Patologia generale - Cause intrinseche

Cause intrinseche di malattia

Le cause intrinseche sono di fatto le cause interne alla cellula, cioè le cause genetiche (a differenza di quelle estrinseche che sono ambientali, cioè fisiche, chimiche e infettive). Esistono anche le cause immunitarie innescate dal sistema immunitario (immunopatologia).

Danno genetico

Il concetto di danno genetico si va plasmando e modificando in modo molto rapido. Il danno genetico può essere un danno di un singolo gene (patologie ereditate secondo le leggi di Mendel), ma anche da polimorfismi genetici (sottili differenze di sequenza che possono alterare la predisposizione allo sviluppo di una determinata patologia), o da alterazioni multifattoriali.

Ereditarietà e struttura del DNA

Il DNA è costituito da basi (purine e pirimidine), la differenza tra RNA e DNA è l’acido ribonucleico e deossiribonucleico. Il DNA si legge da 5’ a 3’ come si forma il legame fosfodiestereo. La struttura primaria è determinata dalla sequenza nucleotidica (modificazioni della sequenza nucleotidica = modificazione della struttura primaria). Le basi si uniscono per legami deboli (legami a idrogeno) tra timina e adenina e tra citosina e guanina, formando la struttura secondaria (fenomeno di ibridazione tra due acidi nucleici complementari).

Per denaturazione si intende il meccanismo di perdita della struttura secondaria (e quindi terziaria e eventualmente quaternaria). Ibridazione e denaturazione vengono sfruttati in termini diagnostici e sono la base dei test per l’identificazione del DNA. Questi sono usati per il riconoscimento delle mutazioni del DNA (ad esempio delle traslocazioni, per la quantificazione dei livelli di espressione genica, importanti per la scelta terapeutica).

Il DNA si denatura quando si aprono le catene e si può ibridare con una sonda a sequenza nota. Se la sonda è marcata sviluppa fluorescenza quando si lega alla sequenza complementare.

Strutture terziarie e regolazione epigenetica

Il DNA ha anche una struttura terziaria, un superavvolgimento determinato dalla composizione delle basi, dalle interazioni e dalle modificazioni chimiche delle basi che avvengono in particolare in isole di citosina-guanina. La metilazione è una modificazione epigenetica che altera la struttura terziaria del DNA. Sono le modificazioni epigenetiche a regolare il funzionamento del DNA.

Le proteine che si associano al DNA (istoni e proteine non istoniche cioè fattori di trascrizione che riconoscendo specifiche sequenze del DNA alterano la trascrizione aumentandola o diminuendola) alterano la struttura terziaria. Alcune delle mutazioni del DNA che determinano patologia ad esempio patologie ereditarie, impediscono che il fattore trascrizionale riconosca il DNA (esempio talassemia).

Gli istoni sono proteine strutturali, intorno alle quali il DNA si avvolge. La gran parte della regolazione del funzionamento trascrizionale del DNA avviene modificando le proteine istoniche (per attivare o spegnere i geni). L’organizzazione del DNA intorno agli istoni si definisce cromatina.

Il nucleosoma è l’unità di DNA organizzato (circa 160 basi) intorno agli istoni. Sono costituiti dall’aggregazione di vari tipi di istoni (2xH2a, H2b, H3 e H4. H1 stabilizza il DNA). Nel DNA svolto è evidente la struttura nucleosomica. Se il DNA fosse interamente svolto avrebbe una lunghezza enorme, quindi nella cellula deve essere superavvolto.

Il genoma umano

Il genoma umano è costituito da circa 23 mila geni di varie dimensioni (il gene più grande è quello che codifica per la distrofina). Per il 99,9% siamo uguali dal punto di vista della sequenza genetica, mentre 0,01% condiziona le diversità tra individui. Più del 50% dei geni trovati ha funzione sconosciuta. Meno del 2% codifica per delle proteine. Le sequenze ripetitive rappresentano il 50% del genoma (influenzano il resto del genoma). Nell’uomo ci sono molte più sequenze ripetitive dei primati, ma l’uomo ha smesso di aumentarle, mentre il topo continua ancora.

Il genoma è costituito da aree dense (costituite da citosina e guanina) e aree desertiche (timina e adenosina).

Produzione di trascritti

Il genoma produce molti trascritti (circa 180 mila). Questo altera il paradigma “un gene, una proteina”. Molti trascritti derivano da un singolo gene a causa dell’inizio o della fine della trascrizione in punti diversi, o per lo splicing alternativo. Questo porta non solo alla produzione di proteine, ma anche di RNA non codificanti che servono a regolare altri RNA (metà del trascrittoma è costituito da RNA non codificanti).

Epigenetica

L’epigenetica studia le modificazioni secondarie degli istoni e del DNA che ne condizionano il funzionamento. Le modificazioni epigenetiche sono quelle che determinano la natura delle cellule (tutte le cellule hanno lo stesso DNA ma la differenziazione dipende da vari fattori tra i quali anche le modificazioni epigenetiche).

Le modificazioni epigenetiche possono essere determinate dall’ambiente, quindi l’interazione dell’ospite con l’ambiente modifica il funzionamento dei geni e questo è importante in molte patologie vascolari, oncologiche ma anche cromosomiche. Nelle trisomie 21 le stimolazioni esterne variano enormemente le capacità intellettive. Queste modificazioni sono però relativamente stabili e possono essere ereditate (sia dalle cellule figlie per mantenere le caratteristiche di un tessuto, ma anche da generazione a generazione).

Le modificazioni epigenetiche possono generare tumori. Non sono modificazioni della sequenza del DNA, ma sono modificazioni reversibili, quindi possiamo utilizzare sostanze che modificano l’epigenetica per curare alcune malattie.

Queste modificazioni sono causate da istoni e proteine non istoniche che si legano al DNA e regolano l’accesso delle RNA polimerasi e dei fattori di trascrizione. La posizione dei nucleosomi è una posizione plastica, quindi l’istone si può spostare lungo il DNA rimodellando l’intero nucleosoma (anche l’attivazione delle cicline è sotto il controllo epigenetico).

Le modificazioni critiche sono quelle sulle code degli istoni (che presentano una componente globulare e una lineare N-terminale che sporge fuori dal DNA a generare le code istoniche su cui avvengono le modificazioni chimiche). L’aggiunta di gruppi chimici modifica radicalmente l’aggregazione degli istoni con il DNA e rende quindi la cromatina accessibile (eucromatina, svolta) o non accessibile (eterocromatina, impacchettata) ai fattori di trascrizione. Questa plasticità della componente epigenetica viene studiata per ottenere la de-differenziazione delle cellule e ottenere cellule staminali (totipotente) da cellule mature (partendo da una cellule della cute si può ottenere un topo).

Ai residui amminoacidici delle code istoniche si possono aggiungere gruppi fosfato, metilici, acetilici, di ubiquitina, e questo condiziona la trascrizione. Esiste una grande varietà di modificazioni epigenetiche che possono modificare la trascrizione.

• Acetilazione istonica: avviene sugli ε aminogruppi della lisina. Una quota di aggregazione è sempre presente perché l’istone 4 deve formare il cilindretto a 8 unità proteiche intorno al quale si aggrega il DNA. Una ulteriore acetilazione significa attivazione genica, mentre una diminuzione dell’acetilazione significa spegnimento della trascrizione. Quando arriva il fattore trascrizionale, porta ad acetilazione, la cromatina si svolge e il gene può essere trascritto. La deacetilazione avviene nel modo opposto ed è operata da enzimi chiamati istone-deacetilasi che spesso sono convogliate sul DNA da fattori trascrizionali (Rb che funziona reprimendo la trascrizione dei geni). Molte proteine alterate nel cancro modificano il livello di acetilazione degli istoni. Alcune sono caratterizzata da attività istone-deacetilasica. Possiamo quindi neutralizzare l’effetto di queste proteine che generano il cancro somministrando inibitori dell’istone-deacetilasi.
• Metilazione degli istoni: a seconda di dove avviene ha un effetto diverso. Sull’istone H3 alcune sono repressorie, mentre altre sono attivatorie. Ciascuna di queste modificazioni è causata da un enzima specifico (possibilità di bloccarlo). Le modificazioni in senso repressorio sono spesso associate a metilazione del DNA. Questo si verifica ad esempio nella Lyonizzazione del cromosoma X nella femmina. Il DNA metilato viene riconosciuto da alcune proteine che lo impacchettano e cementano. In patologia la metilazione dei promotori è un evento che si verifica spesso: metilazione di un area che regola il funzionamento del gene, significa spegnere quel gene. Ad esempio nei tumori sono spenti i geni che regolano la proliferazione cellulare.

Epigenetica e genetica contribuiscono alla patogenesi del cancro e questo fa si che possa essere in sperimentazione una terapia epigenetica (bloccano DNA-metil-transferasi DMT o le istone-deacetilasi). Nel caso di due gemelle, nel momento in cui ad una viene diagnosticato un tumore, l’altra è a rischio? Non necessariamente, perché potrebbe non aver subito le mutazioni epigenetiche che ha subito l’altra.

Meccanismi di riparazione del DNA

Il materiale genetico deve rimanere integro, tuttavia esiste una plasticità rappresentata dalle modificazioni epigenetiche. Esiste anche una quota di plasticità del DNA, ma è abbastanza limitata nella specie umana. Questa integrità viene mantenuta interagendo con i fattori epigenetici. Esiste la possibilità di rimodellare il DNA in base alle esigenze del genoma. Un’altra quota di plasticità avviene a livello delle sequenze ripetitive.

Un’altra quota dipende dall’esistenza all’interno del DNA di elementi trasponibili (possono saltare da un punto all’altro del DNA). Questi sono presenti nel genoma in quantità e mobilità ridotta nell’uomo rispetto ad altri mammiferi. Nell’uomo alcuni di questi movimenti possono determinare patologia genetica (alcuni esempi di emofilia). Tuttavia generalmente sono fattori positivi perché portano allo sviluppo di un soggetto adatto all’ambiente.

Esiste poi una plasticità data dalla tendenza a sbagliare della DNA polimerasi (1 errore ogni centomila basi). Il numero degli errori è fortemente ridotto dall’attività proof reading (correttore di bozze del 99% degli errori). Gli errori devono essere corretti per mantenere l’integrità del genoma. Noi siamo sempre esposti a fattori che modificano il DNA e che non sono accettabili per la conservazione della specie, quindi sono presenti dei meccanismi di riparazione del DNA.

L’alterazione della riparazione del DNA è una importante causa di patologia. La riparazione del DNA è un processo complesso, variabile a livello individuale. Il tumore è una patologia che deriva dalla persistenza di errori nel DNA. Il danno al DNA ha conseguenze diverse se colpisce le cellule germinali (propagazione alla progenie se compatibile con la sopravvivenza portando a malattie genetiche, ereditarie, presenti in tutte le cellule dell’organismo figlio) o le cellule somatiche (patologia della cellula, potenzialmente quindi del tessuto, dell’organo, dell’individuo). La patologia cellulare può portare a neoplasia, senescenza quindi arresto proliferativo, o morte cellulare. La riparazione del DNA deve incidere sull’aggregazione cromatinica favorendo l’accesso dei fattori che vanno a risolvere il danno.

Il danno al DNA può derivare dall’ambiente o essere di origine endogena (correlata al metabolismo). L’inquinamento chimico ambientale è una fondamentale forma di danno al DNA. Qualsiasi sostanza mutagena inalata o ingerita può portare a danno. Altre fonti potenziali di danno al DNA sono presenti nella cellula (radicali liberi dell’ossigeno).

Il radicale libero dell’ossigeno danneggia il DNA provocando morte cellulare, danno o senescenza (invecchiamento dell’individuo).

La riparazione del DNA è un processo complicato che si articola in molte fasi. Ci sono varie proteine in grado di individuare il danno del DNA (struttura modificata in relazione al danno, o ingombro sterico modificato da una molecola adesa al DNA), c’è poi una segnalazione locale che serve a produrre la riparazione (ripara la modificazione con vari meccanismi), infine c’è una segnalazione alla cellula che ha lo scopo di impedire la replicazione cellulare nel momento in cui il DNA risulta danneggiato. Esistono vari punti di controllo nella cellula per verificare lo stato di corretta struttura del DNA. Se il danno non viene riparato ci sono le conseguenze nella cellula (trasformazione neoplastica oppure meccanismi di sicurezza che le impediscono di proseguire la divisione portandola a morte o a senescenza, quindi arresto proliferativo permanente). Se sono assenti questi meccanismi, o se la riparazione fallisce, la cellula continua la sua corsa portando quindi a neoplasia. Ciascuna fase è regolata da molteplici proteine.

Danni al DNA

• Blocco della replicazione del DNA (stallo della forcella replicativa);
• Aggiunta di gruppi chimici (ad esempio metilico, oppure molto grande come idrocarburi policiclici aromatici) che determinano un notevole ingombro sterico;
• Comparsa di dimeri pirimidinici: legame covalente tra due basi in seguito a irraggiamento uv (sole);
• Rotture su una singola elica (nicchie);
• Perdita di pezzi di DNA;
• Rotture sulla doppia elica;
• Formazione di legami crociati;
• Incorporazione anomala di un nucleotide sbagliato (mismatch).

Meccanismi di riparazione

• Riparazione diretta delle basi alchilate: gli agenti alchilanti sono sostanze chimiche che aggiungono un gruppo alchilico al DNA (sia presenti in natura che farmaci come antineoplastici). La forma di alchilazione più semplice è la metilazione. Questo sistema ripara anche il DNA metilato, per riattivare una regione spenta dalla metilazione. Esiste un enzima AGT, codificato dal gene MGMT, che prende il gruppo metilico e poi va incontro a degradazione. In molti tumori c’è l’inattivazione di questo meccanismo per alterazione del gene MGMT.
• Riparazioni delle rotture della doppia elica del DNA: si verificano con due diversi meccanismi: ricombinazione omologa e giunzione terminale. La rottura della doppia elica si verifica anche fisiologicamente (maturazione e riarrangiamento delle immunoglobuline e del TCR, e per lo switch isotipico). Patologicamente si verifica in seguito a danni da radicali liberi, danni esogeni quali radiazioni ionizzanti e farmaci antineoplastici, che possono rompere il DNA sulla doppia elica. Questo sistema di riparazione riconosce anche i telomeri non terminati e lo stallo delle forcelle replicative soprattutto nelle regioni altamente ripetute. Anche in questo caso c’è una segnalazione verso la cellula.

In caso di ricombinazione omologa si ha la rimozione della sequenza errata e la copiatura delle basi a partire dall’altro allele. Sono coinvolte le elicasi che svolgono il DNA, le nucleasi che tagliano il DNA, le polimerasi che copiano le basi corrette e le ligasi che ripristinano il legame e l’integrità del DNA. È un meccanismo molto preciso, agisce in S-G2.

Le proteine importanti sono ATM, BRCA1, BRCA2 (determinanti nella patogenesi del carcinoma ereditario della mammella), ABL (interviene nella segnalazione intracellulare, la sua alterazione determina la comparsa di leucemie, in particolare leucemia mieloide cronica).

In caso invece di giunzione terminale alcune proteine riconoscono il sito di rottura e ripristinano la sequenza. Questo però può andare incontro ad errori e generare delezioni.

Il meccanismo di segnalazione passa attraverso due chinasi: ATM e ATR. La fosforilazione gioca un ruolo importante nella segnalazione di ATM e ATR per bloccare la cellula mentre viene riparato il DNA. A seconda del tipo di danno si attiva una via diversa. Se c’è un danno tipo rottura della doppia elica si attiva la via di ATM, mentre in caso di arresto della forcella replicativa si attiva la via ATR, ma entrambi fosforilano i substrati e arrestano la replicazione. Tra i substrati che vengono fosforilati ci sono CHK1 e CHK2 che sono delle chinasi e quindi il meccanismo si amplifica.

Le conseguenze dell’attivazione di ATM e ATR portano all’attivazione di CHK1 e 2 con fosforilazione di p53 e pRb, arresto del ciclo, riparazione del DNA e altre alterazioni minori che consentono alla cellula di rispondere al danno al DNA. L’arresto replicativo è indispensabile per riparare il DNA prima di trasmettere il danno alle cellule figlie. Questi meccanismi di arresto proliferativo sono i meccanismi di checkpoint del ciclo cellulare che verificano lo stato di salute del DNA e consentono la riparazione del DNA delle cellule proliferanti.

L’alterazione dei meccanismi di riparazione della doppia elica porta a molte patologie che riguardano il fenotipo immunologico (la riparazione è indispensabile per il riarrangiamento delle Ig e del TCR, quindi se si ha una carenza di questo meccanismo di riparazione, si ha un deficit della maturazione del sistema immunitario, immunodeficienze), alterazioni dello sviluppo embrionale, cancro.

Tra le tante patologie che scaturiscono dall’alterazione dei meccanismi di riparazione c’è l’alterazione del gene ATM che determina atassia telangectasia. Infatti la sua mutazione determina ipersensibilità al danno genetico prodotto dalle radiazioni ionizzanti e all’incapacità di riparare tale danno. Questo porta anche a danni cerebrali e cerebellari (se avviene in epoca prenatale) con incoordinazione nel movimento e alterata percezione degli arti nello spazio. Può portare anche a linfomi e leucemie che sono quelli che si sviluppano più velocemente. Il termine teleangectasie significa dilatazione terminale dei vasi.

Nell’adulto, se l’attività di ATM è ridotta (1% popolazione caucasica) si possono avere varie problematiche.