Riassunto Patologia clinica

Biologia della Salute, unibo FM

TEST GENETICI

Test genetici: analisi di geni (RNA, DNA, cromosomi, ecc) o del loro prodotto/funzione finalizzata ad individuare o

escludere mutazioni associate a patologie. Riguardano non soltanto il singolo individuo che si sottopone al test ma tutta

la line biologica. Questi test rientrano fondamentalmente in 4 categorie: diagnosi sintomatica o presintomatica, test di

suscettibilità, test prenatali (per patologie ereditarie) e test farmacogenetici.

Interessando un’intera linea biologica, possiamo trovare due diversi approcci con cui si trattano i dati degli interessati:

approccio eccezionalistico (i dati genetici sono considerati patrimonio intimo dell’individuo e fortemente discriminanti,

proprio per questa peculiarità vengono adottate alcune accortezze, come consulenza genetica e pseudoanonimizzazione

dei dati) oppure inclusivistico (i test genetici sono considerati come tutti gli altri test, è solo previsto un consenso

informato per procedere nessun’altra accortezza).

Distinguiamo 2 diversi macrogruppi di test:

- Molecolari → test con approcci tradizionali, permettono la diagnosi della maggior parte delle malattie

- Biochimici

ereditarie o per lo meno delle più frequenti

Noi ci concentreremo sui test molecolari. Perché un individuo sia significativo nei test genetici deve essere eterozigote.

I marcatori che sono stati selezionati sono locus altamente polimorfici, ovvero sono presenti nella popolazione degli

alleli con una frequenza maggiore a 1% (siccome esistono questi alleli in forme diversi, perché appunto sono

c’è la probabilità che nell’individuo in analisi questi siano in eterozigosi)

polimorfici, (se la frequenza è < 1% allora si

parla di varianti rare).

I marcatori che utilizziamo più frequentemente sono i microsatelliti o VNTR: vado a vedere quante volte i 2/3 nt si

ripetono (il numero di ripetizioni di questi di- e trinucleotidi rappresenta i diversi polimorfismi). Per riconoscerli e

valutarne la lunghezza mi basta amplificare con PCR e fare elettroforesi.

In alternativa si possono usare gli SNP che sono ripetizioni a singolo nucleotide. Questi sono più frequenti lungo il

genoma (1 ogni 1kb VS 1 ogni 10kb dei VNTR) ma hanno il difetto di essere più raramente in eterozigosi; studiando

però più SNP in associazione tra loro possono trovare degli aplotipi in eterozigosi nella popolazione (più utili). Hanno il

vantaggio di essere automatizzabili o posso lavorare su grandi numeri grazie alle tecniche di sequenziamento o di

mutation scanning.

TEST GENETICI INDIRETTI

Vado a ricercare un marcatore che so segregare insieme al gene malattia nella famiglia in esame (sono analisi di

linkage, ormai in disuso per lo sviluppo di test diretti). Utilizzo i marcatori (VNTR o SNP) sopra indicati. Ho alcuni

limiti:

- Questo tipo di test non può essere applicato a singoli individui, anzi mi servono famiglie quanto più ampie

possibili e se mi mancano gli aplotipi di alcuni elementi chiave posso non cavarci un ragno dal buco

C’è il problema della ricombinazione genica: tendenzialmente però, più due locus sono vicini (polimorfismo

- e

mutazione) e meno sarà probabile che avvenga ricombinazione ma mai dire mai (1 cM di distanza genica

significa che c’è 1 evento di ricombinazione su 100 meiosi)

Un altro grosso problema è quello dell’eterogeneità genetica, che consiste nel fatto che

- mutazioni a livello di

loci diversi possono avere lo stesso effetto fenotipico (esempio Alzheimer: può essere dovuta a mutazioni nel

gene presenilina1 oppure nel gene dell’APP). Un esempio di applicazione riguarda la ricerca della mutazione

del gene APDK nel rene policistico autosomico dominante (malattia autosomica dominante): per ricercare la

presenza o meno della mutazione so che vicino al gene APDK sul cromosoma 16 c’è un VNTR in linkage con

la mutazione; tuttavia però la mutazione può anche essere sul cromosoma 4 e determinare lo stesso fenotipo

patologico.

Anche se questo genere di test sta venendo soppiantato da quelli diretti, c’è un’applicazione ancora utilizzata che è

quella del parental exclusion testing (per la malattia di Huntington). È una malattia autosomica dominante ad

insorgenza tardiva caratterizzata da demenza progressiva (determinata da amplificazione di triplette per la glutammina

che quando superano una certa soglia causano la produzione di proteine tossiche per il SNC che si accumulano; il gene 1

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interessato è quello dell’huntingtonina sul cromosoma 4). In questo genere di test si valutano i cromosomi solo del

familiare non affetto.

TEST GENETICI DIRETTI dell’insorgenza della

Vado a ricercare direttamente le mutazioni responsabili (non singolarmente ma tutte insieme)

malattia che sto diagnosticando. Distinguiamo due diversi approcci:

- Ricerca di mutazioni note: sono mutazioni che mi aspetto di trovare in un individuo malato (esempio:

mutazioni del fattore V di Leiden associati alla trombofilia, predispongono ad eventi trombotici)

- Ricerca di mutazioni non note: non lo so a priori ma se le trovassi in un paziente malato potrei accorgermi

che causano la patologia (conosco il gene ma non so quale mutazione sia la causa della malattia)

TECNICHE PER LA RICERCA DELLE MUTAZIONI NOTE

- Se devo ricercare amplificazioni o delezioni di regioni cromosomiche posso procedere con PCR + elettroforesi

- Se devo ricercare mutazioni puntiformi ho 3 diverse tecniche da poter applicare:

o ARMS (amplification refractory mutation system)

o RDB (reverse dot blot)

o MLPA (multiplex ligation dependent probe amplification)

ARMS

È una tecnica PCR che prevede l’impiego di primers disegnati in modo tale che si ottenga un prodotto

dell’amplificazione a seconda che io abbia la sequenza wt o mutata. In pratica, metto un nucleotide determinante (è

l’appaiamento o meno, quindi l’identificazione) all’estremità 3’ del primer (dove la Taq

quello da cui dipende

polimerasi aggiunge nucleotidi, quindi se l’ultimo nt non appaia perfettamente (quindi al 3’ del primer) la polimerasi

se c’è

che deve ripartire da lì fa fatica e non amplifica. In alternativa, metto anche un mishmatch nella penultima base:

la sequenza giusta avremo un solo mismatch nella penultima base del primer e quindi la polimerasi con un calcio in

culo parte e dà l’amplificato; se invece c’è quella sbagliata allora in totale ne avremo due (il mio mismatch che ho

messo apposta e quello non complementare) ed è meno probabile che la Taq avanzi con l’amplificazione. Quindi, se

ottengo un amplificato so che c’è la sequenza wt altrimenti c’è una base mutata.

RDB

Amplifico il mio DNA campione con una miscela di primers (modificati con biotina o fluorescina; oppure amplifico

con nt modificati), in particolare vado ad amplificare quelle sequenze dove so che possono cadere le mutazioni. Nel

momento in cui il DNA viene amplificato (faccio una multiplex PCR), vengono incorporati o i primers o con i nt

modificati dei segnali che ci permetteranno la rilevazione. Denaturo il DNA e lo pongo su strisce di nitrocellulosa o

per sequenze normali o wt; avremo ibridzione dove c’è

nylon su cui troviamo bloccate le nostre sonde specifiche

(visualizzo l’avvenuta ibridazione grazie ai marcatori che ho aggiunto).

perfetta complementarietà Esempio: test fibrosi

cistica con strip per19 mut, altra da 17 e ci sono anche altre 4/5 mut che sono regionali; in questo modo, con queste

strip so anche in che punti sono avvenute le mutazioni.

MLPA

Si basa sull’ibridazione di sonde sulla sequenza di interesse: la reazione è mediata dalla DNA ligasi e pertanto c’è

un’elevata specificità di accoppiamento. Disegno coppie di primer che sono specifiche o per la wt o per la sequenza

mutata e le faccio appaiare. Avvenuta la ligazione, ottengo un frammento di DNA unico (sarà legato covalentemente)

che verrà poi amplificato usando primer (sono gli stessi per entrambe le sequenze, alle estremità della sonda si trovano

le sequenze complementari proprio a questi primer). Riconosco la sequenza mutata sulla base del peso molecolare del

frammento ottenuto. Infatti, in fase di costruzione, alla sonda (per esempio) specifica per la sequenza mutata aggiungo

che farà si che l’amplificato della sequenza mutata

uno spaziatore abbiamo peso molecolare diverso; faccio poi

elettroforesi capillare. Ogni reazione può ricercare 50-100 reazioni. 2

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TECNICHE PER LA RICERCA DI MUTAZIONI NON NOTE

Appartengono tutte alla categoria dei test diretti. Le tecniche di NGS hanno facilitato tutto ma si continua a preferire

approcci che si avvicinano al sequenziamento classico precedute dal mutation scanning: seleziono dei frammenti di

DNA e li metto a confronto con uno che reputo wt. In questo modo posso identificare in maniera rapida e grossolana la

presenza di mutazioni o differenze tra i due (non per forza queste mutazioni sono patologiche, magari sono solo

polimorfismi, però intanto faccio una prima scrematura). Ricordiamo che una mutazione non nota è per definizione una

mutazione poco frequente. Due sono le tecniche utilizzate:

- DHPLC (denaturant high performance liquid cromatography)

- HRM (high resolution melting)

DHPLC

Applico tecniche cromatografiche liquide su prodotto di PCR. La fase fissa presente nella colonna cromatografica è

idrofobica (trattiene sostanze apolari o meno polarizzate) mentre quella mobile è formata da aceto nitrile (solvente). Il

tutto è realizzato in condizioni di quasi denaturazione, in cui il frammento amplificato PCR è quasi del tutto denaturato.

Se nel prodotto PCR sono presenti degli eteroduplex, per via della presenza di un mismatch all’interno (mutazione non

nota) e trovandosi in condizioni di quasi denaturazione, tenderanno a denaturarsi parzialmente, facendo si che siano

(hanno una carica) che normalmente sarebbero appaiate all’interno e in questo modo sono eluiti

esposte delle basi

prima. Quindi, se nell’amplificato c’è una mutazione, noi vedremo l’eteroduplex venire eluito prima (quindi ottengo

due picchi: uno prima che è quello dell’eteroduplex e uno dopo che è quello dell’omoduplex). Poi sequenzio il

frammento.

In questo modo, però, perderemmo tutte quelle mutazioni non note in omozigosi. Per far si che creino ugualmente

eteroduplex pure loro, mescolo il prodotto di amplificazione del soggetto in esame con il prodotto di amplificazione di

un soggetto sicuramente wt, lo denaturo e successivamente rinaturo: in presenza di mutazione ottengo inevitabilmente

anche degli eteroduplex.

HRM

Questa tecnica misura la fluorescenza di un amplificato quando questo viene colorato con coloranti per dsDNA (SYBR

green o EVA green); l’accoppiamento fluorescenza-quantità di amplificato avviene o tramite metodi diretti (coloranti) o

tramite le sonde (sonde di idrolisi o TaqMan). Quello che ottengo è una melting curve: il prodotto viene riscaldato fino

a che non si arriva alla T di melting, a quel punto la fluorescenza diminuisce bruscamente. Si sfrutta lo stesso principio

della RT-PCR solo che uso dei coloranti saturanti ed effettuo denaturazione rapida e rinaturazione prima di fare la curva

in modo che si formano gli eteroduplex (così mi accerto che qualsiasi mutazione vi sia, se già in eterozigosi o in

omozigosi, sia in un eteroduplex). Se ci sono frammenti con mismatch (eteroduplex) avremo una curva di melting

diversa, si denatureranno a T più basse. Quando si arriva alla temperatura di Melting si ha un aumento brusco della

velocità di cambiamento della fluorescenza e poi di nuovo, una riduzione; se c’è eteroduplex avrò due picchi.

Le tecniche NGS non necessitano del mutation scanning ma sono molto costose (se risparmio, prendo degli strumenti

piccoli che però hanno capacità di analisi limitata). Per ottimizzare i costi riduco la scala d’analisi, infatti esistono

solo l’esoma (riduco del 90% la quantità di reads necessarie).

sistemi che permettono di arricchire e sequenziare

Esistono tecniche che permettono di ibridare sequenze specifiche e poi amplificarle. I tre livelli di arricchimento a

livello diagnostico prevedono:

- Esoma

- Esoma clinico o diagnostico (sequenze trascritte dai 4800 geni che hanno un ruolo nelle malattie)

- Pannelli genici specifici di date malattie

Identificare una mutazione non basta per risalire alla malattia, bisogna valutarle tutte nel loro insieme e valutare l’intero

quadro clinico. In diagnostica si preferisce ricercare mutazioni note.

mostro l’intero genoma e le porzioni in cui sono posizionate le varie mutazioni (approccio utile

Con il CIRCOS plot

anche in caso di tumori, ci permette di confrontare il genoma del paziente con quello di un individuo sano). Le

mutazioni che spingono la cellula verso un’evoluzione neoplastica si chiamano “driver”. Se in una cellula che evolve in

senso neoplastico già c’erano delle mutazioni, queste sono trasportate durante il processo di trasformazione e sono

chiamate “passeggero”. 3

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Con la medicina di precisione vado a concentrarmi sulle specifiche mutazioni driver che si sviluppano in quel dato

paziente. Questo approccio riconosce l’importanza di queste mutazioni, inibendole si sa che ci sarà un effetto negativo

Nel tumore al polmone c’è spettro di

sulla crescita del tumore che può portare addirittura ad una sua regressione.

mutazioni presenti e note (risiedono in pathway molecolari in cui posso intervenire) e su alcune di queste posso

intervenire farmacologicamente. Il problema è che con questo trattamento poi subentrano mutazioni resistenti.

I farmaci utilizzati possono legare Ab, altri legano le tasche catalitiche degli enzimi e altri invece agiscono a livello del

nucleo e funzionano da fattori di trascrizione.

Questo approccio della medicina di precisione prevede però una caratterizzazione molecolare del tumore tramite

sequenziamento massivo. Poi elaboro i dati e una terapia e poi somministro il trattamento; devo continuare a monitorare

la risposta al trattamento per assicurarmi che non insorgano resistenze.

MARCATORI TUMORALI

Sono segnali di tipo biochimico la cui presenza o quantità può essere posta in relazione con la presenza di neoplasia; si

possono trovare nei fluidi biologici oppure nelle cellule/tessuti umani in soggetti affetti da tumore. Distinguiamo:

che possono essere prodotti dalla neoplasia oppure dall’ospite

- Marcatori tumorali presenti nei fluidi o umorali

- Marcatori tumorali espressi sulla cellula che possono essere citoplasmatici, nucleari o di superficie

Il problema è che questi marcatori magari aumentano anche per altre cause (fumo, alimentazione, età, ecc.) non per

forza per tumori, è quindi difficile stabilire un cut off. Tendenzialmente i marcatori servono per conferma e li posso

valutare o in maniera quantitativa e dinamica (variazioni nel tempo, tipo prima e dopo terapia) o li valuto in

Questi marcatori li vado ad usare in gruppi di pazienti selezionati, ovvero in cui c’è un sospetto

associazione. di rischio.

un’idea doso dopo l’atto terapeutico

Alla diagnosi li valuto per avere di quanto è esteso il tumore poi li per vedere se ha

avuto effetto e se il paziente risponde bene.

Lo studio dei marcatori ci servirà per identificare nei fluidi sequenze oncogeniche specifiche e Ab diretti contro

oncogeni o geni oncosoppressori per la diagnosi di neoplasie occulte ma ci servirà anche per identificare le cellule

tumorali circolanti e per identificare micrometastasi.

MARCATORI UMORALI

- Marcatori prodotti dalla neoplasia:

→ normalmente li troviamo in circolo durante la vita prenatale e, visto che le

o Prodotti oncofetali

cellule tumorali riacquistano delle caratteristiche tipiche delle cellule embrionali, le cellule tumorali le

producono. Tra questi abbiamo...

⁃ CEA (antigene carcino-embrionale): è un complesso di diverse glicoproteine appartenenti

alla superfamiglia delle Ig (quelle coinvolte nel riconoscimento cellulare) prodotto durante le

prime 6 sett di vita embrionale dalle cellule epiteliali di intestino, fegato e pancreas e regola

lo sviluppo fetale. La produzione di CEA anche se minima è continua durante tutta la vita,

può aumentare soprattutto nel siero dei pazienti con carcinomi del colon, della mammella,

del polmone e degli organi urogenitali (i carcinomi sono i tumori maligni delle cellule

epiteliali).

⁃ AFP (alfa1-globulina): è una proteina sintetizzata nel sacco vitellino a partire dal 4° mese

dal fegato fetale, dall’8° mese la sua concentrazione sierica diminuisce rapidamente in

corrispondenza ad una aumentata produzione di albumina; i valori calano fino ad assestarsi

ai 20 ng/ml a partire dal primo anno di vita. Può aumentare nel siero di pazienti con

epatocarcinomi, tumori germinali del testicolo e dell’ovaio, carcinomi embrionali del

teratomi e teratocarcinomi del testicolo e dell’ovaio.

testicolo,

→ li ritroviamo in circolo in caso di danno cellulare o di neoplasia...

o Enzimi

⁃ NSE (enolasi neurono specifica): enzima citoplasmatico della glicolisi espresso in elevata

quantità nelle cellule differenziate in senso neuronale o neuroendocrino, può aumentare nel

siero dei pazienti con neuroplastoma o con carcinoma polmonare a piccole cellule

⁃ PAP (fosfatasi acido prostatica): forma isoenzimatica della fosfatasi acida prodotta dalla

prostata, la cui concentrazione aumenta in caso di tumore alla prostata 4

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⁃ enzima presente nel citoplasma di quasi tutte le cellule, quindi dove c’è

LDH (lattico DH):

danno mi aspetto che venga rilasciato LDH. È un enzima stabile che mantiene la sua attività

anche in circolo. Esistono diverse isoforme, è un tetramero che può essere costituito da

diverse combinazioni delle due diverse subunit&ag