimolazione genetica della proliferazione della cellula ospite all’immunosopressione

indotta dal virus, che provoca l’insorgenza di tumori non direttamente connessi col virus in quanto è

l’immunodeficienza stessa che fa aumentare il rischio di insorgenza di tumori come nel caso dei linfomi di

tipo B ed il sarcoma di Kaposi.

Virus oncogeni a DNA ed RNA:

In generale è possibile distinguere i virus oncogeni in virus a DNA e a RNA, a seconda dell’acido nucleico che

costituisce il loro patrimonio genetico.

I virus a DNA appartengono a quattro differenti famiglie:

-Papova virus: comprendono i virus del papilloma, il virus polioma ed il virus SV40 (nelle scimmie).

-Adeno virus (poco cancerogeno nell’uomo)

-Herpesvirus

-Poxvirus (di dimensioni maggiori)

-Hepandavirus, ovvero il virus che provoca l’epatite B (Dimensionalmente più ridotti)

I virus a RNA comprendono invece diversi tipi di retrovirus.

Mentre l’infezione da virus ad RNA non offre alla cellula la possibilità di scelta tra la permissività e la non

permissività in quanto la replicazione virale e trasformazione cellulare avvengono quasi

contemporaneamente, i virus oncogeni a DNA si comportano diversamente a seconda della permissività o

meno della cellula ospite. Nelle cellule permissive, ovvero che permettono la replicazione di nuove

particelle virali dopo l’integrazione del genoma virale con quello cellulare, i virus oncogeni danno luogo ad

una infezione che provoca in un secondo momento lisi cellulare con conseguente mancata trasformazione

neoplastica cellulare; nelle cellule non permissive invece non si ha la produzione di virioni in seguito

all’infezione ma la cellula subisce una trasformazione.

Interazione dei virus oncogeni a DNA con la cellula ospite:

Per comprendere l’azione dei virus oncogeni è necessario fare riferimento al loro ciclo vitale. Dal momento

in cui il virus oncogene viene a contatto con una cellula permissiva, si innesca un ciclo vitale definito “ciclo

litico”. Il virus a DNA infatti, in seguito all’interazione mediante proteine di riconoscimento con la cellula

ospite, perde il proprio capside e il DNA virale entra nel nucleo integrandosi o meno col DNA della cellula

ospite. Sia che il DNA virale venga integrato col DNA della cellula ospite sia che rimanga in cellula come

episoma, il genoma virale viene replicato e tradotto in proteine virali strutturali e non. In seguito

all’assemblaggio proteico si creano nuovi organismi virali che vengono liberati dalla cellula ospite in seguito

alla sua lisi. E’ grazie a questa lisi cellulare che non vi è più il rischio di insorgenza del tumore (è il caso

dell’adenovirus del raffreddore, che provoca la lisi delle cellule della mucosa nasale, scongiurando

l’insorgenza del tumore). Tale ciclo può avvenire a livello di cellule permissive in quanto affinché si verifichi

è necessario che il virus sia in grado di sfruttare il macchinario biosintetico della cellula ospite al fine della

propria replicazione.

Se la cellula ospite non è permissiva il virus perde comunque il capside, inietta il proprio DNA ma poichè la

cellula ospite non permette l’utilizzo del loro macchinario biosintetico, la replicazione non avviene e non si

possono produrre ulteriori virus. Poiché non avviene la lisi ma il materiale virale permane nella cellula, la

cellula passa da normale a trasformata in quanto subisce un stabile cambiamento genetico. Una volta che il

DNA virale è integrato nella cellula ospite infatti, anche solo una minima informazione genetica è sufficiente

a provocare modificazioni nel comportamento di crescita della cellula, mediante due meccanismi: o il virus

introduce nella cellula un nuovo gene trasformante o il virus induce o altera direttamente l’espressione di

un gene cellulare preesistente. In entrambi i casi la cellula perde il controllo della normale regolazione dei

processi di crescita.

Virus oncogeni a DNA e meccanismo d’azione dei loro oncogèni:

In cellule ospiti permissive i primi geni virali ad essere trascritti sono i geni precoci (definiti con la lettera E,

che sta appunto per “early”) ovvero geni che codificano per proteine che promuovono la replicazione

cellulare. Solo in seguito a quelli precoci vengono trascritti i geni tardivi (definiti con la lettera L, che sta per

“late”), codificanti per proteine strutturali.

In cellule ospiti non permissive, invece, avviene la trascrizione dei geni precoci ma non di quelli tardivi, con

la conseguente impossibilità di assemblare proteine strutturali virali. Per questo motivo in cellule non

permissive non può avere luogo il ciclo litico.

Con le moderne tecniche è stato possibile riprodurre le sequenze delle proteine virali precoci e tardive e

studiare gli effetti delle prime in colture stabili e primarie. Nella famiglia dei “Popovaviridae” i geni precoci

e tardivi codificano per differenti proteine a seconda del virus:

Virus SV40: i geni precoci codificano per l’antigene T grande (large T antigen= LT) e antigene T

o piccolo (small T antigen= ST); i geni tardivi codificano per le proteine strutturali VP1, VP2, VP3. Le

proteine precoci LT provocano, sia in colture stabili che in quelle primarie, la trasformazione

cellulare delle cellulein coltura.

Polioma virus: i geni precoci codificano per l’antigene T grande, l’antigene ti medio (middle T

o antigen= MT) e antigene T piccolo; i geni tardivi codificano per le proteine strutturali VP1, VP2, VP3.

In colture stabili e primarie la proteina precoce MT provoca la trasformazione delle cellule in

coltura, mentre la proteina precoce LT ne provoca l’immortalizzazione.

HPV-1 (papilloma virus): i geni precoci codificano per le proteine E5, E6, E7; i geni tardivi codificano

o per le proteine strutturali L1 ed L2. La proteina precoce E6 provoca in colture primarie

l’immortalizzazione delle cellule in coltura, E7 provoca invece la trasformazione di cellule sia in

colture stabili che, se associata alla proteina ras, in colture primarie.

Adenovirus: i geni precoci codificano per le proteine E1A e E1B. Le proteine precoci E1A provocano

o la trasformazione cellulare in colture stabili e l’immortalizzazione cellulare in colture primarie,

mentre il ruolo di E1B non è conosciuto.

NB Col termine “coltura primaria” si fa riferimento a cellule prelevate direttamente a partire da tessuti od

organi, in modo tale che le cellule così isolate riflettano meglio le attività biochimiche delle cellule in vivo.

La loro caratteristica è che col tempo tali cellule invecchiano e sono destinate a morire. Può tuttavia

capitare che una di tali cellule possa andare incontro ad immortalizzazione, fenomeno per cui non avviene

più il processo di invecchiamento: sono tali cellule a dare vita alle colture stabili.

In definiva grazie allo studio su colture cellulari si scoprì che le proteine codificate da geni precoci fossero

responsabili della trasformazione od immortalizzazione delle cellule ospiti.

Tali trasformazioni o immortalizzazioni avvenivano tuttavia grazie alla interazione delle proteine precoci

con proteine specifiche e fu proprio tale scoperta che permise di giungere alla conclusione che nelle cellule

sia l’interazione tra le proteine precoci dei virus a DNA e le proteine cellulari a provocare la trasformazione

delle cellule ospiti.

Andando a studiare l’azione di oncovirus a DNA all’interno delle cellule ospiti, è possibile analizzare più

precisamente il ruolo delle proteine codificate dai geni precoci e coinvolte nel processo di trasformazione.

In generale tali geni codificano per proteine localizzate in differenti compartimenti cellulari e che

presentano funzioni coinvolte direttamente od indirettamente nella trascrizione e/o replicazione del DNA

cellulare o in alcuni aspetti della trasduzione del segnale. Ad esempio l’antigene T medio del polioma virus

del topo ed il prodotto del gene E5 nel papilloma virus si localizzano a livello della membrana plasmatica

cellulare e sono coinvolti in alcuni aspetti della trasduzione del segnale (la proteina T media regola reazioni

di fosforilazione della membrana plasmatica interagendo con specifici componenti cellulari). O ancora, gli

antigeni T piccoli del polioma virus e forse anche le proteine precoci codificate dal gene E7 nel papilloma

virus possono agire sia a livello citoplasmatico che a livello nucleare, partecipando almeno in parte

all’insorgenza del fenotipo neoplastico: in tutti questi casi gli oncogèni dei virus a DNA sono coinvolti sia nel

processi di replicazione virale che di trasformazione cellulare.

Come detto sopra, proteine virali e cellulari creano una interazione. Tale interazione è di natura funzionale

e consiste nella attivazione di un proto-oncogene e nella inattivazione di un anti-oncogene.

Un caso molto studiato di attivazione di un proto-oncogene è quello rappresentato dalla interazione tra

l’antigene T medio (MT) del polioma virus col prodotto dell’oncogène cellulare src. Tale interazione porta

alla stimolazione dell’attività intrinseca protein chinasica della proteina Src, attività che risulta essere critica

per l’induzione di tumori da parte del virus.

Talvolta l’interazione può venire tra le proteine trasformanti di un virus a DNA e quelle che svolgono

normalmente un ruolo regolatorio per la crescita cellulare, come le proteine p53 ed Rb: la formazione di un

complesso tra queste due strutture proteiche provoca l’inattivazione delle funzioni regolatrici delle

proteine cellulari.

Virus umani a DNA coinvolti nell’azione oncogena:

-Papillomavirus (HPV): responsabile della insorgenza di patologie infettive: verruche e condilomi.; e di

neoplasie: carcinomi ano-genitali, carcinoma vescicale, carcinoma orale. In generale i papillomavirus hanno

un elevato tropismo per cellule epiteliali cutanee e membrane mucose. Il ciclo replicativo che porta alla

formazione di proliferazioni epiteliali benigne (verruche e condilomi) che si sviluppano dopo l’infezione

virale, è strettamente dipendente dallo stadio differenziativo della cellula epiteliale. Analizzando ad

esempio l’infezione virale cutanea è possibile osservare che a livello dell’epitelio basale le cellule

presentano alcune copie dei DNA virale; Il seguente processo di replicazione del genoma virale si manifesta

invece a livello del soprastante strato spinoso, dove ha luogo l’espressione dei geni precoci E1, E2, E4, E5,

E6, E7; gli eventi finali di replicazione virale, ovvero la sintesi delle proteine del capside e morfogenesi dei

virioni, si verificano invece nelle cellule differenziate dello strato granuloso e corneo.

Il papilloma virus è un virus a DNA, il cui genoma è costituito da un DNA circolare a doppia elica che

contiene multiple ORF (sequenza continua di nucleotidi, non interrotta da codoni di stop), 6 localizzati nella

regione precoce e definite E1, E2, E4, E5, E6, E7 e 2 localizzati in quella tardiva L1 e L2. L’espressione di

ciascuno di questi geni ha un ruolo fondamentale nei diversi processi vitali e trasformanti del virus: Il gene

E1 è fondamentale per gli eventi replicativi precoci; il gene E2 è un modulatore trascrizionale di promotori

virali; Il gene E4 è sempre coinvolto nel ruolo di maturazione virale, ma la sua funzione specifica non è del

tutto nota; i geni E6 ed E7 invece, come visto in coltura, presentano dei domini proteici “zinc finger” tipici

delle proteine che legano il DNA e sono responsabili delle attività trasformanti dell’HPV. I geni della regione

tardiva codificano invece per proteine strutturali del virione.

Modalità d’azione: L’infezione da HPV provoca delle proliferazioni epiteliali con diverse modalità di crescita

a seconda del sito di infezione e del tipo di HPV, in quanto tale virus può presentarsi con più di sessanta

genotipi diversi. Come visto precedentemente, il virus HPV infetta le cellule basali epiteliali sia di zone

precedentemente colpite da altre lesioni sia di zone dotate di epitelio di transizione, ovvero la cervice

uterina e l’ano. Dopo la replicazione è dunque possibile osservare una notevole quantità di DNA virale a

livello degli strati intermedi e superficiali dell’epitelio, ed una altrettanto abbondante quantità di proteine

strutturali virali nelle cellule epiteliali superficiali.

Tuttavia alcuni tipi di infezione anogenitale, per esempio quelli dovuti al virus HPV 16 e HPV 18, presentano

un elevato rischio di conversione maligna, al contrario di altri virus come HPV6 e HPV11, considerati a basso

rischio. I tipi di virus HPV ad elevato rischio sono considerati coinvolti nella cancerogenesi ano-genitale per

alcuni motivi:

Il DNA virale si riscontra in più del 90% di tali tumori.

o La maggior parte dei tumori presenta il DNA virale integrato. Nelle displasie cervicali infatti,il DNA

o virale si trova sotto forma di episoma, al contrario di ciò che avviene nei carcinomi cervicali, dove la

specifica regione dell’episoma contentente l’ORF E2 (modulatore trascizionale di fattori di

promozione virali) viene distrutta ed il DNA virale viene integrato in quello dell’ospite.

Nella biopsia tutte le linee cellulari tumorali ottenute da soggetti infetti da tale virus e che

o manifestano il cancro della cervice, presentano trascritti che originano da due specifici ORF, ovvero

E6 ed E7. Ciò significa che, durante l’integrazione del genoma virale, mentre ORF E2 viene disttutto,

questi ultimi due ORF rimangono intatti. Sono infatti questi due geni a codificare per prodotti

responsabili della cancerogenesi e del mantenimento del fenotipo proliferante e neoplastico.

Sebbene tuttavia la presenza dei geni virali E6 ed E7 sia necessaria per la crescita tumorale, non

risulta tuttavia essere sufficiente.

Infatti: -Il cancro si sviluppa generalmente da lesioni precedenti, definite “neoplasie ad alto

grado cervicali intraepiteliali” (CIN), contenenti HPV ad elevato rischio.

-le linee cellulari immortalizzate in vitro da E6 ed E7 non sono immediatamente

tumorogeniche, ma la transfezione (introduzione di materiale biologico esterno in cellule

eucariotiche) del gene v-ras ne provoca la trasformazione maligna.

-La fusione di cellule neoplastiche infette da HPV con cellule umane normali, genera cellule

ibride non maligne, nonostante la presenza dei geni E6 ed E7.

Probabilmente la mancata trasformazione neoplastica di cellule normali in seguito all’inoculazione di cellule

immortalizzate e neoplastiche infette da HPV è giustificabile con la diminuita espressione dei geni E6 ed E7,

al contrario di ciò che avviene nelle cellule maligne, dove la trascrizione di tali geni è continua: nelle cellule

maligne dunque non vi è più una regolazione intracellulare dell’espressione di geni virali, regolazione che

sembra venire attivata dopo l’espianto delle cellule dall’animale. Alcuni studi hanno infatti suggerito che

due fattori di crescita, TFG beta (Trasforming growth factor) e EGF (Epidermal growth factor) sono in grado

di sopprimere l’espressione di HPV nelle cellule non maligne. Dal momento in cui una cellula si predispone

verso uno stato di malignità attraverso l’integrazione del genoma virale, si innesca una deregolazione

dell’espressione genica dell’HPV dovuta alla distruzione del gene E2, con la conseguente perdita del suo

ruolo regolatorio (ruoli transattivante e repressorio).

Ma come agiscono i polipeptidi codificati dall’ORF E7 e dall’ORF E6 nella cancerogenesi? A livello della

regolazione del ciclo cellulare.

-Cancerogenesi indotta dai polipeptidi codificati dall’ORF E7: rb

In condizioni normali infatti, nel nucleo delle cellule in fase G1, la anti-oncoproteina p110 ipofosforilata

crea complessi con fattori di trascrizione tra i quali il dimero E2F1/DP1, impedendo loro di promuovere la

trascrizione dei geni che danno inizio alla fase S del ciclo cellulare. Specifici stimoli mitotici inducono una

rb

iperfosforilazione della p110 , operata dal complesso Ciclina D- CDK4 o Ciclina D-CDK6, ed il suo

conseguente distacco dal complesso E2F1/DP1. Il ciclo cellulare può dunque progredire nella fase S. I

polipeptidi codificati da ORF E7 dei virus HPV ad alto rischio (HPV 16 e HPV18), interagiscono con la

rb

proteina p110 ipofosforilata, impedendole di creare complessi con E2F1/DP1 ed altri fattori di trascrizione.

Questo provoca un passaggio incontrollato delle cellule dalla fase G1 alla fase S.

-Cancerogenesi indotta dai polipeptidi codificati dall’ORF E6:

Come visto precedentemente, l’anti-oncoproteina p53 funziona da fattore trascrizionale in grado di legare

sequenze specifiche del DNA e di indurre l’espressione di geni coinvolti in varie risposte biologiche (come i

geni BACK ,BAX, NOXA e PUMA che promuovono l’apoptosi o i geni BCL2 e BCLxL che codificano per

polipeptidi che promuovono la sopravvivenza cellulare ) in presenza di lesioni del DNA cellulare. I

polipeptidi codificati dagli ORF E6 di HPV ad elevato rischio interagiscono con una proteina definita E6-AP,

formando un complesso che interagisce con l’anti-oncoproteina p53, provocandone la proteolisi. Le cellule

infettate dunque, anche in presenza di danni al DNA, sono in grado di sopravvivere e continuare il proprio

ciclo cellulare.

NB nell’immagine, insieme ai geni BAX, sono indicati anche i geni WAP-1/CIP-1. Sono geni con azione pro-

apoptotica, molto importanti in quanto codificano per uno dei principali inibitori delle chinasi clicline-

rb

dipendenti che favoriscono grazie anche alla iperfosforilazione della proteina p110 la transizione dalla fase

G1 alla fase S del ciclo cellulare. Tale proteina inibitrice è definita “p21”.

rb

Quindi l’interferenza delle proteine E6 ed E7 con le proteine p110 e p53, ne provoca una interferenza con

la loro regolazione del ciclo cellulare e ad una instabilità cromosomica ed aneuploidia, normalmente

osservate negli individui con infezioni da HPV ad alto rischio. Al contrario proteine E6 ed E7 isolati da

soggetti affetti da infezione con HPV a basso rischio legano poco efficacemente o per niente le proteine

della cellula ospite, non provocando modificazioni cromosomiche.

Possibile andamento dell’insorgenza del carcinoma mammario:

Esame citologico:

Vaccinazione: Per ridurre l’incidenza del carcinoma della cervice uterina è stato sperimentato un vaccino,

attualmente in uso. Rimane comunque importante il pap test.

-Epstein-Barr (EBV): responsabile dell’insorgenza di patologie infettive: mononucleosi infettiva; e di

neoplasie: Linfoma di Burkitt, carcinoma rinofaringeo, morbo di Hodgkin, Linfomi T, adenocarcinoma

gastrico. Fu il primo virus ad essere associato ad una neoplasia umana, in quanto fu ritrovato in linee

cellulari linfoidi da un tessuto di un paziente affetto da linfoma di Burkitt, malattia che nel 1961 si diffuse a

livello endemico nell’Africa centrale. Furono poi in seguito scoperti gli ulteriori ruoli nei processi infettivi e

neoplastici di tale virus.

E’ uno degli 8 herpesvirus fino ad ora identificati e presenta un envelope di circa 150-180 nm di diametro

con un nucleocapside a struttura icosaedrica contenente una molecola di DNA lineare a doppia elica.

L’envelope lipoproteico contiene almeno tre glicoproteine, definite “complesso degli antigeni di

membrana” (MA) di cui due mediano l’adesione del virus al recettore presente sul linfocita B mentre la

terza è coinvolta nell’adesione del virus con la membrana cellulare della cellula ospite.

-Infezione primaria da EBV: Il comportamento del virus in seguito ad infezione primaria può variare in base

a differenti fattori: nei paesi in via di sviluppo l’infezione si manifesta generalmente nella prima infanzia

senza alcun sintomo apparente di malattia; nei paesi più sviluppati invece l’infezione primaria è

generalmente ritardata fino all’adolescenza, quando esita nella Mononucleosi Infettiva. Una volta avvenuta

l’infezione generalmente il virus persiste per tutta la vita in uno stato quiescente (tale persistenza

asintomatica ha luogo nella zona orofaringea da dove il virus viene rilasciato, ad intermittenza, nella saliva e

nel sangue periferico).

Il virus accede all’organismo a partire dal cavo orale, mediante la saliva. In questo distretto penetrano negli

epiteliociti oro-faringei, dapprima venendo a contatto con essi grazie al legame tra le glicoproteine

localizzate sul proprio envelope ed i recettori di membrana CD21 o CR2 ed in un secondo momento

subendo un vero e proprio processo endocitotico. All’interno degli epiteliociti ha luogo così il ciclo

replicativo che esita nella lisi della cellula ospite e nel rilascio di virioni neoformati. Alcuni di questi virioni

vengono nuovamente inglobati dagli epiteliociti adiacenti mentre altri vengono in contatto, attraverso le

glicoproteine del proprio envelope, con la molecole CD21 presenti sulla superficie cellulare dei linfociti B

delle locali stazioni linfatiche. Nei linfociti B il virus non si replica ed il suo genoma è presente sotto forma

episomiale. Una volta che i linfociti B ritornano nel circolo sanguigno diventano portatori dell’infezione

latente, in quanto non sono permissivi e sopravvivono portando al loro interno l’EBV, che viene

continuamente trasmesso mediante la continua proliferazione dei linfociti B (immortalizzazione).

In seguito a specifici segnali esterni, tuttavia, il genoma virale può riattivarsi, con il conseguente ripristino

del ciclo replicativo e litico. E’ questa possibile riattivazione che rende il paziente infetto portatore a vita del

virus, con conseguente possibilità di trasmissione dell’infezione.

-Linfoma di Burkitt: neoplasia scoperta nel 1958 e prevalentemente concentrata in Africa ed in Nuova

Guinea, regioni in cui è presente in forma endemica anche l’infezione malarica. Nelle zone endemiche l’età

di insorgenza è di 8 anni e in più del 95% dei casi le cellule sono EBV positive; nelle zone non endemiche

invece l’età di insorgenza è di 16 anni e circa l’80% dei linfomi non sono associati ad infezioni virali. Un

elemento costante ad entrambi i tipi di linfoma risulta invece essere la traslocazione cromosomica tra il

cromosoma 8 ed i cromosomi 14, 2 o 22, la cui importanza è legata all’espressione dell’oncogène c-myc.

Con la traslocazione infatti si verifica la rottura del locus del c-myc, che codifica per proteine nucleari

coinvolte nella replicazione e trascrizione del DNA, ed il conseguente passaggio di tale gene in una

posizione adiacente a geni codificanti per proteine che regolano il differenziamento dei linfociti B, a livello

dei cromosomi 14, 2 o 22 (a seconda nel cromosoma con cui avviene la traslocazione). Poiché tali geni

coinvolti nel differenziamento dei linfociti B sono costantemente espressi, anche il gene c-myc , che si

giustappone ad essi, subisce una continua espressione, con la conseguente perdita della capacità di

regolare il ciclo cellulare, aumento incontrollato della trascrizione genica e proliferazione incontrollata dei

infociti B.

Inizialmente la proliferazione è di origine policlonale, quindi non maligna. Soprattutto nelle zone

sottosviluppate, tale linfoma è associato alla patologia malarica, in quanto provoca lo sviluppo di una

condizione di immunodepressione T e di proliferazione dei linfociti B. Se infatti si manifesta una

traslocazione cromosomica a livello di una cellula B proliferante, si genera una neoplasia monoclonale in cui

una cellula geneticamente alterata ha il sopravvento sulle cellule normali per la sua crescita aumentata e

per la resistenza alla sorveglianza immunitaria di tipo T (parzialmente depressa dalla malattia malarica.

Come detto prima, il virus EBV permane normalmente nelle cellule B sotto forma di infezione latente.

Durante tale latenza, la trascrizione è ristretta a circa 10 degli 80 geni di cui è costituito il genoma virale,

che codificano per specifici prodotti:

-EBNA: Epstein Barr Nuclear Antigen

-LMP: Latent Membrain Protein

-EBERs: piccoli RNA nucleari, non tradotti in proteine.

Tali conoscenze riguardo all’azione dell’EBV sono dovute allo studio di linee cellulari linfoblastoidi (LCL) in

vitro, ovvero quelle linee cellulari ottenute normalmente in coltura dopo l’infezione del linfocita B col virus:

solo una percentuale di queste cellule risultano essere permissive per la replicazione e solo i geni sopra

detti vengono trascritti. L’espressione coordinata di EBNA ed LMP nel linfocita B comporta notevoli

mutazioni fenotipiche della cellula, comprendenti l’immortalizzazione, l’aumentata espressione di oncogèni

come bcl-2 e di antigeni localizzati sulla superficie cellulare.

E’ tuttavia noto che tra le linee linfoblastoidi e linee tumorali ottenute da biopsie di linfomi di Burkitt,

esistono differenze fenotipiche che si manifestano soprattutto con diversi geni espressi durante la latenza

del virus.

Latenza di tipo I: riscontrabile nelle biopsie di linfoma di Burkitt. Sono espressi solo i geni EBNA 1,

o codificanti per proteine che permettono la replicazione del DNA virale in forma episomica, ed EBER.

Latenza di tipo II: riscontrabile nel carcinoma nasofaringeo e linfoma di Hodgkin. Ad essere espressi

o sono i geni EBNA 1, LMP1, LMP2, EBER.

La latenza di tipo III: è stata riscontrata nelle linee cellulari linfoblastoidi e si manifesta con

o l’espressione dei geni EBNA 1-6, LMP1, LMP2, EBER.

Una importante conseguenza di questa espressione ristretta di geni virali e di molecole di adesione è che le

cellule tumorali possono sfuggire al controllo immunitario citotossico EBV- specifico.

-Carcinoma Nasofaringeo: definito anche NPC (Nasopharyngeal carcinoma). E’ un carcinoma che insorge a

livello delle cellule epiteliali ed è molto diffuso nel sud-est della cina, tra la popolazione maschile. La

differente incidenza è probabilmente dovuto a fattori ambientali e ad abitudini, tra le quali il consumo di

pesce essiccato e salato, contenente notevoli quantità di nitrosamine o l’utilizzo di piante appartenenti alla

famiglia delle Euphorbiacee, contenenti esteri del forbolo che inducono il ciclo replicativo del virus di

Epstain-Barr, nella medicina cinese. In questo caso le cellule epiteliali sono permissive, quindi teoricamente

non dovrebbero andare in contro a trasformazioni: tuttavia alcune di queste cellule possono andare

incontro a “non permissività”, elemento che rende la cellula maggiormente suscettibile alla trasformazione,

in seguito a modificazioni genetiche. Sono gli elementi sopra citati ad essere, con ogni probabilità, i

responsabili del passaggio cellulare da “permissive” a “non permissive”. Il genoma virale risulta essere

sempre presente nella cellula tumorale ed il collegamento tra EBV e questo tumore è sostenuto dalla

presenza di elevati livelli sierici di IgG e IgA diretti contro gli antigeni virocapsidici e precoci dei virus. Per

questo motivo è stata di recente scoperta l’utilità nel rilevare i livelli sierici di tali anticorpi, al fine di

effettuare una diagnosi precoce.

-Linfoma di Hodgkin: Il legame tra tale carcinoma e l’EBV è stato rilevato mediante studi

sieroepidemiologici che hanno permesso di misurare un elevato livello di anticorpi contro gli antigeni EBV

nei pazienti con Linfoma di Hodgkin. Un ulteriore legame è stato confermato dall’aumento di almeno tre

volte della probabilità di sviluppare tale tumore, in pazienti precedentemente affetti da mononucleosi

infettiva. Più di recente sono stati evidenziati antigeni virale e genoma virale nelle cellule neoplastiche di

oltre il 50 % di pazienti affetti da tale linfoma.

-Virus dell’epatite B (HBV): membro della famiglia degli Hepadnavirus. E’ un virus a DNA epatotropico, che

provoca danni acuti e cronici alla cellula epatica, inducendone un processo flogistico. E’ infatti coinvolto

nell’insorgenza dell’epatite B, malattia infettiva, e dell’epatocarcinoma. All’interno del nucleocapside si

presenta un DNA circolare a singolo filamento mentre all’esterno si trova un ulteriore involucro di natura

glicoproteica, a livello del quale si localizza l’antigene virale di superficie detto HBsAg (Antigene Australia)

che permette l’attivazione di anticorpi neutralizzanti.

Avvenuto il contagio, vi è un periodo di incubazione di circa 4 settimane prima che l’antigene HBsAg

compaia nel sangue. Solo dopo 60- 180 giorni incominciano a manifestarsi i primi sintomi. Al termine della

malattia, circa 4 settimane dopo l’insorgenza, si assiste alla scomparsa dell’antigene HBsAg mentre nel caso

di insorgenza di neoplasia epatica, tale antigene persiste nel sangue, indicando la presenza di uno stato

cronico dell’infezione. Gli epatociti infettati contengono il DNA di HBV libero, in forma integrata o talvolta

in entrambe le forme: il DNA episomiale è riscontrabile nella fase acuta dell’infezione ed in alcuni stadi

dell’infezione cronica, mentre il DNA virale integrato si osserva nell’infezione cronica e specialmente

nell’epatocarcinoma. Non sono infatti stati mai descritti casi di carcinomi epatocellulari con la sola presenza

di DNA episomiali, in assenza di forme integrate. Dato che il pattern di integrazione nei portatori cronici

dell’infezione, che avviene in assenza di siti preferenziali di integrazione, sono simili a quelli che si

manifestano nei pazienti con epatocarcinoma, è stato possibile inoltre concludere che questi

riarrangiamenti avvengano prima della trasformazione neoplastica.

Meccanismo d’azione: il meccanismo di integrazione ed i suoi effetti sull’espressione genica non sono

ancora del tutto noti. Sebbene alcuni studi su marmotte abbia permesso di rilevare che l’integrazione di

sequenze virali in tumori epatici provochi, in quella specie, l’attivazione di oncogèni cellulari, il numero di

siti di integrazioni in prossimità di proto-oncogèni è talmente limitato da non permettere di dedurne un

ruolo fondamentale nella cancerogenesi epatica.

E’ stato tuttavia rilevata la presenza di anomalie cromosomiche a livello dei siti di integrazione che

riguardavano geni quali quelli codificanti per la ciclina A, provocando modificazioni del controllo della

crescita cellulare, o la perdita di un allele del gene p53. Questi eventi sono dunque responsabili di un

costante accumulo di mutazioni, in quanto vengono a meno i controlli durante il normale ciclo cellulare

della cellula ospite: è proprio la necessità di accumulo di eventi mutageni che spiega il lungo periodo di

latenza prima dell’insorgenza dell’epatocarcinoma.

Proprio per tali disfunzioni riguardanti la proliferazione delle cellule epatiche, è stato possibile creare un filo

di continuità tra infiammazioni epatiche ed epatocarcinoma: spesso infiammazioni croniche, come l’epatite

C, inducono fenomeni di iperplasia e rigenerazione epatica, in seguito a cirrosi. E’ proprio tale rigenerazione

epatica che potrebbe espandere il numero di cellule proliferanti ad elevato rischio di mutazioni,

aumentando le probabilità di cancerogenesi.

Cancerogenesi da agenti fisici:

Tra gli agenti fisici dotati di potere oncogeno le radiazioni rivestono la maggiore importanza. Le radiazioni

sono infatti una notevole causa di cancerogenesi, come si è visto nell’aumento che nell’i incidenza delle

leucemie, in quanto causa di mutazioni del DNA.

-Radiazioni Ultraviolette : di tutte le radiazioni eccitanti, quelle ultraviolette (λ= 100-400 nm) detengono il

più noto potere oncogeno a causa del loro elevato assorbimento da parte del DNA. Poiché tuttavia i raggi

UV risultano essere poco penetranti, il loro danno si limita alla cute in particolare del viso, della testa e

delle braccia. Nell’esposizione prolungata a tali radiazioni infatti essi diventano responsabili di danni che

possono col tempo determinare l’insorgenza di carcinomi basocellulari, spinocellulari o di melanomi,

soprattutto in pazienti affetti da deficienze geniche a carico del sistema di riparazione del DNA. Riguardo ai

tempi di esposizione invece, vi sono alcune discordanze tra ricercatori in quanto alcuni sostengono che sia

la continua esposizione solare a determinare una sopraffazione della capacità riparativa del DNA, altri che

l’esposizione solare intermittente si correli al rischio di melanomi mentre l’esposizione continua

all’insorgenza di carcinomi cutanei. Il fenomeno neoplastico legato ai raggi UV sta comunque subendo un

generale aumento a causa della riduzione dello spessore dello strato dell’ozono.

Azione patogena: Nonostante abbiano energia minore rispetto alle radiazioni ionizzanti, ovvero quelle

radiazioni aventi energia sufficiente da provocare l’espulsione di un elettrone dall’atomo bersagliato, le

radiazioni ultraviolette sono comunque in grado di arrecare danni al DNA, generalmente inducendo la

formazione di legami covalenti tra due basi pirimidiniche adiacenti con conseguente formazioni di dimeri

(timina-timina; timina-citosina; citosina-citosina). Poiché i dimeri di timina sono letti come normale timina,

una vera e propria mutazione si manifesta in presenza di dimeri di timina-citosina, mutazione che subisce

riparazioni con difficoltà. Normalmente l’ingresso delle cellule nella fase S costituisce il momento di

maggiore sensibilità all’azione delle radiazioni, in quanto le basi pirimidiniche risultano essere più esposte.

L’assorbimento delle radiazioni UV è condizionato dallo spettro di assorbimento delle molecole bersagliate.

In particolare l’assorbimento risulta essere tanto maggiore quanto più la lunghezza d’onda delle radiazioni

si avvicina a quello dello spettro massimo di assorbimento del composto bersaglio: per esempio le

radiazioni UV con λ compresa tra 250 e 300 nm, hanno come principale bersagli gli acidi nucleici e le

proteine i cui spettri massimi di assorbimento sono rispettivamente di 260 e 280 nm.

-Radiazioni ionizzanti: comprendono radiazioni elettromagnetiche e radiazioni corpuscolate e sono tutte

molto più penetranti di quelle eccitanti, in quanto contengono una energia superiore a 10 eV ovvero

maggiore di quella presente a livello dei legami chimici delle molecole bersaglio che vengono

conseguentemente rotti.

La cancerogenesi da radiazioni ionizzanti viene fatta generalmente rientrare nella tumorogenesi

multifasica, suddivisibile dunque nelle fasi di iniziazione, promozione e progressione e predilige

generalmente bersagli quali la cute ma soprattutto cellule emopoietiche e tiroidee, fenomeno che giustifica

la maggiore incidenza di leucemie e neoplasie tiroidee, probabilmente dovute ad una minore efficienza dei

meccanismi riparativi. Molto sensibili alle radiazioni ionizzanti sono anche le gonadi nelle quali può risultare

soppressa la gametogenesi o si possono verificare mutazioni a carico delle cellule germinali, trasmissibili

alla prole.

Azione patogena: l’energia trasmessa dalle radiazioni ionizzanti alle cellule si ripartisce uniformemente ai

vari costituenti cellulari con la conseguenza che circa l’80%, percentuale cellulare costiuita da acqua, viene

assorbita dall’acqua. I danni più gravi che tuttavia tali radiazioni provocano a livello cellulari sono definiti

“effetti diretti” e vengono esercitati nei confronti del DNA, che va incontro alla rottura di uno o tutte e due i

filamenti e alla possibile distruzione di basi. In seguito a tali eventi si manifestano gravi alterazioni,

delezioni, traslocazioni e talvolta mutazioni puntiformi. Al contrario di ciò che avviene con le radiazioni

eccitanti, la maggiore sensibilità delle cellule alle radiazioni ionizzanti risulta essere durante le fasi G , M e

2

nel periodo postmitotico, che precede l’entrata della cellula nella fase G .

1

Il fatto che parte dell’energia venga assorbita dall’acqua, porta come conseguenza l’insorgenza di “effetti

indiretti” sullo stato di normalità cellulare. In particolare un grave danno che deriva dalla ionizzazione

dell’acqua è il danno ossidativo, ovvero la formazione di radicali dell’ossigeno a livello cellulare. Se presenti

in quantità normali, tali radicali possono essere eliminati grazie alla somministrazione di antiossidanti e alla

presenta di antiossidanti endogeni, quali il glutatione (che agisce mediante i gruppi sulfidrilici SH) ed enzimi

quali il superossido dismutasi, la catalasi o la perossidasi.

In specifiche dosi inoltre tali radiazioni possono provocare l’attivazione di provirus integrati nel genoma

cellulare, con conseguente insorgenza di neoplasie virali. Tale effetto fu scoperto con l’insorgenza di

leucemia provocata dall’attivazione del genoma integrato del virus RadLV (Radiation Leukemia Virus).

Cancerogenesi chimica:

I cancerogeni di natura chimica includono sia sostanze inorganiche che organiche, dove quest’ultime stanno

subendo un notevole incremento in seguito a sostanze di nuova sintesi per uso industriale e l’aumento di

uso di combustibili fossili. Sono in generale sostanze che, interagendo col DNA nucleare, possono causare

modificazioni di tipo mutuativo od assimilabile a mutazioni. Poiché tuttavia sono numerosi i meccanismi

riparativi nei confronti del DNA, l’entità dell’effetto mutageno è da commisurare con l’efficacia degli effetti

riparativi, in quanto una mutazione a carico del DNA diventa significativa se non viene riparata o se risulta

essere compatibile con la proliferazione cellulare.

Nonostante molti studi siano stati volti a trovare una “dose soglia” di esposizione all’agente chimico al di

sotto del quale la probabilità della formazione di una neoplasia sia nulla, non è stato possibile riscontrarla

in quanto un qualunque livello di esposizione comporta un rischio, seppure commisurato alla dose.

NB: Al fine di valutare la cancerogenesi di specifiche sostanze, sono stati effettuati un elevato numero di

esperimenti, su animali, colture e microrganismi. Ad esempio mediante applicazione di sostanze chimiche

sulla pelle rasata di conigli: in seguito all’applicazione della sostanza iniziante e promoventi, venivano

elencate le reazioni (insorgenza o meno di tumori). L’esperimento sopra rappresentato permise di valutare

il processo cancerogeno come processo multifasico.

NB : Terminologia:

2

-Dose soglia: quantità minima perché si abbia neoplasia, spesso tossica. La si raggiunge con un insieme di

dosi frazionate. Ad esempio il rischio di tumore polmonare raggiunge livelli altissimi dopo 20 anni di fumo

di sigaretta (dosi frazionate durante in periodo di latenza di 20 anni).

-Periodo di latenza: tempo intercorso tra l’inizio della somministrazione ed il raggiungimento della dose

soglia che determina l’insorgenza del tumore.

-Cancerogeno incompleto: solo iniziante.

-Cancerogeno completo: iniziante e promovente.

-Cancerogeno diretto: non necessita di metabolizzazione.

-Cancerogeno diretto o procancerogeno: Sostanza che necessita di metabolizzazione per svolgere una

azione oncogena. La sostanza procancerogena può dunque subire una attivazione metabolica con

conseguente formazione di un metabolita cancerogeno prossimale che, per dare origine ad un tumore,

deve reagire col DNA a livello nucleare.

Cancerogenesi Multifasica:

Inizialmente definita “difasica” in quanto si pensava vi fossero due fasi:

-Fase di iniziazione

-Fase di promozione

Le prime evidenze riguardo a tale fenomeno derivarono da studi effettuati dallo studioso Isaac Berenblum

su animali ai quali veniva iniettato una sostanza organica cancerogena. Le prime manifestazioni patologiche

si susseguivano, in ordine, come:

-Fenomeni iperplastici che evolvevano in

-verruche che diventavano

-papillomi che infine si trasformavano in

-carcinomi squamosi.

A tali evidenze si affiancarono ulteriori scoperte quali:

-La sospensione del trattamento prima dell’insorgenza dei carcinomi, determinava la regressione di

verruche e papillomi

-riprendendo il trattamento con lo stesso cancerogeno, la comparsa dei tumori avviene nel momento in cui

la somma delle singole dose somministrate, prima e dopo la sospensione del trattamento, raggiunge il

valore soglia.

-La sospensione del trattamento, effettuato anche solo al primo comparire del carcinoma, non ne provoca

la regressione.

Berenblum giunse dunque alla conclusione che i tumori fossero l’evento terminale di almeno due

alterazioni fondamentali che si seguono sequenzialmente ed in base a ciò formulò la “teoria difasica della

cancerogenesi”. Secondo tale teoria la cancerogenesi si verifica in due tappe:

Iniziazione: fase che si genera dal trattamento col cancerogeno in dose subliminare, in modo tale

o da trasformale le cellule normali in neoplastiche;

Promozione: indotta dalla somministrazione della dose residua di cancerogeno o di altri agenti,

o definiti promoventi, che inducono le cellule trasformate a proliferare.

Iniziazione:

Dal punto di vista biomolecolare, l’iniziazione consiste nella comparsa di mutazioni a carico di uno o di

qualche gene provocata dal cancerogeno. E’ possibile sperimentare tale iniziazione sia in vivo, mediante

somministrazione di cancerogeni in dosi subliminari, che in vitro col rapido contatto delle cellule in coltura

con un cancerogeno. Grazie a tali ricerche è stato possibile giungere alla conclusione che i geni che

costitutiscono preferenzialmente il bersaglio dei cancerogeni nella fase iniziante sono alcuni oncogèni (nei

tumori umani H-ras e K-ras), che vengono attivati ed oncosoppressori (nei tumori umani Tp53), che

vengono inattivati. L’iniziazione rappresenta dunque il primo danno genomico nella cascata di mutazioni

che culmina con la formazione del tumore. Per questo motivo tale teoria è passata dall’essere definita

difasica ad essere designata come “teoria multifasica della cancerogenesi”.

Sebbene dal punto di vista citologico la fase di iniziazione non sia riconoscibile in base a caratteristiche

morfologiche univoche, sotto l’aspetto clinico sono indicative per la presenza di cellule iniziate

nell’organismo, tutte le lesioni precancerose tra le quali rientrano: la presenza di mutazioni trasmesse per

via ereditaria che predispongono all’insorgenza di un tumore; l’infezione da parte di oncovirus che hanno

integrato il loro genoma in quello cellulare; il massiccio assorbimento di materiale radioattivo.

NB: Nell’immagine è rappresentato il Benzo-alfa-pirene, un agente iniziante in dosi subliminari ma in grado

di indurre cancerogenesi raggiunta la dose soglia. L’azione cancerogena si innesca dal momento in cui tale

sostanza viene processata in sequenza dal Citocromo P-450 (divenendo benzo(a)pirene 7,8 eposside) poi

dall’enzima epossido-idrasi (benzo(a)pirene 7,8 diidrodiolo) e di nuovo dal citocromo P-450. Il prodotto che

ne deriva (benzo (a) pirene 7,8 diidrodiolo-9,10 eposside) si lega covalentemente al DNA, generando con

esso un addotto. Tuttavia l’addotto non è ancora una mutazione in grado di indurre un processo

cancerogeno: è la sostanza promovente che permette la stabilizzazione della mutazione in seguito a

divisione mitotica. La promozione è quindi l’induzione della proliferazione cellulare che provoca il

consolidamento delle mutazioni geniche, laddove ci sia stata l’iniziazione. Esempi di sostanze promoventi

sono: il fenobarbitale, la saccarina (dolcificante di un tempo), la diossina (presenti nel fumo di sigaretta,

motori a scoppio) ma soprattutto gli ormoni, sostanze normalmente presenti nel nostro organismo.

NB: Gli estrogeni hanno tuttavia nella donna anche un ruolo iniziante: non a caso il tumore alla mammella è

uno dei più diffusi. L’estradiolo viene infatti metabolizzato, con conseguente formazione di chinoni e

semichinoni, sostanze che possono dare origine a composti reattivi dell’ossigeno e dei lipidi incrementando

la probabilità di insorgenza di tumori.

Promozione:

La scoperta di tale fenomeno fu dovuta ad esperimenti effettuati su animali. Somministrando a livello

cutaneo una quantità subliminare di un determinato cancerogeno (ad esempio Benzopirene) e

sottoponendo in un secondo momento tale zona a specifici stimoli meccanici o sostanze quali olio di

croton, cloroformio…. Si poteva assistere alla comparsa in tali zone di carcinomi cutanei. L’olio di Croton e

gli altri agenti dotati della stessa attività furono dunque definiti “agenti promoventi o cocancerogeni” in

quanto promuovono (favoriscono) la cancerogenesi, solo se somministrati dopo uno stimolo sicuramente

cancerogeno in quantità subliminare. La fase di promozione è dunque inducibile, dopo somministrazione

del cancerogeno in dosi subliminari, o mediante la somministrazione residua del cancerogeno o mediante

la somministrazione di agenti promuoventi.

NB: Nella penultima immagine in alto è possibile osservare alcune importanti caratteristiche del processo

cancerogeno difasico. Innanzi tutto, affinché si manifesti il tumore, è necessario che la somministrazione

dell’iniziante preceda quella dell’agente promovente e non viceversa. Inoltre si può osservare che

l’insorgenza del tumore nell’animale si verifica solo se l’agente promovente viene somministrato in maniera

continua.Se infatti tra una somministrazione e l’altra di tale agente passa un ampio arco di tempo, non si

verifica il fenomeno cancerogenico. Quest’ultimo dato è indice della reversibilità del danno indotto dagli

agenti promoventi, al contrario di quelli indotti da agenti cancerogeni: se infatti durante la

somministrazione di agenti promoventi si verifica l’insorgenza di verruche o papillomi, questi possono

regredire in seguito alla sospensione di tale trattamento.

Anche nell’uomo dunque il contatto con composti cancerogeni in quantità subliminari NON deve essere

considerato esente da pericoli in quanto una successiva ripetuta stimolazione con agenti promoventi può

indurre l’insorgenza di neoplasie.

Biotrasformazione ed attivazione metabolica dei cancerogeni:

Le biotrasformazioni sono delle reazioni enzimatiche aventi come substrato xenobiotici, volte per lo più a

rendere tali sostanze esogene più polari e quindi più adatte ad essere escrete, con diminuzione

dell’eventuale tossicità associata (processo di detossificazione). A tale bioinattivazione si affiancano tuttavia

rischi associati ai metaboliti intermedi che si formano durante tali processi enzimatici, in grado con la loro

reattività di dare origine a processi patogeni tra i quali quello cancerogeno (trasformazione procancerogeni-

> cancerogeni).

Nell’immagine viene descritto il fenomeno di attivazione metabolica di un procancerogeno in cancerogeno,

mediante la formazione di metaboliti intermedi, ognuno dotato di una propria capacità reattiva con

composti nucleofili (tra i quali il DNA).

I cancerogeni possono infatti essere distinti in cancerogeni diretti, dotati di una elevata attività elettrofilica

e quindi in grado di legare direttamente composti nucleofili quali il DNA e cancerogeni indiretti o

procancerogeni, incapaci di interagire col DNA. Sono quest’ultimi ad essere in grado di acquisire la capacità

di interagire con il DNA in seguito alle reazioni di biotrasformazione, catalizzate da specifici enzimi. Tuttavia

non tutti i derivati metabolici dei cancerogeni indiretti hanno lo stesso potere cancerogeno: alcuni

detengono un potere cancerogeno moderato e vengono definiti cancerogeni intermedi o prossimali,

mentre altri, definiti cancerogeni terminali o definitivi, risultano forniti di una attività oncogena molto più

potente di quella espleta dai suoi precursori, aumentando nettamente la loro capacità di reazione con

composti nucleofili.

Quindi: Dal momento in cui l’organismo viene esposto a sostanze xenobiotiche, si instaurano processi di

detossificazione con la conseguente formazione di metaboliti in grado di essere escreti o attivati

metabolicamente. Se tali sostanze subiscono un processo di attivazione metabolica, possono legarsi al DNA

formando dei composti definiti addotti e rendendo la cellula normale una cellula iniziata. Nel caso in cui

tale anomalia venga riparata o provochi l’apoptosi cellulare, si ha il ritorno ad uno stato di normalità

mentre qualora essa permanga nella cellula e si accumulino altri danni al DNA o stimoli proliferativi

(processo di promozione), la cellula diventa una “ cellula staminale tumorale”, con conseguente

progressione del processo neoplastico.

Le sedi principali di trasformazione di xenobiotici sono il fegato, il rene, il tratto gastrointestinale, il

polmone ed il plasma e nelle diverse specie animali è possibile notare differenze sia nella velocità di

trasformazione che nelle vie di biotrasformazione.

A livello microscopico:

L’attivazione metabolica dei cancerogeni avviene ad opera di sistemi enzimatici localizzati sulle membrane

del reticolo endoplasmatico definiti “sistemi enzimatici microsomiali” e spesso identificati come DMES

(Drug Metabolizing Enzyme System) o come MFO (cytocrome P40 associated mixed function oxidates),

responsabili anche della trasformazione metabolica dei farmaci. Generalmente il metabolismo degli

xenobiotici comprende reazioni di ossidazione e riduzione che necessitano della presenza di enzimi definiti

“monossigenasi” in quanto in grado, in presenza di O , di inserire un atomo di ossigeno nel substrato e

2

trasformare l’altro in acqua. Come il termine MFO stesso indica, il citocromo P-450 risulta essere il

principale enzima coinvolto nel processo ossidativo. La reazione che esso catalizza può essere scritta come:

+ +

NADPH + H + O + AH -> NADP + AOH + H O dove A è il substrato in cui è presente un sito di ossigenazione.

2 2

Il citocromo P-450 contiene un atomo di ferro nel gruppo prostetico che durante il processo metabolico

lega direttamente l’ossigeno ed un sito di legame per il substrato. In seguito all’intervento dell’enzima

Citocromo P-450 reduttasi, il NADPH viene ridotto a NADP ed il flusso di elettroni da esso derivante passa

direttamente al citocromo, permettendo il passaggio di elettroni solo uno per volta.

3+ 2+

Un primo elettrone riduce il Fe legato al citocromo, a Fe favorendo dunque il legame con una molecola di

2+ 3+

ossigeno che riporterebbe Fe allo stato ossigenato Fe (spesso a questo punto si verifica il rilascio di una

2-

specie reattiva dell’ossigeno (ROS), ovvero lo ione superossido O )-> nonostante la breve emivita dei

radicali dell’ossigeno, spesso tali forme molecolari reattive riescono a raggiungere il nucleo provocando

importanti mutazioni a livello del DNA, che comprendono fenomeni di delezioni, inserzioni, perdita o

sostituzione di una base e, molto spesso, ossidazione della guanina ad 8-azaguanina. Per questo motivo i

ROS vengono considerati come responsabili di numerosi processi mutageni;

Il secondo elettrone scinde la molecola di O legata al ferro (elettrone derivante direttamente dal citocromo

2

b5), dando origine a specie instabili che portano al legame di un atomo di ossigeno con il sito reattivo del

substrato. Il substrato così ossidato viene rilasciato insieme ad una molecola di acqua. Nel caso di reazioni

coinvolte nel processo cancerogenico, il substrato è rappresentato da un procancerogeno che, una volta

subito il processo di ossidazione, viene trasformato in cancerogeno e rilasciato.

NB: I numerosi enzimi collegati al citocromo P-450 sono codificati a partire da una superfamiglia genica

definita con l’acronimo CYP (Cythocrome P). I geni facenti parte di tale superfamiglia sono tuttavia

altamente polimorfici, fenomeno da cui deriva l’esistenza di numerose varianti di tali enzimi sia a livello di

specie che individuale (CYP 1-4 metabolizzano xenobiotici, CYP 5-57 metabolizzano molecole endogene).

Ciò può spiegare inoltre le differenti sensibilità intraspecifiche ed intraindividuali a stessi composti chimici,

differenza ulteriormente amplificata dall’ampia variabilità nell’inducibilità degli enzimi che costituiscono il

sistema: l’attività di alcuni enzimi microsomiali, a seconda della differente espressione degli enzimi stessi,

può essere aumentata dall’esposizione di specifiche sostanze definite induttori. Con l’incremento della loro

attività aumentano anche le forme reattive dell’ossigeno che ne derivano (ROS), con conseguente maggiore

esposizione alla cancerogenesi. Tipici induttori sono l’alcool ed i componenti del fumo quali idrocarburi

aromatici policiclici e N-nitrosamina.

Radicali dell’ossigeno nei processi flogistici:

La formazione di radicali liberi dell’ossigeno non si verifica tuttavia solo nei normali processi

biotrasformativi, ma anche in quelli flogistici dove assumono un ruolo di mediatori chimici. Durante la fase

cellulare della reazione infiammatoria infatti, in seguito ai processi di adesione vasale dei leucociti,

diapedesi e chemiotassi, si ha la finale fagocitosi, processo tramite il quale i fagociti riconoscono, inglobano

e si liberano di noxa flogogene come i batteri. E’ durante il processo di degradazione che si può verificare la

formazione di radicali dell’ossigeno in quanto l’eliminazione delle sostanze estranee può avvenire o

attraverso meccanismi ossigeno-indipendenti, mediati dall’attività lisosomiale e quindi da lisozimi e 2-

proteasi batteriche, o attraverso meccanismi ossigeno-dipendenti che portano alla formazione di H O e O

2 2

(ione superossido). In caso di infiammazione cronica, tali ossidi possono subire un notevole aumento, col

conseguente rischio di iniziazione cellulare.

Azione patogena dei radicali liberi:

L’azione cancerogena dei radicali liberi dell’ossigeno è stata ipotizzata in seguito alla costante presenza di

reazioni mediate da tali composti, nelle fasi iniziale, di promozione e progressione tumorale. Sebbene non

sia ancora del tutto possibile valutare la relazione quantitativa tra danno al DNA misurato e sviluppo del

cancro, è comunque possibile creare una relazione stretta tra radicali liberi e cancerogenesi, anche in

seguito a numerosi comportamenti che essi hanno in comune con note sostanze cancerogene in quanto i

radicali dell’ossigeno possono:

-Causare alterazioni permanenti del DNA quali “crosslink” DNA-proteine, rotture del filamento, delezioni e

modificazione di basi azotate, compromettendo potenzialmente l’integrità dell’intero genoma.

-Modulare processi quali la trasduzione del segnale nucleare e l’attività di geni codificanti per fattori di

crescita, nonché il differenziamento e la morte cellulare.

-Provocare danni a carico di proteine coinvolte nella riparazione del DNA e nel processo apoptotico.

-Indurre l’autossidazione lipidica, o perossidazione, a livello delle membrane cellulari, fenomeno che oltre a

provocare la degradazione della membrana plasmatica, provoca la formazione di idroperossidi, intermedi

reattivi non radicalici che tuttavia possono essere fonte secondaria di radicali liberi ed aldeidi in gradi di

interagire con i gruppi SH e NH delle proteine con conseguente formazione di prodotti ossidati non

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digeribili a livello lisosomiale. Tale perossidazione può inoltre provocare l’alchilazione dell’RNA (fattore

altamente pro-cancerogeno) e la liberazione di acido arachidonico che mediante la seguente formazione di

eicosanoidi, induce la proliferazione cellulare.

Test di Ames:

Permette di valutare in vitro, su microrganismi, processi di mutagenesi ed individuare composti mutageni.

Il microrganismo più comunemente usato è la Salmonella typhimurium, al quale viene generalmente

indotta la mutazione del gene che codifica per l’enzima istidinsintetasi con la conseguenza che esso si

sviluppa solo in terreni addizionati di istidina, a causa della sua incapacità di effettuarne la sintesi. In terreni

solidi privi di istidina quindi non si ha la formazione di colonie, a meno che venga aggiunto un composto, il

composto in esame appunto, che sia in grado di creare nel genoma batterico una seconda mutazione che

renda il batterio di nuovo in grado di sintetizzare istidina. Se, nonostante l’iniziale mutazione del gene

codificante per l’istidinsintetasi, si ha la formazione di colonie, il composto in esame è un mutageno.

Come si è detto, tale test permette di valutare il potere mutageno delle sostanze ma per poter valutare

quello cancerogeno sarà necessario effettuare ulteriori prove.

Crescita tumorale:

Per tumore o neoplasia si intende una patologia caratterizzata dalla crescita, in uno specifico tessuto od

organo, di una massa cellulare costituita dalla progenie di una cellula somatica cha ha subito

progressivamente una serie di mutazioni a livello genomico, rendendo tale massa fenotipicamente

distinguibile dalle cellule normali del tessuto di origine.

I tumori hanno una origine monoclonale in quanto la popolazione cellulare di un tumore deriva da un’unica

cellula che ha subito nel proprio genoma una o più mutazioni (fenomeno di iniziazione). Quando la cellula

iniziata inizia a moltiplicarsi (fenomeno della promozione) forma una progenie, costituente la popolazione

cellulare neoplastica che, pura avendo origine monoclonale, è comunque molto eterogenea in quanto ogni

cellula che la costituisce può andare incontro ad altre mutazioni. Se tali ulteriori mutazioni inducono un

vantaggio replicativo anche solo in una cellula, nella popolazione neoplastica incomincia a manifestarsi la

progressiva comparsa di subcloni generalmente dotati, nei tumori maligni, di maggiore aggressività

(fenomeno della progressione).

NB: I tre fenomeni sopra descritti hanno permesso di individuare nella cancerogenesi tre tappe evolutive:

-Iniziazione: una o più mutazioni trasformano la cellula normale in una cellula neoplastica latente

-Promozione: con l’accumulo di altre mutazioni geniche e/o di stimoli proliferativi si ha la comparsa di un

tumore clinicamente evidente, costituito dalla progenie della cellula trasformata che ha iniziato a

moltiplicarsi.

-Progressione: ulteriore comparsa di mutazioni nel genoma di alcune cellule della popolazione del tumore

quali quelle, ad esempio, responsabili della comparsa del fenotipo metastatico che possono prendere il

sopravvento riproduttivo.

Quindi, nonostante la grande diversità di tumori, tutti hanno in comune una indipendenza dai meccanismi

di controllo della moltiplicazione cellulare che diviene continua ed illimitata non solo nel tempo ma anche

nello spazio, provocando la formazione di nuovi rapporti tra tali cellule ed i tessuti limitrofi: nei tumori

benigni si ha una semplice compressione dei tessuti circostanti, mentre in quelli maligni si assiste ad una

vera e propria invasione dei limiti anatomici circostanti. Tale autonomia replicativa è una conseguenza

fondamentalmente di due fenomeni:

-Riduzione o perdita della proprietà di sottostare a meccanismi regolatori della proliferazione cellulare

oppure

-Riduzione o perdita della possibilità di andare incontro a morte cellulare programmata.

Entrambe dovute a fenomeni mutazionali a carico di specifici geni. Alla base della cancerogenesi dunque vi

sono danni genomici che intervengono gradualmente nella cellula somatica progenitrice del clone

neoplastico e, una volta che quest’ultimo si è costituito, ulteriori danni possono colpire una o più cellule

della popolazione tumorale. Nel corso dell’accumulo di questi danni, ad essere colpiti non solo sono i geni

codificanti per prodotto coinvolti nella regolazione della proliferazione cellulare, ma anche quelli codificanti

per proteine preposte alla riparazione dei danni del DNA, con la conseguenza che tali danni del DNA, non

più riparati, incominciano ad accumularsi nelle cellule con tale mutazione. Si può dunque affermare che in

una popolazione neoplastica si verificano progressivi fenomeni mutazionali di una o più cellule che possono

prendere il sopravvento moltiplicativo su altri cloni cellulari, modificando di continuo le caratteristiche

biologiche della neoplasia: per questo motivo la patologia neoplastica non è statica ma risulta essere una

entità dinamica, in continua evoluzione verso una condizione sempre più grave di disfunzione genica.

NB: è per tutto ciò che è stato appena detto che si può affermare che la popolazione cellulare che

costituisce il tumore, sebbene abbia quasi sempre origine monoclonale, si presenta altamente eterogenea,

ovvero costituita da cellule morfologicamente e funzionalmente differenti tra loro.

Nell’immagine viene rappresentata la proliferazione cellulare di una cellula iniziata, che avviene con due

modalità diverse a seconda che essa avvenga in un compartimento proliferativo od in un compartimento in

cui la proliferazione viene inibita (nel caso dei tumori benigni). Nel primo caso avviene che la cellula

trasformata inizia a replicarsi mantenendo una notevole instabilità dal punto di vista genetico poiché

infatti dividendosi accumula altre mutazioni casuali. Nel secondo caso, che può verificarsi nel caso dei

tumori benigni in zone a cavallo dei limiti anatomici del tessuto nel quale si è sviluppato il tumore, la

proliferazione delle cellule tumorali viene inibita e tali elementi cellulari subiscono fenomeni di

differenziamento, quiescenza o morte. Se la cellula riesce tuttavia a sopravvivere, grazie a specifici

meccanismi, anche in tale compartimento, il tumore diventa invasivo e si generano metastasi.

Curve di crescita:

L’immagine sopra mostra che i tumori possono crescere in modo diverso, a seconda della lunghezza del

ciclo cellulare: in base a ciò si può calcolare la velocità di divisione cellulare. Le cellule sane si replicano con

un ciclo cellulare più veloce rispetto a quelle tumorali poiché infatti la divisione delle cellule tumorali

richiedono un tempo maggiore, ma tale divisione avviene in maniera ininterrotta.

Nella tabella sopra si può osservare la velocità di crescita della massa tumorale: all’inizio risulta essere

molto lenta ma col passare delle settimane tale velocità aumenta rapidamente fino ad un picco massimo,

per poi diminuire (tale passaggio non è rappresentato in tabella) all’aumentare delle dimensioni e

dell’evidenza clinica del tumore.

Lo studio delle caratteristiche di crescita tumorale risulta essere molto importante al fine della diagnosi

clinica e della terapia. Una neoplasia diviene clinicamente rilevabile con gli attuali mezzi di indagine,

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quando assume un diametro maggiore di 3mm, che corrisponde ad un numero di 10 cellule. Il tempo

necessario per raggiungere tali dimensioni dipende dalle caratteristiche del ciclo cellulare del citotipo

appartenente alle primitive popolazioni tumorali e, nel caso di tumori solidi, dalla formazione dei vasi per il

tessuto tumorale.

L’andamento di crescita dei tumori solidi viene descritto dalla “curva Gompertziana” rappresentata

nell’immagine sopra: inizialmente l’accrescimento della massa tumorale ha un andamento esponenziale,

parallelamente all’accelerazione della velocità di crescita. Quando il tumore diventa clinicamente evidente,

10

ovvero presenta un numero di cellule pari a 10 circa, tale crescita si stabilizza ad un plateau ma comunque

progredisce fino allo stadio letale. Il motivo del raggiungimento del plateau è da attribuire alla diminuzione

della frazione di crescita (ovvero le cellule che vanno incontro a divisione) dal momento in cui il tumore

diviene clinicamente diagnosticabile; all’insufficiente sviluppo del sistema vasale per l’irrorazione del

tessuto tumorale a causa dell’aumento della massa tumorale; a fenomeni di necrosi ed apoptosi innescati

dall’ipossia/anossia ischemica delle cellule più distanti dai vasi.

NB: Terminologia inerente alla proliferazione cellulare:

-Frazione di crescita: frazione proliferante della popolazione cellulare.

-Crescita esponenziale: proliferazione continua di tutti gli elementi cellulari senza uscita dal compartimento

proliferante.

-Crescita Gompertziana: proliferazione con decremento di crescita in funzione del tempo.

-Perdita cellulare: frazione di cellule perse per migrazione o morte.

-Tempo di raddoppiamento volumetrico: tempo richiesto per raddoppiare il volume tumorale.

-Tempo di raddoppiamento cellulare: tempo richiesto per raddoppiare il numero cellulare

Ereditarietà dei tumori:

Solo da una trentina di anni si è giunti alla conclusione che alla base dell’accrescimento tumorale vi sia una

over-produzione di proteine che regolano positivamente la proliferazione cellulare (codificate da proto-

oncogeni che, attivati da mutazioni geniche, diventano oncogèni) o la mancata sintesi di proteine che

hanno un ruolo di freno sui meccanismi regolatori della proliferazione cellulare (codificate da geni

oncosoppressori o antioncogèni , i quali possono, in seguito a mutazioni, codificare per proteine

funzionalmente inattive). Tali alterazioni sono generalmente di natura somatica, sebbene talvolta possano

avvenire a carico di cellule della linea germinale, provocando mutazioni in tutte le cellule della progenie,

con conseguente aumento della probabilità di sviluppo di tumori ereditari o familiari. Come visto prima,

difficilmente una sola mutazione può indurre alla formazione di un tumore maligno, in quanto l’insorgenza

di un carcinoma è un processo multifasico innescato da numerose alterazioni sequenziali a carico dei geni

sopra detti, tuttavia nei tumori ereditari tali mutazioni si accumulano nell’arco di poco tempo, provocando

l’insorgenza precoce del tumore.

Nel caso dei tumori ereditari si parla della “teoria dei due colpi” per cui una prima mutazione avviene a

carico di un oncogène o di un oncosoppressore nelle cellule della linea germinale, con conseguente

trasmissione della mutazione a tutta la progenie cellulare, mentre una seconda mutazione si verifica a

carico dello stesso gene ma in cellule della linea somatica, con la conseguente insorgenza del tumore.

Nel Retinoblastoma familiare, tumore maligno a carico della retina, il soggetto colpito eredita una copia

danneggiata del gene Rb1 da uno dei genitori, gene che viene trasmesso alla progenie con le modalità

tipiche dell’ereditarietà autosomica dominante di tipo mendeliano. In questo caso, tutte le cellule

dell’organismo che ha ereditato il gene mutato possiedono una sola copia normale del gene in questione. Il

retinoblastoma si svilupperà quando questa copia normale sarà inattivata, a livello somatico (Ipotesi di

Knudson).

Come si è detto prima, quando mutazioni genetiche sono trasmesse al momento della fecondazione, esse

vengono trasmesse a tutte le cellule della progenie. Ma allora perché un tumore, in questo caso il

retinoblastoma, si sviluppa solo a livello della retina? Perché vi sono fattori che predispongono

all’insorgenza del tumore in tale distretto anatomico. (quali???)

Solo una minima percentuale di tumori risulta tuttavia essere a trasmissione genica. Sarebbe comunque

impossibile valutare l’insorgenza della patologia neoplastica, anche se ereditaria, attraverso test genetici

sebbene questi ultimi assumano un ruolo importante nella valutazione del rischio di insorgenza del tumore.

Tale valutazione avviene attraverso il rilevamento di eventuali mutazioni a carico di specifici geni, come il

BRCA1, responsabile della forma familiare di tumore alla mammella.

NB: Il carcinoma mammario familiare ha uno specifico fenotipo, associato alla mutazione del gene BRCA1 e

non BRCA2, come avviene nel carcinoma mammario sporadico. Infatti le cellule che presentano la

mutazione sopra detta assumono le caratteristiche delle cellule basali della ghiandola mammaria e non di

quelle luminali, che producono latte ed esprimono recettori per gli estrogeni e progesterone. Spesso

insieme alle mutazioni dei geni BRCA si verificano mutazioni di p53, rare nei carcinomi sporadici, che

permettono la sopravvivenza delle cellule nonostante l’elevata instabilità genomica attribuibile alla

mutazione a carico del gene BRCA1. Tale sopravvivenza è possibile in seguito alla perdita delle funzioni pro-

apoptotiche e di regolazione del ciclo cellulare dei prodotti dell’oncosoppressore. Sia p53 che BRCA1 si

trovano sul cromosoma 17 quindi probabilmente il fattore di inattivazione è uguale per entrambi i geni.

NB2: Gli oncogeni MET e RET se mutati inducono la cancerogenesi a livello rispettivamente della mammella

e ghiandole endocrine. Se uno dei due alleli è mutato, l’altro allele è più esposto a mutazioni.

Angiogenesi:

La possibilità di crescita di un tumore solido è strettamente connessa alla presenza di vasi sanguigni in

grado di apportare ossigeno e nutrienti al tessuto ed allontanare i cataboliti. Tutto ciò può verificarsi

mediante il fenomeno dell’angiogenesi, ovvero la formazione di nuovi vasi sanguigni per gemmazione a

partire da vasi preesistenti. Esiste anche una seconda via di formazione di vasi sanguigni ma non più a

partire da fenomeni di gemmazione, ma dalla crescita a partire da progenitori endoteliali indifferenziati.

In condizioni fisiologiche, l’angiogenesi deriva dall’aumento di richieste da parte di differenti tessuti in

seguito a processi infiammatori, riparativi, la normale crescita tissutale, lo sviluppo embrionale….

Nella patologia Neoplastica tuttavia il fisiologico equilibrio tra fattori che stimolano l’angiogenesi e fattori

che la inibiscono viene a meno, provocando il così detto switch angiogenico, che talvolta si innesca prima

dell’insorgenza del carcinoma in situ o del processo di invasione.

Inizialmente le cellule tumorali subiscono una crescita avascolare e acquisiscono l’ossigeno ed i nutrienti

necessari per la loro sopravvivenza per diffusione. In questa condizione la massa tumorale non supera i

3

3mm , in quanto al crescere della massa le cellule interne non ricevono un adeguato apporto di ossigeno e

vanno incontro a morte. Tale condizione si verifica fino allo switch.

Meccanismo di angiogenesi: l’angiogenesi è generalmente promossa da fattori di crescita dell’endotelio

vascolare VEGF che, nel caso specifico dei tumori, vengono espressi a livelli elevati dalle cellule tumorali in

seguito a specifici segnali induttori. Uno di questi è l’ipossia che agisce mediante l’attivazione dei fattori di

trascrizione Hipoxia inducible factor HIF-1 e HIF-2, espressi in elevate quantità nelle cellule localizzate in

zone lontane dai vasi sanguigni e che per questo ricevono una bassa quantità di ossigeno. Talvolta è

tuttavia possibile rilevare elevati livelli di HIF-1 in cellule prossime a vasi sanguigni e che quindi non

risentono dell’ipossia, cosa che permette di dedurre l’esistenza di un meccanismo ossigeno-indipendente

che stimoli la sintesi dei fattori HIF, come ad esempio mutazioni genetiche.

-A livello microscopico, l’accumulo intracellulare di HIF1 dipende dall’attività della proteina VHL, facente

parte di un complesso multiproteico con attività ubiquitino-ligasica di cui ne costituisce la subunità che

riconosce le proteine del substrato. Il suo principale substrato è il fattore trascrizionale HIF-1, che stimola la

trascrizione di geni coinvolti nell’angiogenesi (quali VEGF) e nella crescita invasiva (quali MMP1). Affinchè

possa avvenire il legame tra VHL ed il fattore HIF-1 e la degradazione proteolitica di quest’ultimo, è

necessario che HIF-1 subisca idrossilazione da parte dell’enzima prolil-idrossilasi PHD. Mentre in condizioni

di normossia tale idrossilazione può avvenire, in condizioni di ipossia gli enzimi PHD sono inibiti e la

mancata idrossilazione di HIF-1 provoca l’impossibilità di riconoscimento da parte di VHL, con conseguente

accumulo intracellulare e stabilizzazione di HIF-1. Anche mutazioni inattivanti di PHD possono provcare la

stabilizzazione di HIF-1 e lo stimolo all’angiogenesi e invasività tumorale.

NB: Il gene HIF-1 oltre a codificare per prodotti coinvolti nell’angiogenesi, codifica anche per proteine

coinvolte nella proliferazione cellulare, nell’apoptosi, nella mobilità, adesione e metabolismo (energetico e

glucidico) cellulare ed altri importanti meccanismi ai fini della sopravvivenza cellulare.

Anche cellule normali contribuiscono all’invasività neoplastica in quanto piastrine, cellule muscolari e

cellule stromali associate al tumore producono elevati livelli di VEGF, i quali recettori sono localizzati sulle

superfici delle cellule endoteliali.

NB1: Il fenomeno di angiogenesi può essere stimolato anche dalle cellule coinvolte nei processi

infiammatori, in grado di rilasciare VEGF e b-FGF (fibroblast growth factor), entrambi coinvolti nello stimolo

dell’angiogenesi. Tuttavia nella guarigione della ferita durante il processo infiammatorio prevalgono gli

inibitori dell’angiogenesi, cosa che non avviene durante la cancerogenesi.

Sebbene l’angiogenesi tumorale differisca da quella fisiologica per la distribuzione non regolare dei vasi e

par la presenza di diramazioni irregolari e tortuose con formazione di fenestrature che ne inducono una

elevata permeabilità, gli eventi che si verificano durante tale processo sono gli stessi:

1. Degradazione della membrana basale ed endoteliale ad opera delle MMPs, metalloproteasi che

provocano una progressione tumorale in seguito alla degradazione proteica della matrice

extracellulare. Sono iper-espresse nelle cellule neoplastiche e sintetizzate in forma inattivata (pro-

MMP) solo in un secondo momento attivate in seguito al taglio proteolitico operato da altre MMP o

proteasi di natura differente. La loro azione avviene nei confronti della matrice, in seguito alla loro

secrezione nell’ambiente extracellulare.La loro inibizione avviene ad opera di glicoproteine di

membrana dette TIMP (tissue inhibitors of metallopoteasis), che interagiscono con le MMP

inibendone la funzione.

2. Distacco dei periciti dall’endotelio e destabilizzazione del vaso in seguito all’aumento di

permeabilità.

3. Perdita delle connessioni tra le cellule endoteliali.

4. Proliferazione delle cellule endoteliali e loro migrazione nello spazio perivascolare, grazie alla

degradazione della matrice operata dalle MMP, in risposta al VEGF rilasciato dalle cellule tumorali,

ematiche e dello stroma peri-tumorale.

5. Differenziazione delle cellule endoteliali che aderiscono tra loro e si organizzano attorno al lume in

cui passerà il sangue.

6. I periciti e le cellule della muscolatura liscia vengono richiamati in loco e si riforma la membrana

basale.

7. il vaso neoformato si fonde con altri formando una rete circolatoria.

Nell’immagine soprastante vengono rappresentate le possibili vie di inibizione dell’angiogenesi durante il

processo di crescita tumorale: Bevacizumab, Sorafenib, Sunitinib e Talidomide sono dei farmaci

antitumorali che agiscono inibendo mediante differenti meccanismi l’angiogenesi; Gli Anti-MMP sono i

TIMP (tissue inhibitors of metalloproteasis), Trombospondina-1 e Trombospondina-2 e l’alfa2

macroglobulina. 3 9

In generale, la massa tumorale diagnosticabile è di 1cm , che corrisponde a 10 cellule (1 grammo di

tessuto) ed affinchè vi sia tale massa devono avvenire circa 30 raddoppiamenti. Una volta diagnosticato tale

tumore sarà dunque possibile intraprendere la terapia, sebbene l’aspettativa di vita sia comunque molto

breve. Dopo tale grandezza i tempi richiesti per raddoppiare ulteriormente è molto breve. Il tumore può

arrivare fino a 0,3 mm senza vascolarizzazione e se necessita di una ulteriore crescita, sarà necessaria la

formazione di una rete vascolare.

Le Metastasi:

Per metastasi si intende la disseminazione spontanea di cellule neoplastiche che, in seguito al distacco dalla

sede del tumore primitivo, raggiungono siti distanti da quello di origine e lo colonizzano formando una

nuova localizzazione neoplastica (il prof dice: Ogni metastasi si comporta come un tumore primario, poiché

dalla metastasi stessa possono staccarsi altre cellule che daranno ulteriori metastasi). E’ un fenomeno

tipico dei tumori maligni, di cui ne rappresenta l’evento clinico più grave tanto da provocare il decesso dei

pazienti nel 90% dei casi. Mentre i tumori benigni infatti non metastatizzano in quanto le loro cellule non

sono in grado di sopravvivere né replicarsi in organi diversi da quelli in cui si sono sviluppati, le cellule

metastatiche colonizzano altri organi più adatti alla loro sopravvivenza o si adattano loro stessi a tali

microambienti. Solo poche cellule di quelle entrate in circolo tuttavia saranno in grado di dare origine a

metastasi in quanto il fenotipo metastatico non è strettamente correlato all’attivazione di proto-oncogeni,

quanto alla comparsa di mutazioni geniche in alcune cellule del tumore che acquisiscono un sopravvento

riproduttivo: sono mutazioni acquisite stocasticamente. In seguito a tale mutazioni genomiche si generano

sottopopolazioni cellulari con cariotipi diversi, che rendono la massa tumorale di origine monoclonale un

insieme di cellule con diverse capacità.

Le metastasi si formano spesso, nella fase clinica silente micrometastatica, già da stadi molto precoci della

malattia neoplastica, sebbene talvolta siano evidenziabili anche dopo mesi dall’asportazione chirurgica del

tumore.

Affinchè una cellula metastatica si distacchi dal tumore primario deve:

-distaccarsi dalla massa primaria del tumore

-degradare la membrana basale

-interagire con la membrana cellulare sottostante

-invadere i tessuti circostanti

-penetrare vasi linfatici e sanguigni locali

-sopravvivere nel circolo

-entrare nei capillari e da qui penetrare nel parenchima dell’organo irrorato

-adattarsi al microambiente dell’organo e dare origine ad un nuovo tumore.

La diffusione delle cellule avviene attraverso vasi sanguigni e linfatici (infatti nella nominazione TMN, si

valuta N, ovvero il coinvolgimento linfonodale).

Diffusione per via ematica: Tipica dei sarcomi, di carcinomi renali, prostetici, tiroidei ed epatici e di tumori

che insorgono in distretti privi di vasi sanguigni. Per la crescita metastatica è necessario il contributo della

rete vascolare formatasi all’interno nella massa tumorale in seguito a neo-angiogenesi, in quanto questi

vasi sanguigni, essendo poveri di periciti e cellule muscolari lisce, sono relativamente permeabili, rendendo

facile l’accesso al circolo di cellule in grado di lisare la membrana basale peri-endoteliale. Una volta entrati

in circolo le cellule neoplastiche circolano sotto forma di aggregarti omotipici ed eterotipici (emboli

neoplastici) e vengono intrappolati nei principali distretti capillari dove si arrestano, attraversano

l’endotelio e si riversano nei tessuti, dove generano focolai metastatici.

Poiché i siti di localizzazione metastatica si trovano in prossimità della rete vascolare coinvolta, è possibile

ipotizzare la probabile successione delle metastasi di un carcinoma seguendo l’andamento dei vasi

sanguigni

I sistemi venosi coinvolti nel trasporto di cellule metastatiche possono essere quello vertebrale, costituito

dal plesso pelvico e dal plesso cerebrale, ed il sistema cavale, che coinvolge quello viscerale, portale e

polmonare: spesso cellule maligne della regione pelvica possono raggiungere il cervello senza mai passare

per il sistema cavale.

Tabella 9.11: il flusso di sangue in un organo non è tuttavia indice della maggiore incidenza metastatica

(MEI=Incidenza dei focolai metastatici/flusso di sangue arterioso all’organo bersaglio), ma vi sono altri

elementi determinanti (vedi dopo). Questo perché la diffusione maggiore delle cellule nel circolo sanguigno

non è indice di metastasi: si parla di metastasi quando le cellule tumorali maligne crescono in uno specifico

tessuto.

Alla fine del XIX secolo Stephen Paget (1855-1926) introdusse una nuova teoria riguardo al processo

metastatico che coinvolgeva le cellule tumorali maligne denominata “seed and soil” (seme e terreno).

Secondo questa teoria determinati tumori, come quello della prostata o della mammella che causano

frequenti metastasi al midollo osseo, sono in grado di formare metastasi in organi specifici. La cellula

tumorale, come un seme (seed), deve trovare il terreno (soil) giusto per poter attecchire. In termini

molecolari, la cellula tumorale esprime delle molecole che sono riconosciute solo da quei tessuti in cui

creeranno colonie metastatiche. Anche nel cuore, ad esempio, c’è una abbondante irrorazione sanguigna,

ma non si verifica una diffusione metastatica delle cellule tumorali. Proprio perché non è diretta la

correlazione tra presenza di irrorazione sanguigna e processo metastatico, è importante l’analisi del tipo di

tessuto in cui la cellula va a bloccarsi (il soil).

Diffusione per via linfatica: modalità di diffusione tipica dei carcinomi. Per questo motivo i linfonodi sono

spesso i primi siti di colonizzazione metastatica, che costituiscono il principale fattore prognostico negativo.

La diffusione linfatica delle cellule metastastiche è possibile grazie alla loro elavata permeabilità dovuta alla

povertà di giunzioni cellulari e alla presenza di una membrana basale non continua. Le cellule neoplastiche

penetrano così nei vasi linfatici, dove assumono un aspetto di aggregati cellulari (fenomeno di

embolizzazione) in grado di raggiungere, mediante i vasi afferenti, i linfonodi regionali.

Una volta entrati nei linfonodi regionali le cellule neoplastiche possono:

-Proliferare e sostituirsi alle cellule linfoidi locali. In seguito a tale fenomeno dai vasi linfatici efferenti

passerà linfa trasportante anche cellule neoplastiche che andranno dunque a colonizzare stazioni linfatiche

situate più a valle. In tal modo il linfonodo regionale si comporta da fonte di ulteriori metastasi, dette

metastasi secondarie.

-Le cellule neoplastiche muoiono in seguito a deficienza metabolica o per azione degli elementi

immunocompetenti presenti nel linfonodo.

-Le cellule neoplastiche sopravvivono nel linfonodo ma in uno stato di latenza, non generando dunque

metastasi secondarie.

Il superamento della capsula linfonodale può essere ricollegata alle dimensioni della massa di cellule

neoplastiche che si forma al suo interno (se supera i 5 cm si ha rottura capsulare con estrinsecazione delle

cellule tumorali), ma anche a procedimenti diagnostici (linfoangiografia) o terapeutici (irradazione locale,

trattamento con steroidi). Studi recenti hanno dimostrato che le cellule tumorali possono determinare

soppressione immunitaria a livello di linfonodi regionali.

Diffusione per via celomatica:è un genere di diffusione che avviene a livello delle cavità sierose

dell’organismo, dette anche cavità celomatiche, ovvero pleura, peritoneo e, sebbene sia rara la forma di

tumore al cuore, pericardio. Questo tipo di diffusione si realizza dal momento in cui le cellule neoplastiche

del tumore primitivo insorto in un organo contenuto in una cavità celomatica, durante il loro sviluppo,

aderiscono alla superficie della sierosa liberando enzimi attivatori del plasminogeno. Da qui, mediante una

piccola cascata enzimatica, il fibrinogeno viene trasformato in fibrina le cui maglie ritengono le cellule

neoplastiche. A livello della pleura, ad esempio, a diffondere sono per lo più le cellule tumorali provenienti

da tumori polmonari, sebbene a volte provengano da tumori mammari od esofagei e possono diffondere

anche al pericardio.

Diffusione per continuità: (il prof dice che le cellule “sgocciolano” puah!!) in questo caso la metastasi si

sviluppa sulla superficie di un organo anatomicamente limitrofo alla sede del tumore primitivo. Sono

esempi la diffusione al fegato di cellule tumorali provenienti dalla testa del pancreas o dal rene destro; la

diffusione delle cellule neoplastiche dal labbro a quello sotto o soprastante; la diffusione del tumore dalla

gengiva alla guancia a contatto con essa; la diffusione “per innesto o iatrogena”, che ha luogo nel caso in

cui, durante un intervento chirurgico, si verifichi l’accidentale trasporto di cellule neoplastiche a livello delle

cicatrici chirurgiche od in organi coinvolti nell’atto chirurgico.

Diffusione per via canalicolare: si verifica in caso di tumori ghiandolari, in quanto le cellule tumorali si

diffondono attraverso il dotto escretore della ghiandola in cui il tumore è insorto, per poi raggiungere

l’organo in cui il dotto sbocca. Un esempio è l’adenocarcinoma della pelvi renale che mediante l’uretere

può diffondere alla vescica.

Diffusione per via subaracnoidea: in caso di tumori maligni primitivi cerebrali che tuttavia, tranne rare

eccezioni, non diffondono mi al di fuori del sistema nervoso.

Il processo di diffusione metastatica:

Come visto prima, le metastasi rappresentano la formazione di nuovi tumori in altre sedi come

conseguenza della disseminazione di un cancro da una sede primaria.

La diffusione del tumore può essere divisa in due fasi principali, che ne costituiscono la così detta “cascata

metastatica”:

1. Invasione della matrice extra-cellulare: comprende il distacco delle cellule tumorali dal tumore

primario, il legame con la matrice circostante, la degradazione della matrice extracellulare grazie

alla presenza di enzimi proteolitici prodotti dalle stesse cellule neoplastiche e la migrazione delle

cellule tumorali. Quelli appena elencati sono elementi alla base della capacità invasiva delle cellule

tumorali.

2. La cascata metastatica continua poi con l’invasione dei vasi ematici e linfatici, il trasporto delle

cellule tumorali come emboli tumorali a siti distanti, l’adesività all’endotelio del letto vascolare di

organi o tessuti distanti, la migrazione dai vasi in cui gli emboli si arrestano, la sopravvivenza nel

nuovo sito e la moltiplicazione e crescita localizzata per formare tumori secondari.

Invasione della matrice extra-cellulare:

Perdita delle giunzioni intracellulari:

Alla base del processo metastatico c’è il distacco delle cellule dal tumore primario, in seguito alla perdita di

coesività ed il legame con la matrice circostante. Le proteine coinvolte nell’adesione cellula -cellula sono:

Le Caderine: glicoproteine trans-membrana calcio-dipendenti, coinvolte in adesioni di natura

o omofilica, ovvero solo con altre caderine . La parte extracellulare di queste molecole è responsabile

dell’interazione omotipica con le cellule vicine mentre il dominio citoplasmatico prende rapporto

con il citoscheletro attraverso l'interazione con un complesso di β-catenina ,γ-catenina o

plakoglobina, α-catenina e vinculina. Quando non legato al dominio citoplasmatico della caderina,

la β-catenina assume funzioni non strutturali: può infatti legare un fattore trascrizionale (LEF-1) e,

associata a tale fattore, migrare nel nucleo dove regola l’espressione genica (la formazione di

legami tra cellule dunque inibisce l’associazione della beta-catenina con il fattore trascrizionale).

Tra le Caderine, una di nota importanza nel processo di diffusione tumorale è la E-Caderina, una

molecola che media l’adesione cellula-cellula in sede epiteliale, dotata di un dominio extracellulare ed

uno citoplasmatico che, tra le numerose funzioni, mediano la trasduzione del segnale, la trascrizione

del gene stesso ed il controllo locale del citoscheletro di actina. La sua perdita o sregolazione gioca un

ruolo importante nella invasione tumorale e formazione di metastasi. Tale sregolazione ha luogo in

seguito alla fosforilazione della porzione intracellulare della caderina, probabilmente ad opera di

proteine codificate dagli oncogèni attivati. Tale fenomeno provoca la dissociazione con le molecole di

catenine, inibendo di conseguenza l’adesione con le cellule circostanti nonché i fenomeni di

trasduzione del segnale. L’E-caderina funziona dunque da gene oncosoppressore in quanto previene la

migrazione delle cellule tumorali nei tessuti circostanti e la generazione di metastasi.

In seguito le cellule tumorali si attaccano alla membrana basale tramite recettori, di cui aumenta

l’espressione, specifici per proteine della matrice extracellulare (laminina, fibronectina....). Tali recettori

sono le: Integrine: glicoproteine transmembrana che si presentano come dimeri costituiti da due sub-unità

o alfa e beta, entrambe monopasso ed in grado di legare differenti proteine della matrice extra-

cellulare (ECM), a seconda della loro specifica conformazione. Il dominio citoplasmatico si lega

invece al citoscheletro.

Un esempio di integrine coinvolte nel processo metastatico sono le glicoproteine CEA (Antigene Carcino

Embrionario) prodotte principalmente dalle cellule fetali del tratto digerente, del fegato e del pancreas,

durante i primi due trimestri di gestazione, mentre dopo la nascita è molto ridotta. Nell'adulto, piccolissime

quantità di CEA vengono secrete dalle cellule del colon, dal parenchima polmonare e dal tessuto mammario

durante la lattazione. Il suo tasso ematico, particolarmente ridotto, aumenta in numerose condizioni sia

neoplastiche che non. La loro porzione extra-cellulare è costituita da subunità legate da ponti disolfuro e

presenta una parziale omologia con i domini variabili e costanti delle immunoglobuline , mentre la parte

intracellulare non interagisce direttamente con il citoscheletro. Nelle cellule trasformate sono secrete

proteasi in grado di tagliare tali legami, facendo venire a meno i meccanismi di controllo proliferativo che si

innescano solo nelle giuste condizioni di contatto con le cellule circostanti: viene a meno il fenomeno di

inibizione da contatto.

NB: Le prime caratteristiche che ritroviamo in una cellula tumorale sono la capacità di crescere in maniera

indipendente dall’ancoraggio e la capacità di non risentire più dell’inibizione da contatto: infatti le

integrine, ad esempio, non hanno un ruolo cruciale solo nell’adesione, ma anche nella regolazione del

differenziamento e proliferazione cellulare.

Per quanto riguarda la regolazione della proliferazione cellulare, le integrine sono capaci di attivare

o nel citoplasma una cascata di eventi che coinvolgono le chinasi MAP (Mitogen Activated Protein

kinases) che inducono, nel nucleo, la trascrizione dei geni codificanti per le cicline D ed A,

necessarie per la transizione G -S del ciclo cellulare. Affinchè, nelle cellule normali, venga attivato

1

tale processo è tuttavia necessaria l’azione combinata di fattori di crescita e dell’adesione delle

cellule alla ECM: la presenza di fattori di crescita in assenza di adesione cellulare non provoca né la

sintesi di cicline né la proliferazione cellulare. Tale meccanismo di controllo fa si che la cellula

risponda agli stimoli proliferativi solo quando si trova nel corretto contesto cellulare. Nella massa

tumorale, tuttavia, le cellule sono in grado di proliferare anche in assenza di adesione ad una cellula

extracellulare (crescita indipendente da ancoraggio), fenomeno che permette alla cellula di

proliferare anche in tessuti differenti da quelli di origine formando le metastasi. La proliferazione

può avvenire in seguito a mutazioni geniche dominanti che portano alla attivazione costitutiva dei

recettori di fattori di crescita o delle proteine citoplasmatiche che permettono di trasmettere il

segnale mitogenico all’interno della cellula (attivazione MAP e sintesi cicline).

Non è solo il legame cellula-ECM ad inibire la proliferazione cellulare quando non necessaria, ma

o anche il legame con le cellule adiacenti (fenomeno della Inibizione da contatto): la proliferazione

incontrollata nonostante l’adesione cellularecon le cellule circostanti , fenomeno tipico del

processo cancerogeno, provoca la perdita della inibizione da contatto.

Degradazione della matrice extra-cellulare e migrazione:

La modificazione proteolitica della matrice extra-cellulare è un processo alla base della diffusione

metastatica tumorale, in quanto permette il passaggio delle cellule neoplastiche al suo interno. L’invasione

della cellula tumorale nella ECM in seguito a degradazione della membrana basale ed il movimento della

stessa è dovuta alla produzione di agenti chemiotattici ed alla presenza di enzimi che degradano l’ECM in

presenza di un tumore, che sono:

Le metalloproteinasi della matrice (MMP): famiglia di proteasi secrete come zimogeno non attivo

o (pro-MMP) ( richiedono attivazione cellulare) o localizzate sulla membrana plasmatica (MT-MMP).

In base al substrato ai quali si legano sono classificabili in collagenasi interstriziale, stromelisine e

gelatinasi (MMP2 ed MMP3, le più studiate in assoluto). La maggior parte di tali enzimi sono secreti

dalle cellule stromali, sebbene tale secrezione venga regolata sia dalle cellule tumorali, col rilascio

di citochine e fattori di crescita, sia dalla matrice cellulare stessa. Gli inibitori tissutali delle

metalloproteasi (TIMP), formano un complesso con le MMP inibendone l’attività.

Le ADAM-lisine: anch’esse delle metalloproteasi.

o Serin-proteasi come l’attivatore del plasminogeno e la plasmina.

o Eparanase

o

I principali substrati della ECM nei confronti dei quali agiscono tali enzimi sono collagene I e III, presenti

nello stroma; il collagene IV e V, presenti principalmente nella membrana basale (Vedi immagine);

Laminina; Fibronettina; Vitronettina. Il movimento di tali cellule nella matrice extracellulare si verifica

grazie a fattori di motilità autocrini secreti dalle cellule stesse od a fattori esogeni paracrini solubili

(chemiotattici) od insolubili (aptotattici).

NB: Le cellule neoplastiche, come detto prima, possono secernere fattori autocrini della motilità che,

legandosi ai recettori superficiali delle cellule stesse, ne stimolano la motilità sia casuale che guidata. Il

fattore sarebbe trasportato verso la periferia dal flusso di liquido interstiziale presente all’interno del

tumore , che induce dunque facilmente alla invasività.

All’interno della massa tumorale infatti vi è una specifica dinamica nel movimento dei liquidi: assumendo

che la pressione interstiziale diminuisca dal centro del tumore alla periferia, si verrebbero a formare due

moti, uno convettivo radiale verso l’esterno ed uno diffusivo radiale verso l’interno, che si oppone a quello

convettivo. La cellula tumorale che si stacca dalla massa primaria segue il flusso di convezione e diffonde

verso l’esterno, proprio come i fattori autocrini di motilità (AMF) in grado di guidare secondo la direzione

della convezione radiale, quella dell’invasione tumorale. E’ a causa di tale convezione che i farmaci, essendo

spinti fuori dalla massa tumorale, non sono in grado di agire direttamente su di essa

Disseminazione vascolare ed impianto delle cellule tumorali:

Le cellule neoplastiche così distaccatesi dal tumore primitivo sono in grado di entrare nel circolo ematico

attraverso i vasi neo-formatisi con l’angiogenesi tumorale, grazie alla morfologia di questi ultimi

caratterizzati da un endotelio povero di giunzioni intercellulari quindi molto permeabile. L’ingresso è inoltre

facilitato dalla presenza dei numerosi enzimi in grado di lisare la membrana basale periendoteliale. Una

volta entrate in un vaso, le cellule neoplastiche circolano sotto forma di aggregati omotipici od eterotipici

(emboli) e si arrestano a livello dei capillari dove permeano e si riversano nei tessuti extravascolari, dando

origine a tessuti metastatici.

Nel Circolo sanguigno le cellule tumorali devono essere in grado di sopravvivere ai continui attacchi del

sistema immunitario, in primis di linfociti e macrofagi. La sopravvivenza di tali cellule è dovuta proprio alla

loro organizzazione in mirco- emboli ovvero in gruppo, in modo tale che ad essere più esposte sono le

cellule più esterne, mentre quelle all’interno dell’embolo sono in grado di viaggiare illese, in quanto sono

nascosti gli antigeni che permetterebbero l’interazione con le cellule dell’immunità innata. Un ulteriore

schermo nei confronti di tale immunità è rappresentata dalle piastrine che circondano l’embolo tumorale

durante il suo passaggio nel circolo ematico.

Di tutte queste cellule, solo lo 0,01% è in grado di sopravvivere nel circolo ematico e di dare origine a

focolai metastatici: se la cellula tumorale è stata in grado di sopravvivere nel vaso, circola nel sangue fino a

che non si ferma in un determinato distretto vascolare dove avverrà:

L’adesione delle cellule all’endotelio vasale: al fine di tale adesione sono di fondamentale

o importanza sono:

-Le molecole di adesione cellulare (cell adhesion molecules – CAMs):che comprendono la famiglia I-

CAM ed N-CAM (integrine). Sono recettori glicoproteici che prende parte attiva nella costituzione

delle strutture adesive della superficie cellulare. Ci sono diverse famiglie di CAM, tutte costituite da

glicoproteine integrali che si estendono nella membrana plasmatica, con domini che protrudono da

entrambi i versanti della membrana stessa. Le CAM che si legano possono essere dello stesso tipo

(legame omotipico) o di tipi diversi (legame eterotipico).

-Le lectine di superficie cellulare e glicoproteine che si legano alle lectine espresse dalle cellule. Il

dominio lectinico si trova all’interno delle Selectine (o Selettine) , ovvero glicoproteine di

membrana che presentano un singolo dominio di tipo C-lectina (L) alla loro estremità

aminoterminale, seguito da un dominio di tipo Epidermal Growth Factor (EGF), diversi domini

regolatori del complemento (C), domini transmembrana e una corta coda citoplasmatica.

Di questa glicoproteina sono state individuate tre principali isoforme coinvolte nella adesione vasle

delle cellule tumorali: La E-selectina, adesa alle cellule endoteliali dei vasi sanguigni; L-selectina,

espressa da quasi tutti i leucociti; P-selectina, individuate nelle piastrine attivate sebbene la sua

espressione può anche essere indotta nell’endotelio vascolare attivato. Questa ultima isoforma

viene pre-immagazzinata in granuli citoplasmatici sotto forma di proteine transmembrana pre-

formata, e per poi venire traslocata sulla superficie cellulare dopo stimolazione. L’adesione

cellulare mediata dalle selectine è basata sul riconoscimento di carboidrati da parte della lectina

Calcio-dipendente.

Diapedesi: Dopo l’adesione cellulare all’endotelio vasale, la cellula tumorale estende gli

o pseudopodi all’interno delle giunzioni intercellulari dell’endotelio od induce una retrazione delle

cellule endoteliali. Questi due fenomeni hanno come risultato finale l’accesso da parte delle cellule

tumorali, della membrana basale adiacente all’endotelio che presenta capacità adesive maggiori

rispetto alle molecole presenti a livello delle cellule endoteliali. Per questo motivo traumi e

fenomeni flogistici, che inducono all’esposizione della membrana basale, facilitano l’adesione delle

cellule tumorali. NB tale legame è mediato da recettori posti sulla membrana plasmatica delle

cellule tumorali, in particolare quelle facenti parte della famiglia delle integrine.

Digestione della membrana basale: Processo che si verifica grazie alla secrezione di enzimi

o proteolitici prodotti dalle cellule tumorali stesse , tra cui le metalliproteasi (MMP), catepsina D ed

attivatore del plasminogeno che, idrolizzando le strutture stromali, aprono un varco necessario

affinchè si verifichi il passaggio delle cellule tumorali nel tessuto ectopico (nuovo tessuto al di fuori

del sito primario), dove si verificherà l’evoluzione proliferativa di una minoranza delle cellule

migrate, che spesso rimangono isolate. E’ proprio tale evento proliferativo a determinare

l’evoluzione metastatica del tumore in quanto laddove le cellule non siano in grado di sopravvivere

in tessuti ectopici dal sito primario, muoiono (-> esempio le cellule renali muoiono a livello epatico

-> non si verifica un processo metastatico in tale distretto tissutale).

Del ridotto numero di cellule migrate che vanno incontro a proliferazione cellulare, solo alcune sono in

grado di mantenere tale stato proliferativo, in quanto una quota notevole va incontro ad apoptosi o ad uno

stato di quiescenza. La loro proliferazione avviene in risposta a fattori di crescita paracrini che possono

essere espressi in maniera diversa nei vari organi, ovvero per esempio EGF (Epidermal Growth Factor); IGF

(Insulin-Like-Growth Factor); TGF-beta (Trasforming growth factor- beta)…. Dal momento in cui tali fattori

sono in grado di diffondersi all’interno della massa tumorale, anche le cellule quiescenti riprendono la

divisione (per tale motivo spesso tumori diagnosticati molto tempo prima possono avere uno sviluppo

metastatico anche 20 anni dopo la diagnosi. Il loro “risveglio” può essere dovuto a svariati fattori come i

fattori di crescita od ormonali).. Tale diffusione può tuttavia verificarsi dal momento in cui la

micrometastasi subisce un fenomeno di neo-vascolarizzazione, generalmente poco frequente nelle masse

metastatiche, in quanto in seguito a ciò si verifica una drastica riduzione dell’apoptosi rispetto alla

proliferazione che procede invariata, permettendo l’espansione della popolazione neoplastica e di quella

endoteliale associata ed il raggiungimento di un livello dimensionale Clinicamente significativo. In assenza

di fenomeni agiogenetici associati alla proliferazione delle cellule metastatiche, infatti, si verifica

generalmente un blocco dell’accrescimento della massa una volta raggiunto il limite dimensionale di

qualche centinaio di micron. Inoltre, sempre in queste condizioni, si verifica un equilibrio dinamico in cui

proliferazione e morte cellulare per apoptosi sono equivalenti (condizione di “quiescenza clinica”).

Conclusioni:

Nell’immagine a sinistra è rappresentato il numero minimo di duplicazioni cellulari che si possono avere

prima che una massa tumorale diventi rilevabile clinicamente. Il riquadro a destra rappresenta invece

l’eterogenicità delle cellule che compongono una neoplasia e l’evoluzione clonale delle cellule tumorali. Dai

discendenti della cellula normale trasformata si generano nuovi sotto- cloni e, con la progressiva crescita, la

massa tumorale si arricchisce di quelle varianti più adatte ad eludere le difese dell’ospite e pertanto, con

ogni probabilità, le più aggressive. (dice il prof che quindi la capacità metastatica di una cellula tumorale è

acquisita con l’accumulo di una serie di mutazioni genetiche che ne permettono la sopravvivenza nel

tessuto ectopico. Darà metastasi la cellula trasformata che ha avuto maggiore “vantaggio selettivo alla

crescita”.)

La presenza di un fenotipo metastatico in grado di attribuire alla cellula tumorale il vantaggio selettivo alla

crescita, fu scoperto in seguito ad esperimenti effettuati su topi mediante l’iniezione in diverse cavie di

tumori maligni a livello della schiena. Una coltura di cellule tumorali iniettate direttamente per via

endovenosa in differenti topi dava scarse metastasi polmonari, mentre una seconda coltura iniettata in

seguito a clonazione della stessa generavano un elevato numero di metastasi, in quanto le cellule con

quello che venne chiamato “fenotipo metastatico” assunsero in questi topi un vantaggio nella crescita.

NB: metastasi a livello cardiaco non ci sono: il tessuto cardiaco non è terreno adatto x proliferazione

cellulare delle metastasi: la cellula metastatica non trova in quel tessuto fattori di crescita necessari per la

proliferazione. Similmente anche nel muscolo scheletrico per lo stesso motivo.

I tessuti meno sede di metastasi sono: cuore, muscoli scheletrici, cartilagini: tessuti più sede di metastasi

sono polmoni, fegato, linfonodi e reni.

TUMORI ED ORMONI:

La correlazione tra tumori ed ormoni fu scoperta in seguito all’osservazione epidemiologica dell’incidenza

notevole di neoplasie maligne e benigne in alcune ghiandole endocrine od in organi che sono diretto

bersagli di queste ultime, principalmente mammella, prostata, endometrio e collo dell’utero. Il cancro alla

mammella è infatti correlato a fattori che implicano una maggiore esposizione agli ormoni estrogenici

(nulliparità, menarca precoce, menopausa tardiva, utilizzo di terapie sostitutive…); il cancro alla prostata

dipende dalla presenza di testosterone, non si manifesta infatti in eunuchi né in pazienti cirrotici (dove il

testosterone è metabolizzato in altri ormoni); Il cancro all’endometrio è spesso associato invece a diabete,

obesità, nulliparità, che espone ad una maggiore stimolazione estrogenica.

-Quando il tumore colpisce cellule secernenti ormoni di ghiandole endocrine, le cellule neoplastiche

possono continuare a produrre ormoni, in via del tutto autonoma, in quanto sono incapaci di rispondere ai

meccanismi omeostatici che fisiologicamente controllano la sintesi e rilascio di ormoni. Tale capacità

ormonosintetica dipende tuttavia dal grado di differenziazione delle cellule tumorali. In tumori anaplastici,

infatti, la sintesi risulta ridotta od assente, mentre in quelle differenziate (per lo più adenomi)tale sintesi

risulta più accentuata, in quanto un numero maggiore di cellule tumorali presentano tale attività.

Terminologia: I tumori possono essere classificati in:

-Ormonodipendenti: tumori la cui proliferazione è condizionata dagli ormoni. Originano nei tessuti

endocrini e in quelli bersaglio. Ad esempio il tumore alla prostata cresce dipendendo, all’inizio, dall’azione

del testosterone.

-Ormonosensibili: Tumori che rispondono in senso proliferativo a stimoli endocrini che non sono necessari

per il mantenimento della loro crescita: i tumori ormonodipendenti in genere sono ormonosensibili ma il

contrario non è sempre vero.

-Ormoniresponsivi: tumori che rispondono favorevolmente alla terapia ormonale. La maggior parte dei

tumori ormonodipendenti sono ormonosensibili.

Il ruolo cancerogeno assunto dagli ormoni, e nello specifico da gonadotropine ipofisiarie, fu studiato

mediante esprimenti su topi e ratti di laboratorio. I modelli utilizzati furono il carcinoma ovarico del ratto, il

carcinoma della tiroide nel topo ed il carcinoma mammario del topo (MMTV).

Carcinoma ovarico del ratto: esperimento effettuato in animali sottoposti ad ovariectomia

o bilaterale, in cui un solo ovaio veniva trapiantato nella milza o nel pancreas, in modo tale che gli

estrogeni da esso sintetizzati venissero versati in vene tributarie della vena porta e veicolati

direttamente al fegato, a livello del quale tali ormoni vengono per lo più inattivati.

Con la riduzione di tali ormoni circolanti, veniva inibito il processo di feed-back negativo a livello

dell’asse ipotalamo-ipofisi, fenomeno che provocava dunque la continua immissione, da parte

dell’adenoipofisi, nel circolo ematico di gonadotropine non più regolate dal feedback. Interagendo

con i loro specifici recettori tali gonadotropine determinavano nell’ovaio in sede ectopica una

stimolazione continua di sintesi estrogenica, con conseguente comparsa di iperplasia di cellule della

granulosa e la conseguente insorgenza di un tumore. L’importanza delle gonadotropine

nell’insorgenza del tumore ovarico fu confermata dalla mancata insorgenza del tumore in presenza

di una ipofisectomia o della creazione di una anastomosi vena porta-vena cava, che permetteva la

reimmissione in circolo delle gonadotropine e conseguente innesco di un meccanismo feedback.

NB: L’Ipofisectomia eseguita quando nell’ovaio incominciava a comparire una condizione di iperplasia,

preveniva la comparsa del tumore ma era del tutto inefficace nel permettere la regressione del tumore se

eseguita dopo la sua comparsa. Si comprese dunque la presenza di una fase ormonodipendente, all’inizio

dell’insorgenza del tumore ed una ormonoindipendente all’avanzare della progressione tumorale.

Carcinoma della tiroide nel topo: In condizioni normali l’ipofisi secerne l’ormone TSH (tireotropo)

o che, giunto per via ematica alla tiroide, la stimola nella produzione di ormoni tiroidei (T3,T4). Sono

proprio tali ormoni che, se presenti nel sangue in quantità adeguate, esercitano a livello

dell’ipotalamo un effetto inibitorio con conseguente riduzione della sintesi dell’ormone TRH

(Thyrotropin Releasing Hormone), fattore mitogeno per le cellule tireotrope dell’adenoipofisi.

Se tuttavia l’animale subisce una tiroidectomia si verifica lo sviluppo di un adenoma adenoipofisario

secernente TSH, dovuta alla mancata inibizione da parte degli ormoni tiroidei della produzione

ipotalamica di TRH. La continua stimolazione ipofisiaria da parte di TRH induce tale ghiandola a

produrre una grande quantità di TSH , con conseguente iperplasia e successiva insorgenza del

tumore.

Se inoltre la tiroide non viene asportata ma subisce una ipofunzione, ad esempio in seguito a

carenza di iodio, il ridotto rilascio nel circolo ematico di ormoni tiroidei stimola un incremento del

rilascio di TRH a livello ipotalamico che provoca nell’adenoipofisi un tireotropinoma secernente. Il

TSH secreto in grandi quantità da tale tireotropinoma stimola una produzione eccessiva di ormoni

della tiroide, nei quali compaiono adenocarcinomi rapidamente metastatizzanti. Nonostante un

primo periodo in cui il tumore tiroideo si manifesta in maniera correlata alla quantità di TSH

secreto, in un secondo momento tale tumore assume una ormonoindipendenza, continuando a

proliferare anche dal momento in cui si riducono i livelli di TSH. Per questo motivo la terapia anti-

ormonale ha un effetto positivo all’inizio della terapia, mentre perde di efficacia quando il tumore

diviene indipendente dagli ormoni.

Carcinoma mammario del topo (MMTV): permise lo studio della cancerogenesi virale e del ruolo

o promuovente di alcuni ormoni nella comparsa del tumore. Un retrovirus, detto Virus di Bittner o

anche MMTV (Murine Mammary Tumor Virus), acquisito con l’allattamento o come DNA provirale

nella linea germinale, è l’agente necessario, ma non sufficiente, per lo sviluppo di tumori mammari

nelle femmine, che compaiono durante la gravidanza e spesso regrediscono dopo il parto. Grazie a

studi in coltura venne dimostrato che l’espressione dell’RNA virale è facilitata dal trattamento con

glicocorticoidi, in quanto favoriscono la trascrizione in RNA delle sequenze di DNA complementari

all’RNA virale, quindi l’espressione del genoma virale nelle cellule bersaglio.

Gli ormoni possono essere distinti in ormoni non steroidei e steroidei:

-Ormoni non steroidei: ormoni di natura peptidica, proteica od aminoacidica solubili in acqua che, una volta

trasportati nel flusso ematico, vengono a contatto con la cellula bersaglio mediante specifici recettori

generando al suo interno secondi messaggeri (calcio, IP , AMP ciclico…) in grado di attivare altre sostanze

3

chimiche intracellulari per ottenere una risposta dalla cellula bersaglio.

-Ormoni steroidei: Ormoni di natura lipidica che derivano da un precursore comune, il colesterolo.

Attraversano la membrana cellulare ed, una volta entrati nella cellula, si legano ai recettori della membrana

nucleare generando un complesso ormone-recettore attivato. Il complesso attivato entra nel nucleo, si lega

al DNA ed attiva geni specifici per la biosintesi si RNA messaggero, con conseguente incremento della

sintesi proteica.

Immagine: sono rappresentati i pathway molecolari del Testosterone ed Estradiolo nelle cellule bersaglio.

Mentre l’estradiolo agisce direttamente a livello nucleare, il Testosterone necessita di una preventiva

riduzione a Diidrotestosterone che, una volta legatosi allo specifico recettore intracellulare, entra nel

nucleo dove esplicherà la propria funzione di promotore della trascrizione. Il diidrotestsosterone si lega al

recettore nucleare ARE (androgen receptor element), mentre l’estradiolo al recettore ERE (estrogen

receptor element). (Pag 768)

In generale tra gli ormoni steroidei sono annoverabili: gli Androgeni (Testosterone) sintetizzati dalle cellule

di Leydig, Estrogeni (Estradiolo) sintetizzati dalle cellule parafollicolari dell’ovaio, i Progestinici

(Progesterone) sintetizzati dal corpo luteo, Glicocorticoidi (idrocortisone) e Mineralcorticoidi

(aldosterone)sintetizzati dal surrene.

NB. Nella sintesi di ormoni steroidei sono coinvolti i Citocromi P450, che come visto in precedenza

provocano un accumulo di specie reattive dell’ossigeno in grado di reagire con i lipidi di membrana, gli acidi

nucleici, le proteine e gli enzimi determinando un danno cellulare che contribuisce significativamente

all’insorgenza di numerosi quadri patologici di tipo degenerativo quali le neoplasie maligne.

Circa il 25% dei tumori maligni origina in tessuti nei quali lo sviluppo e la funzione sono fortemente

dipendenti dagli ormoni steroidei, la cu sintesi avviene a livello del surrene, testicoli e ovaio.

Estrogeni come fattori cancerogeni:

Il ruolo degli ormoni nella cancerogenesi fu rilevato in seguito a numerosi esperimenti in vitro che

permisero di attribuirgli un ruolo promuovente, in quanto stimolano la proliferazione cellulare, ma non

iniziante, data l’assenza della capacità mutagena degli ormoni.

Estrogeni come inizianti: La certezza del ruolo esclusivamente promovente degli ormoni, incominciò a

venire meno in seguito a studi effettuati sugli estrogeni. Fu infatti scoperto che tali ormoni fossero in grado

di attivare enzimi del sistema microsomiale, predisposto alla attivazione di cancerogeni, e che venissero a

loro volta convertiti da enzimi microsomiali in composti che per ossidazione davano origine a derivati in

grado di generare addotti col DNA (danno diretto), perossidazione lipidica e possibili danni ossidativi nei

confronti degli acidi nucleici (danno indiretto).

La trasformazione dell’Estradiolo in chinone è un processo di iniziazione che espone le cellule ad un elevato

gli o-chinoni sono molecole caratterizzate da un’estrema reattività

rischio cancerogeno in quanto

elettrofila e possono risultare citotossiche in quanto in grado di reagire con le funzionalità

nucleofile delle macromolecole (come appunto, gli acidi nucleici).

Estrogeni come promoventi: Solo in un secondo momento fu scoperta la capacità degli estrogeni di

promuovere la proliferazione cellulare, favorendo l’espressione genica di fattori di crescita come EGF,TGF-

alfa; PDGF e IGF e di reprimere il gene che codifica per TGF-beta, che esercita attività inibitoria sulla

proliferazione cellulare.

E’probabilmente per l’azione coordinata iniziante e promovente degli estrogeni che il tumore alla

mammella risulta essere il più diffuso.

Riguardo all’azione cancerogena degli estrogeni è stato postulato un paradigma che, con le nuove scoperte,

ha subito alcune modifiche: Il Paradigma standard ,enunciato nel 2000, afferma che gli estrogeni e forse il

progesterone influenzano la frequenza di divisione cellulare e quindi manifestano i loro effetti sul rischio di

insorgenza del cancro al seno causandone la proliferazione delle cellule epiteliali. Tali cellule proliferanti

sono tuttavia ampiamente suscettibili di errori genetici durante la replicazione del DNA che, se non corretti,

possono indurre all’insorgenza del fenotipo maligno. Nel Paradigma modificato, invece, oltre ad essere

confermato l’ormai indubbio ruolo degli estrogeni nella promozione del processo cancerogenico, fu

affermato il ruolo nell’iniziazione cellulare di numerosi elementi coinvolti nel metabolismo estrogenico in

grado di provocare danni diretti (formazione di addotto estrogeno- chinone col DNA) od indiretti (Danno

ossidativo al DNA-> ROS) al DNA cellulare.

Recettori per gli estrogeni (ER):

Col progredire delle scoperte, gli studiosi incominciarono a volgere il proprio interesse verso il ruolo dei

recettori per gli ormoni steroidei, in particolare degli estrogeni ed androgeni, nella tumorogenesi. Gli effetti

degli ormoni steroidei a livello cellulare infatti dipendono dai loro specifici recettori citoplasmatici che

agiscono da fattori trascrizionali da soli od in associazione con altri. In particolare i recettori per gli

estrogeni definiti ER (estrogen receptor, divisibili in ER-alfa ed ER-beta) spesso espressi insieme ai recettori

per il progesterone definiti PR (Progesteron Receptor), assumono nelle cellule neoplastiche un ruolo

importante al fine della trasduzione di segnali proliferativi. E’ infatti accertato che i tumori che esprimono

+ + + -

contemporaneamente ER e PR (ER e PR ) sono, insieme alle cellule ER PR , quelli che meglio rispondono

alla terapia con antiestrogeni, che tuttavia agiscono solo nei confronti di ER. Solo di rado i tumori risultano

- +

essere ER e PR . +

Al fine del trattamento dei carcinomi mammari ER , fu molto importante la scoperta di anti-estrogeni

(Tamoxifene e ICI 182780) la cui efficacia aumentava all’aumentare dei recettori ER, in quanto in grado,

legandosi a questi ultimi, di inibire gli effetti degli ormoni estrogeni. Normalmente il legame dell’ormone

estrogeno col proprio recettore ER ne induce un cambiamento conformazionale tale da permettere il

legame con due molecole co-attivatrici, definibili A e B, e la conseguente trascrizione di determinati geni. Il

legame di un anti-estrogeno come il Tamoxifen al recettore ER ne provoca un cambiamento

conformazionale tale da indurre sì il legame con il co-attivatore A ma anche con un co-repressore in grado

di inibire l’azione dell’ormone estrogeno a livello della ghiandola mammaria ma paradossalmente di

incrementarne l’azione a livello dell’utero. Un ulteriore anti-estrogeno invece, il Raloxifene, legandosi al

recettore ER e modificandone la conformazione, lo rende in grado di legare solo il co-repressore, inibendo

l’azione dell’estrogeno sia a livello uterino che della ghiandola mammaria.

In un secondo momento fu tuttavia scoperto che, in presenza di trattamenti a lunga durata, l’attività

antitumorale espletata dagli anti-estrogeni veniva a meno. La comparsa di resistenza al Tamoxifen

coinvolge numerosi eventi, tra i quali:

-Silenziamento di geni codificanti per gli ER, in seguito a fenomeni di ipermetilazione del DNA

-Mutazione dei geni codificanti per gli ER con codificazione di recettori strutturalmente alterati e non

funzionanti, fenomeno molto più frequente nelle cellule metastatiche più che in quelle facenti parte del

tumore primitivo. Tali mutazioni inoltre si manifestavano maggiormente nei tumori mammari e prostatici.

-Mutazioni genetiche che rendono la cellula indipendente dall’effetto ormonale.

Immagine: L’ormonodipendenza e l’ormonesensibilità sono legati alla presenza del recettore a livello

cellulare poiché, se non è presente il recettore per quell’ormone, l’azione dell’ormone stesso è nullo.

Allo stesso tempo i tumori che presentano numerosi recettori per quell’ormone, sono quelli che

rispondono positivamente al trattamento anti-ormonale. Normalmente in donne mature, aventi già avuto

una gravidanza, vi è una presenza di recettori solo sul 7-17% delle cellule. Se il tessuto ghiandolare

mammario subisce la formazione di displasie, la percentuale di recettori aumenta fino al 60-80%,

percentuale destinata a salire in presenza di carcinomi in situ ed invasivi. Nelle numerose tappe di

trasformazione cellulare, fino allo stadio di carcinoma in situ, la sensibilità cellulare all’azione ormonale

aumenta nettamente, fino a che le cellule tumorali non si trasformano in metastatiche. In quest’ultima fase

infatti la sensibilità ormonale diminuisce con conseguente perdita di utilità della terapia anti-ormonale.

L’utilità clinica di cellule ormono dipendente sta nel fatto che in tumori costituiti da tali cellule, diminuendo

la presenza dell’ormone, si verifica una iniziale regressione della massa tumorale. Tuttavia a livello

microscopico alcune cellule sono sopravvissute, aumentando il rischio di una possibile recidività, a meno

che esse non vadano autonomamente incontro ad apoptosi.

Nell’Immagine sono indicati i possibili effetti di una terapia ormonale. Dopo il blocco dell’attività

dell’ormone steroideo, in cellule omono-dipendenti la crescita tumorale si stabilizzerà o regredirà. La

presenza di anche solo una cellula tumorale non asportata può provocare, col passare del tempo, la crescita

di una nuova massa tumorale, questa volta ormono-indipendente.

Dopo un intervento di asportazione chirurgica della massa tumorale si può infatti manifestare:

-Una remissione completa:

-Una remissione parziale:

-Una remissione stazionaria

-Una sopravvivenza libera da malattia:

-Una sopravvivenza globale:

-Una ricaduta:

A seconda del risultato sarà possibile valutare l’utilità terapeutica dell’intervento.

Sindromi paraneoplastiche:

Comprendono differenti condizioni caratterizzate dall’iperproduzione e rilascio di ormoni da parte di cellule

tumorali cresciute in tessuti che, in condizioni fisiologiche, non li sintetizza. Nella Tabella sono indicati tutti

gli ormoni ectopici prodotti da masse tumorali insorte in specifiche sedi.

Clinicamente tale sindrome è diagnosticabile in base all’analisi di alcuni criteri:

1. Segni clinici e biochimici di endocrinopatia nei pazienti

2. Regressione e scomparsa dei segni clinici e biochimici della endocrinopatia dopo il trattamento

della neoplasia, che può avvenire mediante asportazione chirurgica, radioterapia o chemioterapia.

3. Ricomparsa dei segni clinici e biochimici della endocrinopatia in concomitanza con la recidiva della

neoplasia.

4. Persistenza della endocrinopatia dopo l’ablazione della ghiandola fisiologicamente deputata alla

secrezione dell’ormone.

5. Presenza di un gradiente artero-venoso dell’ormone attraverso il letto vascolare della neoplasia

(vasi neoformatisi per angiogenesi), con concentrazione più elevata nel versante venoso.

6. Presenza dell’ormone nel tessuto neoplastico in concentrazioni più elevate rispetto ai tessuti

adiacenti

7. Dimostrazione della sintesi dell’ormone da parte di cellule neoplastiche in coltura mediante l’analisi

dell’RNA che lo codifica.

(Il prof dice: ciò significa che il tumore insorto in uno specifico tessuto magari non è ancora diagnosticabile,

ma si manifesta a livello ormonale. Tutti i tumori sono teoricamente in grado di generare tali ormoni

ectopici)

La capacità di sintetizzare ormoni da parte di cellule tumorali derivati da cellule progenitrici incapaci di tale

funzione proviene probabilmente dall’alterazione dell’informazione genetica al momento della

trasformazione della cellula o della progressione neoplastica in quanto, in alcuni casi, solo alcuni cloni della

popolazione neoplastica risultano capaci della sintesi ormonale.

Tabella 15.7.

Vi sono però anche sindromi paraneolpastiche non di natura ormonale ma ad esempio neurologiche come

retinopatie, miastenia grave, encefalopatia…

Altre sindromi paraneoplastiche possono coinvolgere altri distretti anatomici (emopatie, vasculopatie,

dermopatie, miopatie….)

Metabolismo della cellula tumorale:

La valutazione corretta della deviazione metabolica di cellule tumorali avviene in relazione al metabolismo

delle cellule da cui deriva. Lo studio del metabolismo di queste cellule risulta essere importante non solo

per scopi puramente cognitivi ma anche al fine di conoscere marcatori di neoplasie o di bersagli su cui

esercitare una azione antitumorale. Profonde alterazioni nel metabolismo dei grassi, delle proteine e

carboidrati all’interno dei tessuti neoplastici sono alla base della condizione di cachessia, una sindrome che

esita nella perdita di peso e degenerazioni delle condizioni organiche.

Mitocondri e respirazione:

In condizioni normali le cellule ricavano energia dalle ossidazioni derivanti principalmente dalla respirazione

endogena (che utilizza substrati già presenti nella cellula), che risulta essere tendenzialmente più bassa nei

tessuti neoplastici rispetto a quelli normali. Nei tessuti tumorali inoltre la respirazione viene definita

massimale in quanto non in grado di superare una certa soglia di produzione energetica, nonostante il

sopraggiungere di condizioni che incrementerebbero la respirazione in un tessuto normale.

Da un punto di vista metabolico tali deficit sono attribuibili a difetti a carico di alcuni enzimi coinvolti nella

respirazione o di trasportatori di elettroni, fenomeni che possono portare da una mancata regolazione della

respirazione ad una dissociazione della fosforilazione ossidativa. E’ probabile che tali deficit siano dovuti ad

alterazioni della membrana interna od esterna del mitocondrio in seguito a variazioni della composizione

lipidica della stessa.

Glicolisi e respirazione:

Una delle principali alterazioni metaboliche che riguardano cellule tumorali avviene a livello del

metabolismo glucidico. La glicolisi aerobia (od effetto Warburg) è una via metabolica caratteristica dei

tessuti tumorali ed è stata descritta quasi un secolo fa da Warburg, il quale dimostrò che le cellule tumorali

metabolizzano il glucosio in maniera diversa rispetto alle cellule normali, probabilmente in seguito ad un

difetto della respirazione cellulare. E’ proprio il difetto della respirazione che porta le cellule neoplastiche a

far fronte alle loro esigenze energetiche mediante altri meccanismi quali appunto l’aumento della glicolisi

anaerobia, con conseguente aumento del rilascio di lattato. Una ulteriore domanda di glucosio è dovuta

dunque al fatto che le cellule neoplastiche, pur essendo munite di tutti gli enzimi per il ciclo di Krebs, non

producono ATP attraverso questa via ma scelgono preferibilmente la glicolisi anaerobia (con formazione di

lattato), che risulta tuttavia essere un processo poco efficiente dal punto di vista energetico. Sono dunque

l’alterata respirazione e la produzione di acido lattico le principali cause dell’aumento della richiesta

glicolitica ed in particolare:

- Le cellule neoplastiche sono spesso incapaci di ossidare il piruvato prodotto dalla glicolisi in seguito

all’inibizione dell’enzima piruvato deidrogenasi (PDH) da parte di PDK, a sua volta bersaglio del

fattore HIF-1. A questo segue che il piruvato derivante dall’incremento della glicolisi viene ridotto a

lattato.

- Il DNA mitocondriale (mtDNA), che codifica per diversi importanti componenti proteiche della

catena respiratoria, è soggetto ad alti tassi di mutazione, che possono generare effetti negativi sull’

efficienza della catena respiratoria forzando così le cellule alla generazione di ATP per via glicolitica.

- Sempre per una mutazione a carico del mtDNA è possibile osservare l’alterazione di importanti

proteine transmembrana mitocondriali quali quelle che permettono il trasferimento del NADH

+

all’interno della matrice mitocondriale, sotto forma di H in grado inoltre di mantenere l’equilibrio

elettrochimico. Questo fenomeno porta al conseguente accumulo di NADH a livello citoplasmatico

e riduzione, da parte di quest’ultimo, del piruvato a lattato.

Oltre all’incremento della glicolisi, nelle cellule tumorali si verificano altre alterazioni del metabolismo

glucidico che riguardano la gluconeogenesi e la sensibilità cellulare all’insulina.

-Gluconeogenesi: in pazienti con lesioni tumorali avanzate è stato riscontrato un incremento della

produzione di glucosio, dovuto alla compromissione di meccanismi in grado di controllare a livello epatico

l’omeostasi glucidica. Tale alterazione è confermata dal fatto che, mentre in pazienti normali in seguito alla

somministrazione di elevate quantità di glucosio si assiste ad una soppressione della sintesi di glucosio

endogeno del 100%, in pazienti affetti da tumore la produzione di glucosio endogeno non viene soppresso,

se non in minima percentuale. Le cause dell’incremento della gluconeogenesi epatica non sono del tutto

note sebbene ne influenzino l’alterazione la resistenza periferica all’insulina ed il netto incremento di

substrati di cui il lattato ne è il principale rappresentante. Quest’ultima molecola infatti è coinvolta nel così

detto ciclo di Cori, per cui il lattato viene prodotto dai tessuti periferici mediante glicolisi anaerobia, per poi

entrare in circolo e raggiungere il fegato, dove ha inizio la sintesi di glucosio. La produzione di glucosio

tuttavia provoca uno squilibrio energetico in quanto richiede un grande dispendio, in particolare 6 molecole

di ATP, mentre solo 2 molecole di ATP vengono prodotte dalla glicolisi anaerobia di una molecola di

glucosio. E’ proprio la deplezione di energia dovuta a questo ciclo, accompagnata al depauperamento di

proteine e lipidi corporei, a provocare la perdita di peso nel paziente cachettico.

Figura 1: Tumours produce factors such as lipid-mobilizing factor (LMF), which induces breakdown of adipose tissue into fatty

acids, and proteolysis-inducing factor (PIF), which induces protein degradation (amino acids) in skeletal muscle. Tumour necrosis

factor (TNF)-α also contributes to these processes. These are important gluconeogenic substrates that can be used in acute-

phase protein (APP) synthesis by the liver.

-Resistenza all’insulina: condizione per cui in cellule di pazienti affetti da neoplasie si ha un aumento della

resistenza cellulare, nonché insensibilità, all’insulina di natura sia esogena che endogena. Tale diminuita

sensibilità cellulare all’insulina è causata sia da fattori quali TNF ed IL-6 rilasciati da cellule tumorali ed in

grado di provocare una diminuzione della sensibilità cellulare all’insulina (con conseguente iperinsulinemia

ed iperglicemia), sia ad una diminuita sensibilità delle cellule β-pancreatiche a stimoli insulinogenici.

-Aumento dell’intake glucidico: al fine di mantenere i livelli di glucosio ematici costanti, nonostante una

diffusa insulino-resistenza, la clearance del glucosio dal sangue deve essere garantita dalla presenza di altri

trasportatori non dipendenti dall’insulina. E’ il fattore trascrizionale HIF-1 (Hypoxia inducibile factor-1), la

cui induzione è favorita dall’ipossia che si instaura nelle parti interne del tumore, meno ossigenate quindi

più dipendenti dalla glicolisi al fine della loro sopravvivenza, a stimolare a livello nucleare la trascrizione di

geni codificanti per proteine quali GLUT-1 e GLUT-3, fondamentali per il trasporto intracellulare di glucosio.

Oltre che geni codificanti per questi trasportatori, il fattore HIF-1 stimola anche la sintesi di enzimi glicolitici

quali esochinasi, aldolasi, fosfofruttochinasi, al fine di supportare l’elevata glicolisi cellulare, e per il canale

MCT4, responsabile del trasporto extracellulare del lattato.

Il maggiore uptale del glucosio viene utilizzato nelle tecniche di imaging metabolico quali RMN e PET, in cui

viene somministrato glucosio con fosforo radioattivo che ne permette la visualizzazione e dunque la

possibilità di constatare il maggior ricavo di glucosio dalle cellule tumorali rispetto a quelle normali. Unica

eccezione è il tumore renale, in quanto le cellule che compongono il nefrone non assorbono glucosio. A

questi pazienti si somministra dunque acetato, che viene raccolto dai mitocondri della cellula tumorale.

NB: Il gene oncosoppressore p53 invece inibisce la glicolisi e stimola la fosforilazione ossidativa attraverso il

gene SCO2 che attiva la sintesi del citocromoossidasi. La perdita di espressione del gene p53 e SCO2

determina una conversione dalla respirazione alla glicolisi anaerobia.

Ipossia ed acidità:

Oltre ad affermare l’importanza della glicolisi anaerobia nelle cellule tumorali, Otto Warburg scoprì che la

causa principale del cancro fosse data da uno stile di vita e soprattutto alimentare anti-fisiologico. Di fatto,

l’inattività unita ad una dieta basata su cibi acidi, danno luogo all’acidosi cellulare che, a sua volta, provoca

l’espulsione dell’ossigeno dalle cellule. E più manca ossigeno nelle cellule, più si crea un ambiente acido.

Secondo Warburg, infatti, “la mancanza di ossigeno e l’acidità sono due facce della stessa medaglia: se una

persona ha l’uno, ha anche l’altro” in quanto se è presente un eccesso di acidità, automaticamente si avrà

una carenza di ossigeno nel corpo ed, allo stesso modo, se l’ossigeno è insufficiente, si avrà acidità

nell’organismo. Sono infatti le sostanze acide a respingere l’ossigeno a differenza di quelle alcaline che

invece lo attirano. Poiché tuttavia le cellule tumorali trovano nell’ipossia condizioni ideali per la propria

sopravvivenza è proprio la condizione di acidosi e la mancanza di ossigeno ad essa legata a favorire la

crescita tumorale. Queste due condizioni strettamente legate sono inoltre collegate ad altri elementi quali:

Figura: Effetti dell'ipossia ed acidosi.

Metabolismo lipidico nella cellula tumorale:

Nella maggior parte delle condizioni di cachessia, una gran parte del peso che viene perso è dovuto alla

perdita di grassi corporei, condizione confermata da molti studi come la sottrazione di campioni di cellule

muscolari in cui è stata rilevata la presenza della metà di lipidi rispetto alle cellule normali. Le alterazioni

metaboliche a livello lipidico riguardano principalmente tre ambiti: mobilitazione dei grassi, clearance

lipidica ed ossidazione dei lipidi.

- Mobilitazione dei grassi: I trigliceridi negli adipociti, il principale deposito di grassi corporei, sono

mobilitati mediante l’idrolisi in glicerolo ed acidi grassi, poi liberati nel plasma. E’ proprio il

rilevamento di elevate quantità di glicerolo ed acidi grassi ematico in pazienti affetti da cancro ed in

condizioni di cachessia ad indicare che sia proprio questo il motivo alla base della perdita di peso di

pazienti cachettici, e non la diminuzione della sintesi lipidica. Quest’ultimo aspetto tuttavia, ovvero

la riduzione della lipogenesi nelle cellule di pazienti cachettici, ne influenza la condizione di

deperimento. La spiccata lipolisi, in assenza di una sufficiente lipogenesi, è dovuta alla produzione

da parte delle cellule cachetizzanti di fattori quali il Lipid-mobilising-factor (LMF), in grado di

stimolare, a livello delle cellule che costituiscono il tessuto adiposo, la lipolisi dei trigliceridi ed il

conseguente rilascio degli acidi grassi e glicerolo derivanti. Gli acidi grassi così rilasciati in circolo

giungono a livello del fegato dove ha inizio la gluconeogenesi con conseguente rilascio di ulteriori

quantità di glucosio a livello ematico tuttavia difficilmente utilizzabile dalle cellule in seguito a

resistenza insulinica periferica.

- Clearance lipidica: la lipoprotein lipasi è un enzima responsabile della “clearance” delle molecole di

trigliceridi dal plasma, mediante la loro idrolisi in glicerolo ed acidi grassi in grado di accumularsi a

livello del tessuto adiposo, muscolare od epatico. Sebbene l’iperlipidemia non sia un marker per la

ricerca dei tumori, essa è stata associata ad alcune tipologie di neoplasie, dato che sta ad indicare

una riduzione dell’attività di questo enzima. Poiché viene impedito l’accumulo lipidico nei tessuti

sopra detti, tale condizione incrementa la perdita di peso nei pazienti cachettici.

- Ossidazione dei lipidi: numerosi dati suggeriscono che una grande quantità di lipidi viene ossidata in

pazienti affetti da cancro, fenomeno particolarmente evidente in pazienti cachettici in rapida

perdita di peso ed in quelli che presentano numerose metastasi.

Metabolismo proteico:

La perdita di proteine in pazienti affetti da cachessia in seguito a neoplasia si manifesta clinicamente come

atrofia a livello muscolare ed ipoalbuminemia. Oltre a questi due aspetti, un aumento del catabolismo

proteico è causa dell’insorgenza di un bilancio azotato negativo, quella condizione non fisiologica in cui la

eliminazione degli aminoacidi provenienti da proteine alimentari e corporee è maggiore della quantità di

proteine introitate e la quantità di proteine catabolizzate ad aminoacidi è maggiore degli aminoacidi

trasformati in proteine. Tanto più lo stato della malattia è avanzato tanto più rapidamente procede la

perdita di proteine, nonché il bilancio azotato risulta essere più negativo.

Figura: Bilancio zero: a=c; b=d. Bilancio positivo: a>c; b>d. Bilancio Negativo: c>a; d>b.

In molti pazienti affetti da neoplasia è stato riscontrato un incremento del turnover proteico, inteso come

la somma della sintesi e degradazione proteica nei tessuti dell’individuo. Questo incremento è da attribuirsi

alle alterazioni del metabolismo proteico che avviene a livello epatico, dove si assiste ad una aumentata

sintesi, ed a livello muscolare dove l’aumentata degradazione proteica si affianca ad una sintesi proteica

immutata o solo lievemente diminuita.

NB: Tale deficit proteico provoca un peggioramento della funzione immunitaria (sia umorale che

cellulomediata), della funzionalità gastro-intestinale e della guarigione delle ferite. Clinicamente si

evidenziano, perciò, atrofia muscolare, ipoalbuminemia, peggioramento della cicatrizzazioneed infezioni

frequenti. Inoltre, la seconda via (insieme alla glicolisi anaerobia) utilizzata per soddisfare la domanda di

glucosio, è la gluconeogenesi. Questa via utilizza gli aminoacidi come substrato e perciò possiamo

evidenziare una diminuzione dei livelli plasmatici di aminoacidi gluconeogenetici (treonina, glutammina,

glicina, valina, cistina, arginina).

- Muscolo scheletrico: come detto prima, alterazioni del metabolismo proteico che si verificano a

questo livello non rispecchiano quelle che riguardano l’intero organismo. Infatti a livello della

massa tumorale si ha un incremento della sintesi proteica grazie all’aumento di ATP prodotto

durante la glicolisi ed alla acquisizione da parte delle cellule tumorali della capacità di incorporare

aminoacidi a discapito dei tessuti circostanti, divenendo così “trappole d’azoto”. E’ proprio

quest’ultimo aspetto che induce un incremento di massa proteica del tumore anche quando

l’organismo perde peso. Al contrario a livello del muscolo scheletrico non si ha un incremento della

sintesi proteica, bensì del catabolismo delle proteine. I principali fattori coinvolti in tale fenomeno

sono: PIF (proteolysis inducing factor): fattore rilasciato dalle cellule neoplastiche in seguito alla

 diminuzione degli aminoacidi ematici provocata dalla trappola d’azoto. Tale fattore è in

grado di indurre nel muscolo scheletrico degradazione proteica e rallentamento della

sintesi proteica, attivando una cascata di eventi proteolitici ubiquitino-dipendenti, alla base

dell’impoverimento proteico delle cellule muscolari.

TNFα (o “cachessina”, prodotto da macrofagi e cellule tumorali), IL-1 e IFNϒ: attivano infatti

 il fattore di trascrizione NF-kB , in grado di sopprimere l’espressione del fattore MyoD

coinvolto nella riparazione del tessuto muscolare in caso di lesioni. Il decremento

dell’espressione di tale fattore di trascrizione porta alla diminuzione della trascrizione e

sintesi della catena pesante della miosina, condizione che esita in breve tempo nella

cachessia.

IL-6: incrementa la produzione dell’ubiquitina e dell’enzima E3 ubiquitin-ligasi, che media il

 legame dell’ubiquitina al polipeptide da degradare. A questo incremento segue una

preferenziale ubiquitanzione della catena pesante della miosina, che provoca la

dissociazione della stessa dall’apparato contrattile nonché la sua degradazione in peptidi da

parte dei proteasomi. La perdita di importanti unità contrattili e di altre specifiche proteine

muscolari, porta il muscolo ad una condizione graduale di atrofia.

- Fegato: a livello epatico in pazienti affetti da cancro è stato invece riscontrato in incremento della

sintesi proteica, con conseguente aumento del turnover di proteine plasmatiche e della fase acuta.

Mediatori chimici, effetti locali e sistemici: Sindromi paraneoplastiche:

Le sindromi paraneoplastiche sono quelle manifestazioni cliniche che si verificano a distanza dal sito

primario di un tumore e dalle sue metastasi. I principali meccanismi che ne provocano l’insorgenza sono la

sintesi e liberazione di fattori che provocano direttamente od indirettamente i sintomi (come i fattori IL-1,

TNF, IL-6, IFN-ϒ, LMF, PIF, PMF…); la deplezione di fattori normali la cui mancanza porta alla sindrome

paraneoplastica; risposta immunitaria dell’ospite. Le sindromi paraneoplastiche possono essere di ordine

generale (febbre, shock settico…) o di ordine specifico: ematologico, endocrinologico, neurologico,

reumatologico, dermatologico, gastroenterologico, renale… e quelle più frequenti sono:

- Febbre: dovuta per lo più alla liberazione di fattori quali TNF-α, IL-1 ed IL-6 (che stimolano a livello

epatico la sintesi delle proteine della fase acuta) ma anche alla presenza di infezioni di natura più o

meno nota. Ad esempio, l’adenocarcinoma del rene presenta febbre in circa il 50% dei casi,

similmente ai linfomi (Hodgkin e non Hodgkin) e all’epatocarcinoma.

- Anemia: condizione paraneoplastica molto frequente, generalmente causata da fattori quali TNF-α,

IL-1 e TGF. Tale tipo di anemia risulta essere in generale di tipo normocitico e normocromico, con

un aumento generale di ferritinemia, un complesso ferro-proteico che rappresenta un deposito

importante di questo elemento.

- Eritrocitosi: o policitemia, causata da alcuni tumori in grado di sintetizzare eritropoietina,

normalmente secreta dai reni. I tumori che più frequentemente la sintetizzano sono i carcinomi

renali (50%).

- Coagulopatie: uno stato procoagulativo, assai frequente nei pazienti oncologici, si può manifestare

con trombosi venosa profonda ed embolia polmonare. Una CID (coagulazione intravascolare

disseminata) può complicare il decorso di una neoplasia metastatica, ed è più frequente nei

pazienti con leucemia promielocitica acuta e tumori alla prostata.

- Sindromi paraneoplastiche dovute ad ormoni: Molti tipi di cellule tumorali sono in grado di

produrre ormoni. Possono essere sostanze non funzionanti oppure dei precursori con solo in

piccola parte l’attività biologica della forma matura dell’ormone. Tra le sindromi più diffuse vi sono:

Ipercalcemia: causata da ormoni (vit. D) e citochine (IL-6, TGFa e b, TNFa), sebbene nella

 maggior parte dei casi l’ipercalcemia paraneoplastica è dovuta alla produzione di PTH-RP

(da “PTH-related peptide”), una molecola omologa al paratormone (PTH) che induce

ipercalcemia aumentando il riassorbimento osseo e diminuendo l’escrezione renale di

calcio.

L’ipocalcemia: sindrome molto più frequente dell’ipercalcemia, spesso è asintomatica. Il

 carcinoma midollare della tiroide ad es. può secernere calcitonina, un ormone

normalmente sintetizzato dalle cellule C della tiroide e che induce ipocalcemia inibendo il

riassorbimento osseo e aumentando l’escrezione renale del calcio.

Sindrome di Cushing paraneoplastica: causata dalla secrezione di ormone

 adrenocorticotropo (ACTH) o, in casi assai rari, dalla produzione da parte delle cellule

tumoarali di CRF (“corticotropin-releasing factor”) anzichè ACTH. I tumori che sia associano

alla sindrome di Cushing sono il microcitoma polmonare (50% dei casi), il carcinoma timico

(10%), i tumori delle isole pancreatiche (10%), il carcinoma midollare della tiroide (5%), e

altri. Le manifestazioni cliniche sono: astenia, perdita di peso, ipertensione arteriosa,

iperpigmentazione cutanea, iperglicemia, ipopotassiemia, alcalosi metabolica.

Ad un esame obiettivo è inoltre importante valutare la presenza di alcuni segnali quali:

- Anoressia: anche l’anoressia è un effetto dell’insorgenza del tumore e specificatamente della

condizione di cachessia ed è spesso legata ad elevati livelli sierici di TNF-α, IL-1 e IL-6 in quanto in

grado di generare una intensa soppressione dell’appetito mentre, come visto prima, TNF-α

contribuisce all’insorgenza dell’anoressia incrementando la lipolisi.

- Segnali di sazietà: una sazietà precoce è tipica dei pazienti cachettici anche in assenza di

coinvolgimento del tratto gastroenterico. Ciò può essere associato con una attività incrementata di

citochine pro-infiammatorie come IL-1 ed il fattore di rilascio delle corticotropine (CRF), potente

induttore dell’anoressia. CRF infatti può indurre sensazioni si sazietà e stasi gastrica con

conseguente diminuzione dell’introito alimentare. La somministrazione inoltre di citochine è in

grado di ridurre l’introito di cibo anche per lunghi periodi di tempo, stimolando l’espressione ed il

rilascio della leptina, piccola glicoproteina rilasciata dal tessuto adiposo che agisce a livello

ipotalamico stimolando il senso di sazietà.

- Vomito: stimolato dall’insorgenza di acidosi metabolica.

Farmacoresistenza:

La resistenza ai farmaci con attività antineoplastica rappresenta uno dei maggiori ostacoli alla efficacia

clinica della chemioterapia. I farmaci con attività antineoplastica sviluppano la loro attività agendo con

meccanismi differenti sulle cellule tumorali e la mancata capacità di un determinato chemioterapico

antineoplastico di sviluppare una tossicità e conseguentemente la morte della cellulare viene definita

resistenza. Spesso la condizione di farmacoresistenza conferisce automaticamente resistenza farmaci della

stessa classe chimica, ma quando tale resistenza si espande a farmaci di classe chimica diversa si instaura

una condizione di multi-resistenza, definita appunto Multi Drug Resistance (MDR).

La resistenza a farmaci antineoplastici può essere distinta in permanente (od innata) e temporanea (od

acquisita):

Resistenza permanente:

Condizione in cui le cellule tumorali presentano, prima ancora dell’intervento terapeutico, un fenotipo

geneticamente resistente ad uno o più farmaci. Secondo l’ipotesi di Goldie-Coldman, una porzione della

massa tumorale è costituita da cellule resistenti a chemioterapici senza che siano state precedentemente

esposte ad essi. Tale condizione è dovuta allo sviluppo di una serie di mutazioni spontanee volte 5

all’acquisizione della chemioresistenza che risultano essere in rapporto al numero di mitosi (1 ogni 10

cellule), per cui neoplasie di grosse dimensioni presentano fenotipi chemioresistenti quantitativamente

maggiori rispetto a tumori di piccole dimensioni.

Resistenza temporanea:

Può essere dovuta a diversi fattori come la cinetica cellulare, cause biochimiche e farmacologiche.

Chemioresistenza e chemiosensibilità acquisita risultano essere importanti oggetti di studio in quanto

contraddistinguono il profilo di ogni tumore e sebbene i meccanismi di chemioresistenza acquisita non

siano del tutto noti, è comunque lecito pensare che l’instabilità genetica a cui sottostanno i tumori possa

indurre mutazioni che producano farmacoresistenze fenotipiche. Inoltre l’ampia fluttuazione del numero

assoluto di cellule neoplastiche farmacoresistenti e l’aumento dei cloni resistenti possono essere

responsabili di una chemioresistenza acquisita. La resistenza a farmaci antitumorali può riguardare

differenti ambiti:

- Cinetica cellulare. Resistenza di tipo cinetico: in questo caso la farmacoresistenza si sviluppa quando

la frazione di crescita e minima e si presenta un lungo plateu, condizione in cui la neoplasia

raggiunge grosse dimensioni ma ha un tasso di crescita basso ed una minima frazione di

accrescimento. Errate scelte di chemioterapici in rapporto alla cinetica cellulare sviluppata dal

tumore, come l’utilizzo di inibitori del fuso mitotico in tumori a lenta crescita, possono indurre una

resistenza farmacologica. In casi di neoplasie con una piccola frazione di crescita è spesso utile

ricorrere alla chirurgia o radioterapia ed utilizzare protocolli chemioterapia calibrati alla tipologia di

crescita.

- Diminuita vascolarizzazione: in tumori di grosse dimensioni l’alterata vascolarizzazione della

neoplasia può ostacolare la penetrazione del chemioterapico antitumorale, provocando una bassa

esposizione al farmaco dei distretti ipovascolarizzati. La zona più interna del tumore che risulta

presentare questa resistenza è definito “Santuario Tumorale”.

- Compartimenti cellulari inaccessibili: a prescindere dalle variazioni interindividuali di sensibilità ad

un farmaco, in linea generale la possibilità di predire il comportamento del farmaco in ogni singolo

paziente consente di ottenere sempre la concentrazione adeguata da introdurre nel torrente

circolatorio. Tuttavia la localizzazione stessa del tumore in distretti particolari definiti “santuari

anatomici” dove la penetrazione dei chemioterapici antineoplastici e difficoltosa (ad esempio a

livello del SNC e dei testicoli), può indurre una riduzione della concentrazione di principio attivo nel

tumore che comporta di conseguenza una possibile farmacoresistenza. Soprattutto a livello del

SNC, solo alcuni farmaci sono infatti in grado di attraversare la barriera ematoencefalica.

Multi drug resistence (MDR):

Viene chiamata anche resistenza pleiotropica e si tratta di un fenomeno per cui un trattamento con uno

specifico agente conferisce non solo resistenza a quel prodotto ma anche ad altri agenti sebbene

appartenenti a classi differenti. Da un punto di vista biochimico, la MDR può essere conseguenza di vari

meccanismi:

- Pompa ATP-dipendente: che favorisce l’efflusso del farmaco dalla cellula contro il proprio gradiente

di concentrazione, determinando così una bassa concentrazione intracellulare del chemioterapico

antineoplastico. Il meccanismo di efflusso è dunque sostenuto da una glicoproteina di membrana

appartenente alla famiglia ABC (ATP-Binding-Cassette), costituita da 12 segmenti transmembranari

e 2 siti enzimatici intracellulari per l’idrolisi dell’ATP.

Questa glicoproteina viene definita Pg-170 (P sta per pleiotropica) ed è codificata anche in

condizioni fisiologiche dal gene MDR-1, a livello di specifici organi some il colon, il rene, la midollare

surrenalica, la barriera ematoencefalica, il midollo osseo ed il fegato. Una sovraespressione della

glicoproteina P-170, associata ad una amplificazione del suo gene, che di solito si può manifestare

sia in tumori che originano dagli organi che naturalmente la esprimono sia in tumori che in modo

acquisito la sviluppano, provoca tuttavia la condizione di farmacoresistenza ai chemioterapici

antitumorali. In alcuni tipi di neoplasia l’espressione della MDR-1 risulta elevata prima di iniziare il

trattamento chemioterapico nella maggior parte dei casi (cellule tumorali intrinsecamente

resistenti), mentre in altri tipi l’iperespressione primaria della MDR-1 è meno frequente ma può

venire indotta dalla chemioterapia.

- Sistema di detossificazione: gli enzimi facenti parte della famiglia dei Citocromi P (CYPs) hanno un

ruolo importante nella farmacoresistenza in quanto catalizzano l’ossidazione di farmaci e di altri

xenobiotici. Durante il processo di biotrasformazione epatica infatti, principale meccanismo con il

quale viene regolata la concentrazione del farmaco nell’organismo, il farmaco progenitore viene

convertito in uno o più metaboliti (farmacologicamente attivi o inattivi) dotati di maggiore polarità,

quindi più idrosolubili e facilmente eliminabili con l’urina o con la bile. Tale processo avviene

attraverso la trasformazione dei gruppi funzionali della molecola (reazioni di fase I quali ossidazioni,

riduzioni ed idrolisi) e la successiva coniugazione con sostanze endogene per la formazione di

composti inattivi (reazioni di fase II quali glucuronidazione, solfatazione…). Il principale

responsabile delle reazioni di fase I di un’ampia varietà di composti endogeni ed esogeni è il

sistema epatico del citocromo P450, costituito da una serie di isoenzimi localizzati sulle membrane

microsomiali del reticolo endoplasmatico liscio. Tale sistema è riscontabile tuttavia anche in tessuti

extraepatici, quali il tratto gastrointestinale, i reni, i polmoni, la cute ed il sistema nervoso centrale.

Sempre rimanendo nell’ambito della cancerogenesi è inoltre importante sottolineare che alcuni

intermedi metabolici del sistema CYPs possono avere azione cancerogena.

- Meccanismi di riparazione del DNA: molti farmaci chemioterapici anti-tumorali agiscono inducendo

danni al DNA cellulare. Grazie tuttavia alla alterazione di enzimi coinvolti nella riparazione del DNA,

senza tuttavia provocarne una compromissione della loro attività riparativa, la cellula tumorale è in

grado di sviluppare una resistenza al chemioterapico. Ad esempio la Topoisomerai II risulta essere

un enzima fondamentale per la replicazione e riparazione del DNA e per questo motivo la riduzione

della sua espressione od una sua alterazione contribuiscono ad ottenere una resistenza nei

confronti di farmaci in grado di comprometterne l’azione, come le Antracicline.

Un ulteriore meccanismo di resistenza che agisce nel verso della riparazione del DNA è un aumento

dei sistemi di riparazione del DNA da parte della cellula tumorale.

- Meccanismi anti-apoptotici: la resistenza ai chemioterapici può anche derivare dal fallimento da

parte delle cellule di effettuare meccanismi apoptotici in presenza di danno al DNA od altri danni

cellulari. E’ dunque l’alterazione di geni che regolano il processo apoptotico come BCL2, BCLX

(codificanti per proteine anti-apoptotiche) o TP53 a promuovere la resistenza a chemioterapici anti-

tumorali. La proteina p53 è invece in grado di innescare il danno cellulare promuovendo l’apoptosi

mediante l’induzione di geni codificanti per proteine pro-apoptotiche come FAS e BAX e down-

regolando quelle anti-apoptotiche come BCL2. Mutazioni a carico del gene oncosoppressore p53 è

alla base della resistenza a farmaci chemioterapici che agiscono stimolando il processo apoptotico.

- Diminuita capacità della cellula di assumere il farmaco.

Da tutti questi dati è possibile concludere che i meccanismi di resistenza spesso sono farmaco-specifici in

quanto se uso un farmaco diverso potrebbe non risentire dello stesso tipo di resistenza.


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DESCRIZIONE APPUNTO

Facoltà di Odontoiatria: Appunti di patologia Generale approfonditi su: Ipertrofie ed iperplasie Tumori: classificazione, diagnosi, cancerogenesi (virale, da agenti fisici, chimica...), gli oncogeni, crescita tumorale, metastasi, tumori ed ormoni, terapia, Immunologia (Anatomia, genetica, la risposta immunitaria umorale e cellulo-mediata), cellule staminali, proteine plasmatiche, Anemie, Allergie.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in odontoiatria e protesi dentaria
SSD:
Università: Foggia - Unifg
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher rossella.marchiano di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e patologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Foggia - Unifg o del prof Perego Roberto.

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