Patologia diagnostica ematologica

Emopoiesi: processi e funzioni

L'emopoiesi è l'insieme dei processi che regolano il mantenimento del numero fisiologico di cellule circolanti del sangue in condizioni di omeostasi e intervengono come compenso in situazioni di perdita o distruzione oppure intervengono per rispondere in maniera adeguata a un aumento della richiesta da parte dell'organismo. Ad esempio, in caso di sanguinamento (cioè di perdita di globuli rossi) avviene un rapido aumento dei reticolociti, cioè globuli rossi giovani immaturi, entro le 24 ore. Oppure, in caso di appendicite acuta o infezione avviene un rapido aumento dei globuli bianchi, in particolare dei neutrofili, per rispondere in maniera adeguata contro i patogeni.

Produzione cellulare nel midollo

A livello del midollo vengono prodotti miliardi di cellule al giorno, il cui numero varia in funzione dell'emivita delle singole cellule:

• Globuli rossi: 120 giorni
• Piastrine: 8-11 giorni
• Globuli bianchi: 10-12 ore nel sangue, qualche giorno nei tessuti
• Linfociti: da alcuni giorni a qualche mese
• Linfociti della memoria: alcuni anni

Fasi embrionali dell'emopoiesi

Durante lo sviluppo embrionale si presentano varie fasi di emopoiesi portate avanti da organi diversi:

• Sacco vitellino (2^o - 9^o settimana)
• Fegato (9^o - 24^o settimana)
• Milza (10^o - 24^o settimana)
• Midollo osseo (dalla 20^o settimana e perdura dopo la nascita)

La funzione ematopoietica nell’adulto viene svolta principalmente dal midollo osseo che si trova a livello delle ossa lunghe (sterno e coste) e delle ossa piatte (soprattutto bacino e vertebre), ma si registra una progressiva restrizione di sede alle ossa piatte durante la maturazione dell’individuo.

Patologie e interventi emopoietici

In alcune condizioni patologiche in cui il midollo osseo è insufficiente o inattivo nel processo di emopoiesi, quali talassemie e mielofibrosi, si verifica un intervento all’interno dell’emopoiesi da parte del fegato e della milza; nella talassemia è frequente un’attività emopoietica nel tavolato cranico ("cranio a spazzola") e nel femore.

N.B. vi sono numerose similitudini fra il topo e l’uomo per quanto riguarda l’attività emopoietica anche se nel topo adulto la milza rimane emopoietica mentre nell'uomo diventa linfopoietica.

Processi di differenziazione cellulare

Il processo emopoietico inizia con una cellula staminale HSC che dà origine a MMP (progenitore multipotente) che a sua volta dà origine a CLP (progenitore della linea linfoide) e CMP (progenitore della linea mieloide):

• CMP dà origine a GMP (progenitore granulocitario-monocitario), da cui si originano i granulociti polimorfonucleati ed i monociti, ed a MEP (progenitore eritroide-magacariocitario), il quale dà origine a un membro della serie eritroide e un membro della serie megacariocitaria.
• CLP dà origine alle cellule NK, ai linfociti T, ai linfociti B, ai macrofagi e alle cellule dendritiche.

N.B. Ogni nodo decisionale è fatto per scelte binarie nella gran parte dei casi.

Le cellule staminali presentano una grande plasticità funzionale che viene progressivamente persa durante la maturazione a elementi maturi, ma è accompagnata da un aumento progressivo della specializzazione funzionale e da un aumento nel numero delle cellule. Contrariamente a quanto si possa pensare l'attività mitotica non è massima nelle cellule staminali (le quali si dividono a un tasso non elevato con meccanismo di mitosi asimmetrica: una cellula figlia mantiene il pool di cellule staminali mentre l'altra va incontro a differenziamento) ma bensì aumenta raggiungendo il suo massimo nei precursori in modo che il sistema possa intervenire rapidamente per garantire l’omeostasi.

La quantità dei precursori è sempre in eccesso rispetto al numero delle cellule mature (sistema a perdita) quindi in caso di mancato bisogno vanno incontro ad apoptosi e muoiono mentre, in caso contrario, alcuni fattori di crescita inibiscono l'apoptosi e ne permettono la maturazione. La bassa incidenza di tasso mitotico a livello delle cellule staminali garantisce una copertura dalle mutazioni genetiche che altrimenti avverrebbero in caso di elevato numero di duplicazioni.

Problemi delle cellule staminali neoplastiche

N.B. questa situazione può essere considerata sfavorevole in casi di cellule staminali neoplastiche in quanto i principali farmaci che abbiamo a disposizione sono diretti verso cellule in proliferazione e quindi non hanno un grande effetto sulle staminali. Inoltre, con l’avanzare dell'età, il numero di cellule staminali diminuisce a causa di eventi di apoptosi o nel caso in cui entrambe le cellule vadano incontro a differenziazione.

Le cellule staminali ematopoietiche CD34+ sono localizzate principalmente a livello di:

• Midollo osseo (1-2%)
• Sangue periferico (0,05%)
• Sangue cordonale (0,3-0,5%)

N.B. Nei pazienti in cui viene prelevato midollo osseo in misura di 2 litri, si attiva un meccanismo di espansione che permette il ripristino del numero di cellule nel giro di qualche mese, infatti in seguito a radiazione sub-letale di un organismo, le cellule staminali reimmesse possono ripristinare il pool e scongiurare la condizione di aplasia.

Mobilizzazione e homing delle cellule staminali

Con il termine mobilizzazione si indica la capacità della cellula staminale di passare in condizioni fisiologiche dal midollo osseo al sangue periferico per una certa proporzione. Inoltre, il fenomeno della mobilitazione viene aumentato dai trattamenti chemioterapici indirizzati a qualsiasi tumore oppure nel caso di un paziente sano donatore di midollo osseo il tasso di cellule staminali circolanti nel sangue periferico viene aumentato mediante la somministrazione di G-CSF (= granulocyte colony – stimulating factor).

Con il termine homing si indica la tendenza delle cellule di tornare a posizionarsi a livello del midollo osseo dove è presente la nicchia emopoietica, che rappresenta il posto migliore per le cellule staminali in quanto è formata da varie tipologie di cellule che secernono fattori per il processo proliferativo e maturativo delle cellule di tutta la linea emopoietica (vengono riconosciute dalle cellule staminali grazie alla presenza di recettori e di ligandi specifici). È grazie a questa particolare caratteristica delle cellule staminali che il trapianto di esse viene effettuato nel sangue periferico e non nella sede naturale.

Eritrociti

Gli eritrociti o globuli rossi sono elementi figurati del sangue privi di organuli cellulari quali il nucleo ed i mitocondri, ma il loro citoplasma è ricco di emoglobina e di enzimi. Presentano un diametro di circa 7,5 µm e una forma a lente biconcava con uno spessore di 2 µm alla periferia e di 1 µm nella porzione centrale (questa forma assicura un miglior scambio gassoso e la plasticità morfologica per adattarsi in maniera ottimale alla variazione di calibro dei vasi sanguigni).

Vengono prodotti a partire dalla cellula staminale HSC CD34+ e seguono prima la diramazione della linea mieloide e poi la linea eritroide-magacariocitaria fino a formare gli eritroblasti in cui si verificano le principali modificazioni quali la sintesi delle proteine necessarie, l’accumulo di emoglobina e l’espulsione del nucleo per formare il reticolocita che poi maturerà in un eritrocita. I globuli rossi presentano un’emivita di circa 120 giorni e poi vengono degradati a livello dei macrofagi della milza, del fegato o del midollo osseo rosso in modo che le globine vengano degradate ad amminoacidi, il ferro venga sequestrato dalla transferrina per essere riciclato ed il gruppo eme viene catabolizzato in bilirubina ed escreto.

La regolazione della proliferazione e della maturazione dei globuli rossi è dovuta all’ormone eritropoietina che viene prodotto dalle cellule renali in risposta a una diminuita tensione di O₂ nel sangue. L’eritropoietina permette la maturazione dei precursori eritroidi in quanto essi presentano sulla superficie cellulare il recettore specifico per l’eritropoietina (è una glicoproteina di membrana dal peso di 66-78 kDa espressa approssimativamente nell’ordine delle 1000 unità dai progenitori precedenti al reticolocita), che è un recettore a tirosino chinasi associato ad una trasduzione mediata da JAK2 e STAT.

N.B. L’eritropoietina viene utilizzata anche come farmaco in dialisi ed interventi chirurgici ortopedici per aumentare il numero di globuli rossi circolanti.

N.B. Nella nicchia ematopoietica sono presenti anche fattori di trascrizione per i processi di proliferazione e maturazione (es. GATA-1, GATA-2, FOG1, c-Myb ed EKLF).

Leucociti

I leucociti o globuli bianchi comprendono una serie di cellule derivanti dalla linea linfoide:

• Granulociti polimorfonucleati neutrofili, che presentano un nucleo polilobato (50-70%)
• Granulociti polimorfonucleati eosinofili (2-4%)
• Granulociti polimorfonucleati basofili (0,5-1%)
• Monociti, che sono i precursori circolanti dei macrofagi (3-8%)
• Linfociti T e B (25-45%)

Serie granulocitaria

La serie granulocitaria ha origine da un mieloblasto che presenta un nucleolo immaturo e privo di granulazioni, il quale evolve in un promielocita assumendo la granulazione e poi in un mielocita in cui si ha la scomparsa del nucleolo; in seguito si ha la trasformazione in un metamielocita in cui è evidente un'indentazione del nucleo fino alla maturazione nel granulocita polimorfonucleato circolante.

Formula leucocitaria

• Neutrofili: 1,50 – 7,50 x 10⁹/L - 37 – 75 %
• Eosinofili: 0 – 0,7 x 10⁹/L - 0 – 7 %
• Basofili: 0 – 0,2 x 10⁹/L - 0 – 2 %
• Linfociti: 0,50 – 5,00 x 10⁹/L - 12 – 50 %
• Monociti: 0,03 – 1,20 x 10⁹/L - 3 – 12 %

Piastrine

Le piastrine sono cellule anucleate circolanti che derivano dalla linea eritroide-megacariocitaria in cui si ha lo sviluppo di un megacarioblasto dal citoplasma basofilo che evolve prima in un promegacariocita e poi in megacariocita granulare in cui si verifica un’endomitosi, cioè un meccanismo di pseudo-divisione che prevede la duplicazione del materiale genetico senza divisione del citoplasma (formazione di una cellula poliploide molto grande); il megacariocita raggiunge la sua maturazione mediante un aumento del volume citoplasmatico per poi frammentarsi in centinaia di piastrine.

L’avanzamento e la regolazione del processo maturativo del megacariocita sono dovuti alla presenza dell’ormone trombopoietina che viene prodotto dal fegato in maniera costitutiva: la trombopoietina si lega a specifici recettori presenti sulle membrane dei precursori megacariocitari.

N.B. in condizioni fisiologiche in cui il numero di piastrine è adeguato, la trombopoietina viene sequestrata dalle piastrine stesse grazie a particolari recettori secondo un meccanismo a sottrazione per evitare che raggiunga il midollo osseo, mentre in caso di piastrinopenia, la mancanza del numero sufficiente di piastrine permette la migrazione dell’ormone fino al midollo osseo dove è possibile indurre la proliferazione e la maturazione dei progenitori della linea megacariocitaria. Le piastrine presentano un’emivita di circa 8-11 giorni e si ritrovano per il 70% a livello circolante e per il 30% a livello splenico dove vengono degradate.

Esame emocromocitometrico

• WBC (globuli bianchi): 4 - 10 x 10⁹/L
• RBC (globuli rossi): 4,5 - 6,10 x 10¹²/L
• Hb (emoglobina): 14 – 18 g/dL
• Htc (ematocrito): 42 – 52 %
• MCV (volume corpuscolare medio): 81 – 94 fL
• MCH (contenuto medio di Hb): 26 – 32 pg
• MCHC (concentrazione cellulare media di Hb): 32 – 36 g/dL
• RDW-CV (ampiezza di distribuzione dei globuli rossi): 11,8 – 14,8 %
• Plt (piastrine): 140 – 440 x10⁹/L
• MPV (volume piastrinico medio): 8 – 13 fL

Condizioni cliniche associate

• Anemia: riduzione del livello di emoglobina al di sotto del range di normalità.
• Leucopenia: riduzione del numero di leucociti totali al di sotto del range di normalità (quando ci si riferisce alle singole tipologie di leucociti si utilizzano i termini neutropenia, linfocitopenia, monocitopenia, eosinopenia e basopenia).
• Piastrinopenia: riduzione del numero delle piastrine al di sotto del range di normalità.
• Eritrocitosi o policitemia: aumento del livello di emoglobina o del valore ematocrito Htc al di sopra del range di normalità.
• Leucocitosi: aumento del numero dei leucociti totali al di sopra del range di normalità (quando ci si riferisce alle singole tipologie di leucociti si utilizzano i termini neutrofilia, linfocitosi, monocitosi, eosinofilia e basofilia).
• Piastrinosi o trombocitosi: aumento del numero delle piastrine al di sopra del range di normalità.

Biopsia osteomidollare ed aspirato midollare

La biopsia osteomidollare e l’aspirato midollare sono due esami utilizzati per la valutazione della struttura del midollo osseo e delle cellule in esso presenti (viene eseguito in associazione ad emocromo e allo striscio di sangue). Attraverso la biopsia osteomidollare è possibile ottenere il midollo, parte dell’osso e le cellule stromali in modo da valutare la cellularità emopoietica e le reazioni citochimiche mediante colorazioni e immunoistochimica. Questa procedura viene effettuata solo a livello del bacino, soprattutto a livello della cresta iliaca posteriore superiore ed in alcuni casi a livello della cresta iliaca anteriore.

Attraverso l’aspirato midollare è possibile ottenere tessuto midollare su cui effettuare colorazioni di routine, reazioni citochimiche e la reazione di Perls (colorazione con blu di Prussia per mettere in evidenza il ferro), nonché esami di natura citogenetica e di biologia molecolare. Questa procedura può essere effettuata a livello della cresta iliaca posteriore superiore, della cresta iliaca anteriore e a livello del manubrio sternale (solitamente oggi si tende ad effettuare queste procedure insieme).

Procedure operative

1. Detergere e anestetizzare la cute ed il tessuto sottocutaneo.
2. Localizzare la cresta iliaca e inserire l’ago da biopsia perpendicolarmente alla superficie dell’osso mentre il paziente è in posizione prona o in decubito laterale.
3. Far avanzare l’ago attraverso lo strato corticale dell’osso (periostio) e spingere l’ago con un movimento di torsione per almeno 2 cm.

Per effettuare l’aspirato è necessario rimuovere lo stiletto e inserire una siringa in modo da aspirare parte del tessuto midollare (per ottenere grandi quantità di midollo osseo è necessario aspirare per pochi ml in molti punti dell’osso in quanto dopo poco tempo si effettua una contaminazione da parte del sangue periferico). Per effettuare la biopsia è necessario avanzare di altri 3 cm, avvitare l’ago per catturare il midollo osseo e con movimenti laterali lussare l’osso contenuto nell’ago ed estrarre lentamente.

Striscio di sangue

Per effettuare uno striscio di sangue è necessario:

1. Mettere goccia su un vetrino
2. Porre un altro vetrino con angolatura di circa 60° e strusciarli in senso longitudinale in modo che la goccia si distribuisca uniformemente.

Per effettuare uno striscio di midollo osseo è necessario:

1. Spruzzare il liquido dell’aspirato su un vetro posto in posizione obliqua in modo che il sangue possa scorrere via mentre i fustolini possano rimanervi adesi.
2. Prendere il vetrino in senso orizzontale e porvi sopra un altro vetrino.
3. Effettuare uno strusciamento longitudinale dell’uno sull’altro e poi togliere un vetrino strisciandolo in modo da dividere le cellule in maniera corretta.

Trapianto di cellule staminali emopoietiche

Il trapianto di cellule staminali emopoietiche è una procedura basata sulla capacità di automantenimento, ricostruzione a lungo termine e differenziazione terminale delle cellule staminali emopoietiche pluripotenti; viene utilizzato quando il numero di cellule staminali a livello midollare è piccolo in modo da permettere una reimmissione di cellule ("medicina rigenerativa") e da ricostituire la normale funzione del midollo nel caso di patologie a carico della cellula staminale emopoietica stessa o malattie neoplastiche in cui si verifica l'occupazione del tessuto osseo.

Le cellule staminali vengono impiegate in molti ambiti della medicina per la cura di malattie di molti organi grazie alla loro capacità di transdifferenziare. Le cellule staminali vengono quasi esclusivamente prelevate dal sangue periferico in seguito a reclutamento mediante somministrazione di G-CSF, dal midollo osseo stesso oppure dal sangue del cordone ombelicale; queste cellule possono essere, inoltre, trattate con il meccanismo di "purging" in caso di autotrapianto per eliminare le cellule malate da quelle normali attraverso l’utilizzo di farmaci o anticorpi specifici in vitro (meccanismo poco efficiente) oppure, in caso di allotrapianto da donatore sano possono essere eliminati i linfociti T che rappresentano la principale causa di rigetto.

Tipologie di trapianto

• Trapianto autologo, in cui vengono prelevate cellule staminali dal paziente; viene impiegato in tutte le malattie neoplastiche del tessuto emopoietico, in alcune forme di talassemia e in rari difetti congeniti del metabolismo (come ad esempio la mucopolisaccaridosi), ma è in forte crescita il suo utilizzo in caso di malattie autoimmuni e tumori solidi chemiosensibili (in quanto con l’impianto di cellule staminali è possibile aumentare la dose di farmaci chemioterapici in modo da permettere una migliore eliminazione delle cellule tumorali senza che questo aumento di dose non faccia morire il paziente per aplasia midollare).
• Trapianto allogenico, in cui vengono prelevate cellule staminali da donatore familiare, da donatore non familiare o da un individuo singenico (es. gemelli omozigoti).

Per effettuare un trapianto allogenico è necessario controllare il grado di compatibilità del sistema HLA tra donatore e ricevente.