Patologia e fisiopatologia generale – Emostasi

Il processo emostatico

Definizione di emostasi

Emostasi: serie di reazioni biochimiche, sequenziali e sinergiche, finalizzate a impedire la perdita di sangue dai vasi. È cioè un meccanismo di difesa deputato al mantenimento dell'integrità dei vasi sanguigni e della fluidità del sangue (schema 1).

Tappe del normale processo emostatico

Quando si verifica una lesione vascolare, viene attivato il meccanismo dell'emostasi, che è un meccanismo autoregolato. I sistemi coinvolti nel processo emostatico sono 4 (schema 2):

• Vasi e costituenti della parete vascolare
• Piastrine
• Cascata enzimatica della coagulazione
• Sistema fibrinolitico

Il processo emostatico può essere suddiviso in 4 fasi (schema 2), tenendo però sempre presente che i vari sistemi coinvolti si influenzano vicendevolmente e sono intimamente interconnessi. Le 4 fasi sono:

• Fase vascolare
• Fase piastrinica
• Fase coagulativa
• Fase fibrinolitica

Fase vascolare

All'inizio c'è un breve periodo di vasocostrizione (dovuto a meccanismi neurogeni riflessi e a fattori umorali come l'endotelina, che è un potente vasocostrittore di origine endoteliale). La contrazione vascolare è più evidente nei vasi con parete muscolare ben definita e serve a ridurre momentaneamente la perdita di sangue.

Fase piastrinica

La lesione delle cellule endoteliali espone il tessuto connettivo sottoendoteliale altamente trombogenico, al quale le piastrine aderiscono entrando in uno stato di "attivazione", che comporta un cambiamento nella forma piastrinica e una reazione di esocitosi. I fattori che si liberano dai granuli piastrinici (ADP, TXA2, serotonina ed altri) reclutano ulteriori piastrine che aggregano sopra le prime, così da formare il tappo piastrinico. Tale reazione piastrinica avviene entro pochi minuti dalla lesione e, insieme alla vasocostrizione, costituisce la cosiddetta emostasi primaria. Se si tratta di lesioni capillari l'emostasi primaria è sufficiente a riparare il danno.

Fase coagulativa

Se si tratta di lesioni di vasi di calibro maggiore, l'esposizione di una superficie negativa e di fattore tessutale nel sito di lesione, insieme ai fattori piastrinici, attiva il sistema della coagulazione, che porta alla formazione di trombina. La trombina converte il fibrinogeno a fibrina, formando il coagulo di fibrina e stimolando un ulteriore reclutamento di piastrine. Tutto ciò richiede più tempo ed il processo viene definito emostasi secondaria. Viene quindi prodotto il tappo emostatico secondario o permanente. La fibrina polimerizzata e le piastrine formano una massa solida che tampona l'emorragia nel sito della lesione. L'emostasi è un processo di emergenza volto ad arrestare le perdite di sangue. È un meccanismo finemente controllato che tende a localizzare il coagulo nel sito della lesione, prevenendo così una reazione a catena (questa potrebbe provocare un'estesa coagulazione: la coagulazione di 1 ml di sangue produce trombina in grado di far coagulare il fibrinogeno presente in 3 litri di sangue).

Fase fibrinolitica

Una volta che la lesione vascolare è stata riparata si verifica la dissoluzione del coagulo stesso mediante il processo della fibrinolisi. Tutti i meccanismi deputati al mantenimento della fluidità del sangue e dell'integrità dell'apparato vascolare, per essere efficaci devono intervenire rapidamente e devono rimanere il più possibile confinati a livello della lesione. Questo obiettivo viene raggiunto mediante un complesso sistema di controllo ad opera di inibitori specifici sia dei fattori della coagulazione che della fibrinolisi. Tale sistema di controllo è complesso ed estremamente efficace e le concentrazioni plasmatiche delle molecole di controllo sono molto più elevate di quelle dei fattori sui quali agiscono.

Nell'organismo integro vi è sempre una certa attivazione del sistema emostatico. Infatti, anche in condizioni fisiologiche, non esiste un'assoluta integrità vascolare: continui microtraumi determinano minime lesioni endoteliali per cui una parte del fibrinogeno viene continuamente convertito in fibrina, viene cioè innescata la cosiddetta "emostasi fisiologica". In uno stato di equilibrio emostatico funzionale la fibrina viene continuamente rimossa mediante il processo della fibrinolisi. L'emostasi fisiologica risulta da un equilibrio fra i meccanismi favorenti il processo emostatico nella sua generalità ed i sistemi ad esso antagonisti. Lo spostamento dell'equilibrio nel senso di un aumento o di una diminuzione dell'attività emostatica ha importanti conseguenze patologiche.

Nonostante le alterazioni dell'emostasi possano essere dovute a numerose cause e seguire molte vie patogenetiche, le manifestazioni cliniche finali si possono ricondurre a due quadri fondamentali:

• Una incontrollata attivazione intravasale dell'emostasi, che dà luogo a manifestazioni trombotiche: malattie trombotiche
• Un deficit del sistema emostatico, che dà luogo a manifestazioni emorragiche: malattie e sindromi emorragiche

Meccanismi fisiologici dell'emostasi

Fase vascolare

Il primo evento che si verifica nell'emostasi è una contrazione vascolare a livello della zona lesa (schema 3). I meccanismi di vasocostrizione sono più efficienti nei vasi dotati di una spessa tunica vascolare con presenza di cellule muscolari lisce (tunica media), ma avvengono anche a livello dei capillari ad opera di proteine contrattili presenti nelle cellule endoteliali. La vasocostrizione è dovuta a vari fattori:

• Risposta diretta delle fibrocellule muscolari allo stiramento provocato dal trauma
• Riflesso neurovegetativo vasomotore (stimolazione dei nerva vasorum)
• Liberazione locale di sostanze vasocostrittrici ad opera prima delle cellule endoteliali (endotelina, polipeptide di 21 amminoacidi, la cui secrezione è inibita dal flusso turbolento del sangue, in condizioni fisiologiche) e, in fase più tardiva, dalle piastrine (liberazione della serotonina contenuta nei granuli delta)

Questo processo sarebbe di scarsa utilità se non intervenissero le piastrine, con i processi di adesione, aggregazione e liberazione di vari fattori dai granuli e, in caso di lesioni estese, il sistema della coagulazione. La fase vascolare è comunque estremamente importante (soprattutto in caso di lesione dei grossi vasi) perché:

• Permette di ridurre il deflusso di sangue attraverso il vaso danneggiato, riducendo in tal modo l'entità dell'emorragia
• Favorisce i fenomeni di marginazione delle piastrine, con conseguente loro attivazione (fase piastrinica dell'emostasi)
• Favorisce l'accumulo locale dei fattori della coagulazione attivati in seguito alla esposizione del tessuto sottoendoteliale o in seguito alla liberazione della tromboplastina tessutale (fase della coagulazione)

Fase piastrinica

L'endotelio veniva in passato considerato come una semplice barriera non trombogenica, negli ultimi anni invece si è dimostrato che l'endotelio è un tessuto metabolicamente attivo, che, a seconda del suo stato funzionale, può o favorire o inibire l'emostasi. In stato di quiescenza l'endotelio è in grado di assicurare la fluidità del sangue mediante un complesso meccanismo anticoagulante mentre, in seguito ad una lesione, la perdita della cellula endoteliale costituisce il punto di avvio del processo di emostasi localizzata, attraverso l'induzione coordinata di attività pro-emostatiche che iniziano con l'adesione piastrinica.

Le piastrine o trombociti sono cellule secretrici senza nucleo, a forma discoidale, di dimensioni comprese fra 1 e 4µm di diametro e di 1µm di spessore, che circolano nei vasi senza aderire alla parete vascolare (schema 4). Nel soggetto normale il numero delle piastrine varia da 150.000 a 400.000/mm³. Si parla di piastrinopenia o trombocitopenia quando il numero delle piastrine è inferiore a 100.000/mm³ e di piastrinosi o trombocitosi per valori superiori a 500.000/mm³. Le piastrine sono frammenti citoplasmatici di una cellula progenitrice midollare multinucleata, il megacariocita. La trombopoiesi o piastrinopoiesi è regolata da un fattore presente nel siero, la trombopoietina, che è in grado di aumentare non solo la produzione di piastrine, ma anche la proliferazione dei megacariociti. Anche l'interleuchina-11 (IL-11) ha attività trombopoietica. La produzione di piastrine può aumentare notevolmente (7-8 volte) in seguito ad attivazione dell'emostasi o a stimolazione del midollo. Le piastrine appena immesse in circolo sono più grandi ed hanno un'attività emostatica maggiore rispetto alle piastrine circolanti mature. Le piastrine sopravvivono in circolo per circa 10-12 giorni (emivita 5-6 giorni) e successivamente vengono sequestrate dagli organi emocateretici (principalmente dalla milza e dal fegato), dove vengono fagocitate dalle cellule del sistema dei fagociti mononucleati.

La loro forma è controllata dal citoscheletro e in particolare da un fascio circonferenziale di microtubuli, situato all'equatore del disco, e da microfilamenti contrattili ancorati alle membrane cellulari. A parte l'assenza del nucleo, sono presenti tutti i principali componenti subcellulari, mitocondri, granuli di glicogeno, lisosomi. La membrana plasmatica è rivestita all'esterno da un caratteristico strato di polisaccaridi e lipo/glicoproteine, detto glicocalice. Del glicocalice fanno parte i recettori, che mediano le più importanti funzioni piastriniche e tutte le glicoproteine coinvolte nell'adesione e nell'aggregazione (schema 4a). Alla membrana piastrinica è associata una attività procoagulante, il cosiddetto fattore piastrinico 3 (si tratta dei fosfolipidi della membrana piastrinica, i quali forniscono la fase solida sulla quale avvengono le interazioni fra i vari fattori della coagulazione, quando la cascata coagulativa viene attivata). Nelle piastrine la membrana plasmatica si introflette a formare un sistema di invaginazioni, che costituiscono il sistema canalicolare aperto, che determina un aumento di superficie per gli scambi con l'esterno e, quindi, una rapida via di secrezione dei granuli al momento dell'attivazione piastrinica. Tra le membrane interne è molto importante il reticolo endoplasmatico liscio, detto anche sistema tubulare denso, che rappresenta la principale riserva di calcio non mitocondriale coinvolto nella risposta piastrinica.

Le piastrine contengono tre tipi di granuli (schema 4b): lisosomi, granuli densi (detti anche granuli delta) ed alfa-granuli. Il contenuto di questi ultimi due viene secreto durante la risposta piastrinica, attraverso il sistema canalicolare aperto o attraverso la membrana plasmatica, direttamente nel microambiente sede dell'aggregazione piastrinica. I granuli densi rappresentano il sito di deposito dei nucleotidi adenilici, contengono anche serotonina e sono meno numerosi degli alfa-granuli. Questi ultimi contengono proteine specifiche delle piastrine, che possono essere suddivise in proteine adesive, modulatori positivi e negativi della crescita cellulare e fattori della coagulazione e della fibrinolisi. Gli alfa-granuli contengono anche la beta-tromboglobulina, che è un inibitore della sintesi di prostaciclina endoteliale, rilasciata in fase di attivazione.

Fasi della risposta piastrinica

In seguito al danno vascolare, le piastrine sono esposte al sottoendotelio, cioè collageno, proteoglicani, fibronectina ed altre glicoproteine e questo ne determina l'attivazione. La risposta piastrinica comporta mutamenti di ordine biochimico, strutturale e morfologico delle piastrine stesse (schema 5). La risposta delle piastrine ad uno stimolo è dovuta all'intervento coordinato della membrana, dei granuli e del citoscheletro e può essere suddivisa in varie fasi che tendono a sovrapporsi:

• Adesione e attivazione
• Cambiamento di forma (shape change)
• Secrezione dei granuli (release reaction)
• Aggregazione

Adesione ed attivazione piastrinica

Per adesione si intende la capacità delle piastrine di legarsi al sottoendotelio esposto in seguito al danno endoteliale, essenzialmente al collageno. Ciò determina l'attivazione piastrinica con innesco delle vie di trasduzione del segnale (vedi risposta biochimica). Le piastrine circolanti, in conseguenza alla riduzione della velocità del flusso sanguigno, secondaria ai fenomeni di vasocostrizione della fase vascolare dell'emostasi, si spostano dal centro alla periferia del vaso ("marginazione delle piastrine") e possono quindi con più facilità aderire alle strutture esposte in seguito alla lesione vasale.

Il processo di adesione, come pure l'aggregazione piastrinica, dipende dalla presenza di molecole di adesione presenti sulla superficie delle piastrine, che, per la maggior parte, appartengono alla superfamiglia delle integrine (schema 4a). Le integrine sono molecole composte da due catene peptidiche unite da un legame non covalente, denominate alfa e beta. Esistono vari tipi sia di catene alfa che di catene beta: la diversità fra le integrine è data dalle varie combinazioni delle differenti isoforme delle due catene. Alcune di queste molecole sono presenti in forma funzionale sulle piastrine circolanti: è il caso dell'integrina GPIa/GPIIa (detta anche VLA2: "very late antigen") che ha la capacità di legarsi al collageno. È quindi funzionalmente inerte quando l'endotelio è integro, ma inizia l'adesione piastrinica al sottoendotelio quando il collageno è esposto come conseguenza di una lesione endoteliale. Anche altre molecole di adesione partecipano a questo processo legandosi ad altre molecole presenti nel sottoendotelio, come la fibronectina e la laminina (GPIc/IIa o VLA-6, che si lega alla laminina e GPIc*/IIa o VLA-5, che si lega alla fibronectina). Questo iniziale processo di adesione non è però sufficiente a impedire la rimozione delle piastrine adese da parte della corrente sanguigna.

Perché si abbia una adesione più stabile è necessario l'intervento di un'altra molecola di adesione, che non è un'integrina ma una glicoproteina ricca di leucina, denominata GPIb. Questa ha la capacità di legare un fattore solubile chiamato, dal nome del suo scopritore, "fattore di von Willebrand" (schema 6). Questo fattore è normalmente presente nel plasma sanguigno (dove assolve la funzione di veicolare il fattore VIII della coagulazione sanguigna: per questa sua proprietà è chiamato anche fattore VIII-R (dove la lettera R sta per "related", cioè correlato), ma è anche molto abbondante a livello della zona di lesione endoteliale, dal momento che è prodotto dalle cellule endoteliali (nelle quali è normalmente presente all'interno dei corpi di Weibel-Palade), e costituisce, interagendo con il collagene esposto, un ponte fra la molecola GPIb delle piastrine ed il sottoendotelio. Rappresenta perciò una specie di collante. Tale fattore è secreto in forma di multimero (peso molecolare superiore a 1 x 10⁶ Da).

È ovvio quindi che esistono diversi recettori piastrinici che, direttamente o indirettamente, mediano l'adesione piastrinica al collageno e ad altre molecole delle membrane basali. Alcuni dati dimostrano che anche la proteina adesiva trombospondina (TSP) è importante nella adesione piastrinica, in quanto serve da collante per la interazione tra il collageno e la GPIV (precedentemente identificata come GPIIIb), presente sulla superficie delle piastrine. È importante sottolineare che le interazioni tra collageno, proteine adesive (vWF, TSP, fibrinogeno) e superficie piastrinica, vengono "stabilizzate" dal "cross-linking" operato dal fattore XIII della coagulazione.

Cambiamento di forma delle piastrine

Con l'adesione delle piastrine al sottoendotelio nel punto di lesione viene generata una cascata di segnali che porta al cambiamento di forma delle piastrine stesse ed alla reazione di rilascio del contenuto dei granuli piastrinici (schema 7). Il cambiamento di forma consiste in una veloce trasformazione dalla classica forma discoidale della piastrina circolante a riposo ad una forma irregolarmente sferica, con pseudopodi, dapprima corti, poi sempre più lunghi, fino a rendere possibile il contatto tra piastrine vicine, assumendo un aspetto a sfera spinosa (spiny sphere). In questo fenomeno è coinvolta la maggior parte delle molecole del citoscheletro: si ha la destrutturazione del fascio equatoriale dei microtubuli e la loro parziale depolimerizzazione, seguita da polimerizzazione e contrazione dei filamenti di actina associati alle membrane.

Il cambiamento di forma è strettamente dipendente dall'ATP (alterazioni della funzione piastrinica sono infatti presenti nei soggetti con malattie genetiche che alterano la fosforilazione ossidativa). Se lo stimolo che ha attivato la piastrina è stato debole o di breve durata, questa riacquista rapidamente la morfologia iniziale ed è del tutto indistinguibile morfologicamente dalla piastrina che non è stata mai attivata. Le piastrine che ritornano allo stato morfologico iniziale possono non rispondere, per un certo periodo di tempo, ad una seconda stimolazione, nemmeno se questa è di maggiore intensità rispetto alla prima ("refrattarietà piastrinica": probabile meccanismo di controllo, che tende ad autolimitare il processo di attivazione piastrinica). Se invece lo stimolo di attivazione è più forte, al cambiamento di forma seguono altri fenomeni, come la reazione di rilascio del contenuto dei granuli e l'aggregazione. Dal punto di vista funzionale il cambiamento di forma ha una conseguenza importante: rende "disponibile" a livello della membrana piastrinica il Fattore Piastrinico 3 (F.P.3). Il F.P.3 è un fosfolipide (fosfatidilserina) che, nella piastrina a riposo, &