Patologia generale - appunti intero corso

Il corso di patologia generale

Il corso comprende patologia generale con elementi di terminologia medica; è importante conoscere il significato dei termini tecnici. “Patologia” significa studio della sofferenza; la patologia generale studia i processi attraverso i quali cellule e tessuti rispondono agli stimoli anomali alla base delle malattie. La malattia è ogni deviazione rilevabile dalla condizione omeostatica; l’omeostasi è una condizione di equilibrio (temperatura, osmolarità del sangue, ecc.).

Fattori patogeni e eziologia

I fattori patogeni o cause delle malattie sono stimoli esogeni (chimici, fisici, biologici, alimentari) o fattori endogeni in grado di alterare la condizione omeostatica; per esempio batteri, oppure mutazioni genetiche e insorgenza di tumori. L'eziologia è quella parte della patologia generale che studia le cause di malattia.

Patogenesi

La patogenesi è il meccanismo d’azione con cui le cause agiscono (es. meccanismi autoimmunitari, infezione virale, ecc.). La patologia generale è quindi la disciplina che studia il perché (eziologia) ed il come (patogenesi) viene alterato lo stato di salute di un individuo, dando così una malattia.

Livelli di studio della malattia

Una malattia può essere studiata a diversi livelli:

• Di popolazione: si valuta l’incidenza della malattia in una popolazione epidemiologia.
• Di individuo: patologia clinico-medica.
• Di organo o di sistema: fisiopatologia (es. renale).
• Di tessuto: istopatologia.
• Di cellula: citopatologia.
• Di organelli: biochimica.
• Di geni: biologia molecolare.
• Di molecole: biofisica.

Eziologia e fattori genetici

Per quanto riguarda l’eziologia, essa può essere correlata a fattori genetici oppure a fattori esogeni. Tra le malattie genetiche abbiamo, ad esempio, emofilia e distrofia muscolare, mentre tra i fattori esogeni causa di malattie abbiamo, ad esempio, le radiazioni. In mezzo abbiamo malattie, come il diabete, che sono multifattoriali. Per quanto riguarda i tumori, in alcuni casi prevale la componente genetica, in altri l’aspetto ambientale.

Cellula eucariotica e DNA

È fondamentale conoscere la struttura di una cellula eucariotica; il DNA, la sua organizzazione in cromosomi, il numero di cromosomi nella specie umana (23 coppie), la sua lunghezza se srotolato (circa 2 metri, circa 8 miliardi di coppie di basi); processi di trascrizione e di traduzione del DNA; struttura di un nucleotide, basi azotate e la loro complementarietà (purine -adenina e guanina- e pirimidine -citosina e timina-, adenina + timina, guanina + citosina).

Cromatina e nucleosomi

La cromatina è la forma in cui gli acidi nucleici si trovano nel nucleo di una cellula eucariotica; è costituita da DNA e da proteine, gli istoni. L’unità base è il nucleosoma, e i vari nucleosomi sono uniti tra loro da DNA linker (come le perle di una collana ed il filo che le unisce). Esistono vari tipi di istoni: H1, H2a, H2b, H3, H4; gli istoni H2a, H2b, H3 ed H4 (due per ciascun tipo, si accoppiano) si autoaggregano formando un ottamero chiamato ottamero istonico, attorno al quale si avvolge il DNA; l’istone H1, invece, collega il DNA linker all’ottamero.

Compattamento del DNA

Vari gradi di compattamento del DNA: si parte da DNA a doppia elica, si passa alla struttura a nucleosomi, poi nucleosomi impaccati, infine cromosomi. Nel cromosoma abbiamo il centromero che divide il cromosoma in braccio lungo (q) e braccio corto (p).

Regolazione dell'espressione genica

Il genoma umano è costituito da 23 coppie di cromosomi (in tutto 46); 22 coppie sono chiamate autosomi (cromosomi somatici non sessuali) e 1 coppia è costituita dai cromosomi sessuali (eterosomi, XX nella donna ed XY nell’uomo). Abbiamo circa 8 miliardi di coppie di basi e circa 30mila geni; fino a pochi anni fa si pensava che il nostro DNA contenesse circa 15mila geni.

Gene e trascrizione

Il gene è una unità di trascrizione, e la diversità fra le varie cellule è legata all’espressione di geni diversi: questi 30mila geni sono in tutte le cellule (nei globuli rossi no perché sono privi di nucleo), però in ogni cellula se ne esprimono solo alcuni: es. il gene dell’albumina si esprime negli epatociti, il gene della globina nei globuli rossi; è quindi molto importante conoscere il controllo dell’espressione genica.

Modificazioni post-trascrizionali

La regolazione dell’espressione genica può avvenire a livello trascrizionale o post-trascrizionale: a livello trascrizionale da una sequenza di DNA si forma RNA, e l’RNA messaggero darà origine alla proteina; sia l’RNA messaggero sia la proteina, però, possono subire modificazioni post-trascrizionali che condizionano l’attività di quella proteina: l’RNA messaggero può essere più o meno stabile, la proteina può essere inattiva finché non viene fosforilata o glicosilata; le modificazioni possono quindi essere post-trascrizionali o post-traduzionali.

Struttura del gene

Un gene è costituito da una porzione codificante e da una porzione regolatoria: la porzione codificante è costituita da esoni intervallati da introni, cioè da porzioni non codificanti; la porzione regolatoria contiene invece sequenze come elementi promoter ed enhancer trascrizionali. Abbiamo poi una regione chiamata TATAbox, detta così perché è ricca di residui di timina e adenina, e si trova a circa 30 nucleotidi dal sito di inizio della trascrizione; la trascrizione dell’RNA è operata da RNA polimerasi di tipo I, II, III; l’RNA messaggero che servirà per la sintesi proteica è trascritto dalla RNA polimerasi di tipo II.

Trascrizione del gene e RNA

In seguito alla trascrizione del gene si forma il trascritto primario, che avrà un’estremità 5’ ed un’estremità 3’; si ha poi la processazione dell’RNA che porta all’allontanamento delle sequenze introniche (splicing), si ha l’aggiunta di una sequenza poliA, e si forma quindi l’RNA messaggero maturo. Avviene poi la traduzione dell’RNA ad opera dei ribosomi legati al reticolo endoplasmatico rugoso e si forma quindi la proteina, presentante l’estremità amminoterminale e quella carbossiterminale, e la proteina può poi subire modifiche post-traduzionali; può essere una proteina di struttura, un enzima, una proteina regolatoria che può intervenire come fattore di trascrizione o nella trasduzione del segnale.

Tipi di RNA polimerasi

Per quanto riguarda la regolazione dell’espressione genica, esistono 3 diversi tipi di RNA polimerasi:

• RNA polimerasi di tipo I si trova nel nucleolo (è una regione del nucleo particolarmente densa di materiale genetico e proteico) e dà origine a RNA ribosomiale;
• RNA polimerasi di tipo 2 si trova nel nucleoplasma (matrice gelatinosa presente nel nucleo) e dà origine all’RNA messaggero;
• RNA polimerasi di tipo 3 si trova nel nucleoplasma e dà origine all’RNA transfer.

Fattori di trascrizione

Abbiamo poi detto che le proteine possono fungere da fattori di trascrizione: sono fattori che si legano alle sequenze promoter o enhancer situate nella porzione regolatoria che controlla l’espressione di quel gene, e legandosi permettono l’inizio del processo di trascrizione. Questi fattori si legano al promotore o all’enhancer: il promotore è una sequenza di DNA che regola la trascrizione, ha struttura modulare con sequenze comuni e specifiche, è tra 40 e 1000 coppie di basi di distanza dal sito di inizio della trascrizione. L’enhancer è un elemento di rinforzo a struttura modulare e localizzazione variabile, può anche essere molto distante dal sito di inizio della trascrizione.

Geni costitutivi e inducibili

La trascrizione dei geni di classe II (=geni che codificano per mRNA) (geni di classe I: codificano per RNA ribosomiale; geni di classe III: codificano per tRNA) avviene in modalità costitutiva (appena il promotore si lega parte la trascrizione. Distinguiamo trascrizione di geni costitutivi e trascrizione di geni inducibili; per la trascrizione dei geni costitutivi basta l’apparato basale di trascrizione, mentre per la trascrizione dei geni inducibili è necessario che avvenga l’attivazione di particolari fattori di trascrizione che sono inducibili.

Ad esempio, in una cellula il gene che codifica per l’actina (proteina strutturale importante per il citoscheletro) è un gene costitutivo, tutte le cellule esprimono in ogni momento questo gene; un gene inducibile viene invece espresso, ad esempio, in una condizione di stress; esistono ad esempio geni chiamati “heat shock” che vengono espressi solo quando la temperatura corporea si alza, producendo così proteina chiamate proteine da stress o heat shock proteins; perché si esprimano questi geni, quindi, è necessaria la presenza di un fattore di trascrizione inducibile che sarà attivato da una particolare condizione (in questo caso l’ipertermia).

Promotore basale e inducibile

Il promotore basale è la più breve sequenza di DNA da cui l’RNA polimerasi di tipo II può iniziare la trascrizione; contiene delle sequenze regolatorie comuni e costitutive: il TATAbox, il CAPbox, il GCbox. Al TATAbox si lega una proteina chiamata TBP (TATA Binding Protein); al GCbox si lega un fattore di trascrizione chiamato SP-1 (Stimulatory Protein 1). Il ruolo del promotore è quello di permettere la corretta localizzazione del complesso di inizio e di regolare l’efficienza della trascrizione.

Il promotore inducibile, invece, oltre a queste sequenze costitutive contiene degli elementi di risposta specifici: ad esempio heat shock response element è indicato come HSE, ed è una sequenza presente nei promotori heat shock e si lega ad un fattore chiamato heat shock factor; a 37° heat shock factor è presente nella cellula in condizioni di riposo, in caso di ipertermia si attiva (per fosforilazione o per trimerizzazione) e diventa in grado di legarsi all’HSE; può così partire la trascrizione di quel gene.

Lo stesso vale per un elemento di risposta ai glucocorticoidi: quando questi non ci sono il fattore di trascrizione è in una condizione di riposo, mentre quando questi sono presenti il fattore di trascrizione si attiva e si lega a promotori presenti in determinati geni, e la cellula risponde così alla stimolazione del glucocorticoide.

Tipi di fattori di trascrizione

Oltre ai geni costitutivi e inducibili esistono anche dei fattori di trascrizione che sono costituitivi o inducibili; i costitutivi sono distribuiti ampiamente e non sono specifici per determinati geni, e costituiscono ad esempio l’apparato basale per la trascrizione; gli inducibili (es. heat shock factor) si legano a sequenze specifiche presenti sono in certi promotori.

I fattori di trascrizione devono avere due proprietà: devono riconoscere delle sequenze localizzate nei promotori, negli enhancer o in altri elementi regolatori; devono interagire con la RNA polimerasi o con altri fattori di trascrizione. All’interno della stessa proteina esistono domini diversi per due attività: un dominio che interagisce con il DNA ed un dominio che interagisce con altre proteine. Vedremo AP-1, un dimero costituito da 2 proteine, fos e jun.

Attivazione dei fattori di trascrizione

Tramite quali modalità può avvenire l’attivazione di un fattore di trascrizione?

• Può esserci una regolazione trascrizionale, cioè il fattore di trascrizione non è presente nella cellula, deve essere trascritto e tradotto, quindi sintetizzato ex-novo; è il caso di fos, quando la cellula viene sintetizzata non è proliferante e lo diventa dopo 30 minuti, quando nella cellula compare fos.
• Oppure l’attivazione può avvenire per fosforilazione: è il caso di jun, finché non viene fosforilato dopo aggiunta di un gruppo fosfato che proviene dall’ATP non è attivo.
• Oppure per defosforilazione.
• Oppure per degradazione di un inibitore: è il caso di NFKB, che è un fattore di trascrizione presente nel citoplasma in forma inattiva perché è legato ad una proteina, e solo quando questa viene degradata esso si attiva, diventa in grado di passare nel nucleo ed stimolare la trascrizione di determinati geni.
• Oppure per legame con un ligando: è il caso dei recettori per gli steroidi, che legano una proteina che impedisce alla struttura di interagire con il DNA; quando arriva l’ormone steroideo la proteina si stacca ed il recettore acquisisce capacità di interagire con il DNA.
• Oppure per oligomerizzazione: è il caso di HSF, presente come monomero che si attiva dopo essere diventato trimero.

Spesso, quindi, il fattore di trascrizione è già presente nel citoplasma o nel nucleo, ma è in forma inattiva e deve essere modificato; acquisisce così capacità trascrizionali, cioè capacità di legare un promotore o un enhancer.

Enhancer

Enhancer: sequenze regolatorie a monte o a valle dei promotori e che influenzano l’attività del promotore. Abbiamo detto che tutte le cellule hanno lo stesso patrimonio di geni, ma che nelle varie cellule se ne esprimono solo alcuni e non altri: il gene della globina, ad esempio, non si esprime negli epatociti mentre si esprime nei precursori dei globuli rossi; questo dipende da acetilazione e deacetilazione degli istoni, poiché lo stato di acetilazione degli istoni è correlato all’espressione genica.

Acetilazione e metilazione

Interverranno quindi due enzimi: istone acetiltransferasi HAT, che promuove l’acetilazione degli istoni, e istone deacetilasi che rimuove gli acetili dagli istoni. Negli epatociti, quindi, il gene della globina sarà deacetilato.

Un altro aspetto importante è la metilazione: l’espressione genica è associata ad una demetilazione, e la metilazione del DNA è uno dei parametri che controllano la trascrizione; la metilazione di un promotore è associata all’assenza di trascrizione. La DNA metiltransferasi metila delle citosine presenti in quel promotore che, metilato, diventa inattivo. Nell’epatocita, quindi, il gene della globina sarà metilato e deacetilato; conoscere queste cose è importante perché in molti tumori umani c’è un disturbo legato alla metilazione; nel nostro genoma ci sono geni i cui prodotti favoriscono la proliferazione delle cellule ed altri i cui prodotti frenano la proliferazione delle cellule; se il gene che codifica per questi freni è ipermetilato la sua funzione viene persa e la cellula prolifera in modo incontrollato.

Attività del gene

Un gene è attivo, è legato a fattori di trascrizione e viene trascritto; il gene si spegne quando si staccano i fattori di trascrizione; in seguito viene metilato e deacetilato. Inoltre una struttura della cromatina compattata indica assenza di trascrizione, mentre solo quando è rilassata c’è accesso per i fattori di trascrizione e quindi trascrizione.

Sindrome di Rett

La sindrome di Rett è un disordine neurologico che colpisce prevalentemente il sesso femminile e rappresenta una delle forme più comuni di ritardo mentale femminile; ha un’incidenza di 1:10.000 ed insorge fra il sesto ed il diciottesimo mese di vita. Nel 1999 è stata definita come “malattia molecolare” dovuta alla mutazione del gene MECP-2 situato sul cromosoma X, che codifica per un repressore trascrizionale (se la proteina MECP-2 codificata da questo gene non si lega ad un gene allora questo può essere trascritto, mentre se si lega il gene non può essere trascritto). In caso di patologia questo gene è mutato, e possono esistere più di 200 diverse mutazioni: può esserci mutazione a carico di un unico amminoacido, mutazioni che generano una proteina non completa. Il repressore manca, e ci sono alcuni organi, come fegato e cervello, in cui questo gene non deve esprimersi. La patologia comporta grave ritardo nell’acquisizione del linguaggio e della coordinazione motoria e ritardo mentale grave o gravissimo.

RNA interference

Vediamo ora la cosiddetta RNA interference, cioè l’interferenza dell’RNA, abbreviata come RNAi: è un meccanismo tramite il quale alcuni frammenti di RNA a doppio filamento sono in grado di interferire, e quindi di spegnere, l’espressione genica. Esiste un enzima che taglia delle sequenze di RNA a doppio filamento in frammenti di lunghezza tra 19 e 21 coppie di basi; questo frammento, chiamato siRNA (Short Interfering RNA) si associa con un complesso enzimatico, il frammento a doppio filamento viene aperto: il filamento di RNA antisenso rimane associato al complesso enzimatico, mentre il filamento senso viene degradato.

A questo punto il complesso enzimatico attivo è in grado di scansire molti mRNA presenti nel citoplasma fino a trovarne uno complementare al filamento antisenso; se l’appaiamento è perfetto l’enzima opera un taglio sull’mRNA ed il frammento di mRNA ottenuto viene degradato dall’RNAasi; l’mRNA viene quindi degradato e non dà più luogo alla proteina. Questa tecnica è chiamata “silenziamento dell’RNA” o “silenziamento dell’espressione genica”, è a tutti gli effetti una modalità di controllo dell’espressione genica, è un modo per silenziare l’espressione di determinati geni ed è stata recentemente proposta come terapia antitumorale perché se abbiamo una proteina anomala responsabile della comparsa del tumore, tramite questa tecnica possiamo impedire l’espressione di quella proteina.

Se in una cellula vengono a mancare un certo numero di microRNA che impediscono l’espressione esagerata di determinati geni, questo può dare origine ad una trasformazione neoplastica (è un’altra ipotesi).

Classificazione delle cellule

Giulio Bizzozéro è stato un medico italiano che ha classificato le cellule del nostro organismo in base alla capacità di replicazione, suddividendole in tre categorie: cellule perenni, cellule stabili, cellule labili. Più tardi questa classificazione venne ripresa da Cowdey che classificò:

• Le cellule labili come cellule vegetative intermitotiche.
• Le cellule stabili come cellule postmitotiche revertanti.
• Le cellule perenni come cellule postmitotiche fisse.

Le cellule del nostro organismo, quindi, non hanno tutte la stessa capacità replicativa.