Modulo Prof. Galliera (esame: biotecnologie nella diagnostica di laboratorio e fondamenti di statistica)

PRINCIPI DI DIAGNOSTICA

Patologia clinica

BIOMARKERS

Un biomarcatore, in generale, è un indicatore che dà delle informazioni sulle condizioni di un soggetto

Non è necessariamente di tipo clinico

Può essere:

- indicatore di una patologia, quindi un marcatore diagnostico

può indicare anche la gravità

- indicatore dello stato di salute di un soggetto (temperatura corporea, pressione, battito cardiaco)

- indicatore di quanto una terapia sta funzionando

Forniscono delle informazioni di tipo non necessariamente clinico, ma anche di tipo fisiologico: danno informazioni sullo

stato di salute di un soggetto

I biomarcatori sono usati in diversi campi scientifici, possono essere applicati a diversi ambiti della medicina

Un biomarcatore deve avere delle caratteristiche precise

Esempi livello di glicemia nel sangue

⇾ utilizzato per la diagnosi e il monitoraggio del diabete, quindi sia a livello diagnostico che terapeutico

è anche un obiettivo clinico da raggiungere, il trattamento è corretto se riesce ad abbassare

consente di verificare la progressione e la funzionalità di una terapia

indagini strumentali come la risonanza magnetica, la TC e la radiografia

⇾ esempio: la risonanza magnetica può dare informazioni sulla progressione della sclerosi multipla

sostanze biologiche come gli enzimi che possono trovarsi nel sangue o in campioni tissutali, sono spesso

⇾ utilizzati per la diagnosi

cambiamenti genetici a livello del DNA

⇾

Scopi dell’utilizzo dei biomarcatori

1- Vengono utilizzati per migliorare il più possibile il trattamento clinico di un paziente

consentono di misurare la sua condizione e la sua risposta a un trattamento, servono degli strumenti che danno delle

risposte di tipo quantitativo

Se la risposta non può essere misurata direttamente, i biomarkers possono essere una via alternativa per misurare un

risultato clinico sono degli end points surrogati

⇾

consentono una misura indiretta, sono un’alternativa all’utilizzo di diagnosi strumentali che spesso sono invasive

esempio: per l’osteoporosi viene effettuata la misurazione dei marcatori di riassorbimento osseo evita la visualizzazione

dello stato del paziente mediante tecniche come la MOC (ha dei rischi e non può essere fatta total-body)

Vantaggi rispetto alla diagnosi strumentale dell’utilizzo di biomarker come end points surrogati:

- possono essere in grado fare misure più facilmente, più precocemente o più frequentemente mantenendo però

un’elevata precisione

- sono meno invasivi e richiedono una minor quantità di campione

- sono meno influenzati da altri trattamenti

La diagnosi strumentale è utile per fare la diagnosi, mentre non dà delle informazioni così sensibili per verificare la

risposta a una terapia da parte di un paziente

Vengono ricercati dei marcatori sierici che sono sensibili anche a cambiamenti minimi, sono utili per monitorare una

terapia

La terapia per il diabete viene monitorata in base al livello di glicemia del paziente

si verifica l’effetto della patologia (aumento di glucosio nel sangue) tramite una misura indiretta, basta un semplice

esame del sangue sono dei controlli sul paziente che possono essere fatti in periodi ravvicinati

⇾

La diagnosi strumentale dà delle informazioni sulla presenza o meno di una condizione (esempio: vedo una frattura),

il paziente viene poi monitorato con esami del sangue (ricerca di marcatori di riassorbimento osseo)

Esempio: trattamento dell’infezione da HIV e manifestazione conclamata in AIDS

è difficile valutare quanto la malattia progredisce o regredisce in seguito al trattamento, ora viene utilizzato il livello dei

linfociti T CD4+ come end point surrogato

Consente una valutazione indiretta dell’efficacia del trattamento o dello stato di remissione della patologia, è un modo

quantitativo per verificare quanto la terapia è efficace

2- Sviluppo di trattamenti individuali medicina personalizzata

⇾

Esiste un minimo di variabilità delle risposte dei pazienti nei confronti delle terapie, conoscendo queste differenze è

possibile calibrare meglio la terapia in dosaggi e tempistiche

La ricerca di biomarker aiuta a:

- migliorare la predizione del rischio di sviluppare una malattia

- capire come una malattia potrebbe progredire una volta che è stata diagnosticata

- capire come un individuo risponde a un trattamento

Consentono di prendere delle decisioni più sicure ed efficaci in merito a un trattamento poiché forniscono informazioni

fini e specifiche relative allo stato del paziente

Metodo utilizzato nei trattamenti chemioterapici: prima di ogni ciclo vengono fatti degli esami del sangue, in base al

livello del biomarcatore tumorale viene calibrata la terapia

In patologie complesse nelle quali non vi è un marcatore sistemico (come la sclerosi multipla), si fa la risonanza

magnetica per valutare lo stato del singolo paziente, monitorazione che avviene a intervalli più lunghi

Nuovi biomarcatori vengono applicati nel campo della medicina personalizzata

consentono una caratterizzazione a 360° del singolo paziente

Mondo degli omics:

- genomica analisi dei cambiamenti di espressione di un gene

⇾

- proteomica analisi dei cambiamenti dei livelli di una proteina

⇾

- metabolomica analisi delle differenze di alcune molecole che giocano un ruolo fondamentale nella funzione cellulare

⇾

Array di biomarcatori a livelli diversi di produzione di una molecola: livello genetico, trascrizione, traduzione, secrezione e

interazione a livello metabolico

Consentono un’ampia visione del singolo paziente

Non esiste un singolo gold standard, esiste un pannello di biomarcatori che completano il quadro

Sviluppo

Il campo della ricerca oncologica è stato il primo ad adottare i biomarcatori, sono fondamentali nelle patologie

multifattoriali

I biomarcatori sono usati nei trials farmacologici fase II: verifica dell’efficacia

⇾

Nelle fasi finali dello sviluppo di un farmaco vengono usati dei biomarcatori legati alla progressione o meno della

patologia, ma solo un numero limitato possono essere usati come end point clinici durante la fase III di sperimentazione

(conferma dell’efficacia del farmaco)

Il livello di colesterolo totale non è tanto un indicatore del rischio cardiovascolare, è un’informazione troppo generica per

correlarsi al rischio, per questo non è un buon marcatore invece il rapporto VLDL/HLDL dà un’informazione più

⇾

specifica

Prima di introdurre un nuovo biomarcatore nella clinica è necessario dimostrare che è correlato a uno stato clinico

specifico del paziente

Nonostante i trials, ci sono una minima quota di pazienti che non rispondono a una terapia e non si capisce il perché, ma è

necessario trovare una spiegazione esempio: espressione o meno di un recettore, metabolismo del paziente non

⇾

permette l’azione desiderata del farmaco

è utile identificare questi pazienti utilizzando dei biomarkers

I trial clinici per l’introduzione di nuovi farmaci sono spesso molto lunghi: dalla prima definizione della molecola,

sperimentazione in vivo fino alla sperimentazione sull’uomo possono passare anche anni

servono delle risposte specifiche per consentire il passaggio da una fase all’altra, i biomarcatori se sono precisi consentono

una velocizzazione della progressione degli studi risposta quantitativa sulla risposta al farmaco

⇾

Richiesta al comitato etico per la sperimentazione, il numero dei pazienti da arruolare è funzione della variabilità attesa

più è elevata la variabilità attesa, più il numero dei pazienti sarà grande

ma se vi sono dei marcatori, il numero della variabilità attesa è minore, quindi il numero delle persone che parteciperanno

alla sperimentazione diminuisce (più accettabile per il comitato etico)

L’utilizzo dei biomarcatori consente di caratterizzare meglio i pazienti e di studiare in modo più preciso una malattia,

attesa di una risposta precisa e focalizzata

Alcuni pazienti possono essere esclusi a causa della probabilità minore del beneficio atteso o del rischio di sviluppare

effetti avversi

Biomarcatore deve avere una serie di requisiti

- punto di vista tecnico

- regolatorio, legislativo

- etico, deve essere migliore di quello utilizzato in precedenza

Punto di vista tecnico

⇾ deve essere accurato e quindi deve poter discriminare in modo preciso le situazioni positive dalle negative

deve essere sensibile, deve avere una soglia di detection più bassa possibile, è necessario discriminare rumore di fondo

deve essere specifico, non devono esserci falsi positivi o falsi negativi

deve avere un buon rapporto costo-efficacia, deve essere sostenibile dal punto di vista economico

deve essere di facile esecuzione dal punto di vista tecnico e strumentale, deve essere applicabile in tutti i laboratori

I marker prognostici danno informazioni sul grado di evoluzione della malattia

è necessario quantificare se è effettivamente e quanto in grado di dare delle informazioni sull’aggravamento della

patologia

Il superamento della soglia di una determinata misura corrisponde a un determinato rischio

è importante quantificare la capacità predittiva del biomarcatore

Importanza della valutazione statistica: potere predittivo positivo o negativo

Il tutto deve essere calibrato in base alle caratteristiche del paziente

Punto di vista regolatorio

⇾ esistono una serie di registri (FDA, EMA) ai quali bisogna fare affidamento prima di introdurre in commercio o nella

pratica clinica un farmaco o un nuovo biomarcatore

a livello della comunità europea esistono diverse legislazioni specifiche per i diversi stati

validare i biomarcatori può essere un complesso complesso e costoso

Un biomarcatore valido è una molecola o una sostanza che deve essere misurata con un test analitico valido e applicabile

con delle performance stabilite variabilità, cosa ci aspettiamo

⇾

è necessario avere un solido background scientifico (caratteristiche biologiche ideali) dal quale ricavare il cosiddetto

end-point surrogato

Misura quantitativa con un test applicabile nel modo più semplice possibile, deve essere riproducibile in modo tale da

poter ridurre la variabilità e permettere un’interpretazione univoca dei risultati

Misura indiretta ma quantitativa dello stato del paziente

Classificazione dei biomarkers

Tipo 0 descrivono la naturale evoluzione di una patologia

⇾ sintomi classici: molto generali e poco quantitativi

Tipo 1 indicazioni sull’efficacia o meno di una terapia

⇾ misura indiretta di come si sta evolvendo la patologia e degli effetti della terapia

Tipo 2 end-point surrogati

⇾ aumento della specificità e precisione, sostituiscono in modo completo un parametro clinico

correlazione diretta con un parametro clinico

A seconda della caratteristica sulla quale basiamo un biomarcatore, ne esistono diversi tipi:

- basati sullo stato della patologia e la sua progressione

danno maggiori indicazioni

markers di detection

⇾ markers di prediction

⇾

associati all’efficacia di un trattamento, mi aspetto che il paziente risponda al trattamento in un determinato modo

markers di diagnosi

⇾ markers di prognosi

⇾ come evolve la malattia

- basati sulla molecola specifica

come markers di DNA, RNA, proteine, enzimi, carboidrati

- basati su altri criteri

imaging, markers di patologia come livelli ormonali e metabolici

I marker possono essere presenti in liquidi biologici e venire rilevati grazie a:

- laboratory tests come l’ELISA e i vari -omics

- misurazioni dello stato fisiologico del paziente come la pressione, il ritmo

cardiaco, …

- misurazioni elettrofisiologiche come l’ECG e l’EEG

- esami istologici (biopsia) e citologici (pap-test)

- imaging (PET, TC, RMN)

Variano a seconda dell’obiettivo clinico (diagnostico, di monitoraggio o prognostico)

E’ necessario definire un end-point clinico

come si sente il paziente, le sue funzionalità e la sopravvivenza

I biomarcatori farmacodinamici permettono la valutazione della

risposta a un farmaco

ad esempio i markers tumorali non sono diagnostici, ma vengono

utilizzati per valutare la risposta di un paziente alla terapia

Gli end-point surrogati sono dei biomarcatori correlati direttamente

a uno stato clinico, sostituiscono gli end-point clinici

Predicono i benefici clinici o i potenziali danni basati su evidenze epidemiologiche, patofisiologiche, terapeutiche, …

Ad esempio: in caso di osteoporosi, i marcatori di rimodellamento osseo valutati nel sangue sono strettamente correlati

allo stato di densità ossea dell’intero sistema scheletrico

livelli di glicemia nel sangue e diabete

Legame diretto e univo, l’end-point surrogato è un sostituto della valutazione clinica

Correlazione tra i biomarcatori I marcatori farmacodinamici rappresentano un sottoinsieme di biomarcatori

sono sensibili al trattamento con la terapia e indicano quanto essa è efficace

Al loro interno si trovano gli end-point surrogati

sono ancora più precisi perché correlano direttamente con lo stato clinico

(sottoinsieme dei biomarcatori e dei marcatori farmacodinamici)

END-POINT SURROGATO

Parametro clinico o di laboratorio che può essere utilizzato in trial come sostituito dell’end-point clinico del paziente

I cambiamenti indotti da una terapia a livello di un end-point surrogato, riflettono i cambiamenti a livello dell’end-point

clinico

Esempio: riduzione della glicemia, riduzione della proliferazione neoplastica

Un biomarker è un endpoint surrogato se è in grado di predire dei benefici o dei danni clinici basati su evidenze

epidemiologiche, terapeutiche o patofisiologiche

La relazione fra biomarker e stato clinico può essere:

- inaffidabile

correlazione poco favorevole, troppo variabili e per questo non possono essere degli end-point surrogati

PSA utilizzato per la diagnosi del carcinoma prostatico, ma non varia in risposta a una terapia, quindi non può essere

utilizzato per il monitoraggio

- fotografia precisa della condizione clinica

il pieno effetto della terapia è osservabile mediante una valutazione del marker

end-point surrogato per ora non ne esiste solo uno così preciso, necessario analizzare un pannello di biomarcatori

⇾

diversi

- il trattamento farmacologico o chirurgico non è necessariamente correlato a uno stato clinico rilevabile con un

biomarcatore

la terapia ha un effetto indipendente su marker ed endpoint

il biomarcatore è solo parzialmente un end-point surrogato

esempio: in un paziente diabetico, la glicemia è altamente variabile, per questo si valuta ad esempio l’emoglobina glicata

nel tempo

- nelle malattia multifattoriali o nelle patologie in cui si targetta solo un suo specifico aspetto di una patologia

la terapia ha effetto favorevole sul marker ma non ha effetto o ha effetto sfavorevole sulla malattia o sullo stato di

benessere

biomarker ha poco uso pratico come end-point surrogato

Caratteristiche di un biomarcatore ideale

- deve avere un’alta sensibilità, specificità, accuratezza e alto potere predittivo

- deve essere sicuro e semplice da misurare

- deve tenere conto delle diverse caratteristiche del paziente

- deve essere modificabile con il trattamento

- deve avere un buon rapporto costo-beneficio

- deve essere consistente per le varie etnie e sessi

I biomarkers possono essere utilizzati

nei trials clinici e quindi per lo sviluppo di nuovi farmaci

⇾ per test di screening

⇾ deve permettere di discriminare tra lo stato sano e la malattia asintomatica

devono consentire di dare una fotografia della situazione dell’organo/apparato

per fare valutazioni sul rischio

⇾ soglia tra la condizione patologia e la condizione sana, pone determinato rischio

per monitorare la terapia o per selezionarle una addizionale

⇾ soprattutto per effettuare diagnosi: stadio e grado di severità della patologia,

⇾ selezione della terapia iniziale e monitoraggio di un’eventuale recidiva

Una volta fatta la diagnosi basata sulla valutazione della patologia in termini di gravità e stadio, viene scelta la terapia e il

trattamento

Vengono utilizzati dei marcatori a macropannelli come gli omics

Classi di biomarker utilizzati in trials si basano su due caratteristiche:

- sicurezza

safety biomarker

deve essere sicuro, è necessario che non sia tossico per il paziente (deve essere biocompatibile)

Deve essere valutata la tossicità:

⇾ a livello renale

⇾ a livello epatico

creatinina ematica, azoto ureico

⇾ a livello ematologico

ematocromo citometrico

⇾ a livello di sicurezza ossea

calcio sierico e livelli di fosfato inorganico

alcuni farmaci vanno a indebolire il tessuto osseo, rischio accettabile di fronte a potenziale grande beneficio

⇾ valutazione della sicurezza a livello del metabolismo

glucosio nel sangue, trigliceridi, colesterolo totale, LDL, HDL

⇾ altri biomarcatori di sicurezza

livelli di immunoglobuline sieriche, di proteina C reattiva, fibrinogeno

TSH, tiroxina, testosterone, insulina

lattato de-idrogenasi LDH, creatinin-chinasi CK, troponina cardiaca

- efficacia

efficacy biomarker

danno indicazioni sullo stato clinico del paziente e permettono valutazioni sull’efficacia del trattamento

sono quantitativi

quanto più la variazione è alta, tanto più il biomarcatore è sensibile nel dare informazioni sull’efficacia del trattamento

usati per dimostrare un cambiamento dello stato clinico di un paziente in una buona percentuale dei soggetti

A seconda dell’obiettivo, i biomarcatori di efficacia possono essere:

farmacodinamici

⇾ valutano la funzionalità di un farmaco

predittivi

⇾ stratifica la popolazione dei pazienti in responder e non-responder per un determinato trattamento

selezione solo dei teorici responder, pazienti che avrebbero benefici