Modulo diagnostica

SISTEMA DI INTRODUZIONE DEL CAMPIONE

Prerequisito essenziale per separazione e rivelazione è la formazione di ioni dei campioni in analisi in fase gassosa. Il campione, solido, liquido o gassoso, viene introdotto in una camera da vuoto per impedire la perdita di ionizzazione. I gas sono introdotti come tali. I solidi ed i liquidi sono prima vaporizzati. Le sostanze poco volatili sono prima derivatizzate.

SORGENTE O CAMERA DI IONIZZAZIONE

È la sede di ionizzazione di molecole che si trasformano in ioni positivi e negativi. In genere si lavora con ioni positivi, che possono decomporsi in frammenti di massa inferiore. La ionizzazione è prodotta da una sorgente ionica differente a seconda della tecnica usata. Ogni molecola presenta una sua frammentazione caratteristica dipendente dalle sue proprietà e dalle condizioni operative di ionizzazione.

Esistono diverse modalità di ionizzazione:

• Hard ionization: ionizzazione elettronica (EI) - non può essere

usata per composti che si frammentano troppo come peptidi e proteine

Soft ionization:

1. ionizzazione chimica: usata per composti chimici
2. ionizzazione elettrospray: usata per peptidi e proteine (inventato per esse)
3. desorbimento laser assistito da matrice

IONIZZAZIONE ELETTRONICA

Tecnica più nota ed usata, non per proteine e peptidi. Utilizza un fascio di elettroni ad alta energia che provoca ionizzazione e frammentazione delle molecole originando anche specie diverse dallo ione molecolare, visibili nello spettro di massa. Lo spettro di massa ottenuto consiste di soli ioni positivi (più comuni) o negativi. Gli ioni positivi sono guidati all'analizzatore mantenendo la sorgente ionica ad un potenziale positivo rispetto all'analizzatore e focalizzando il fascio ionico mediante potenziali applicati ad un sistema di lenti tra sorgente ed analizzatore.

La sorgente produce una corrente di 70eV. Quando il campione entra nella sorgente, passa attraverso un

Il gas viene ionizzato e trasferisce protone sulle molecole da analizzare. Con ionizzazione chimica abbiamo un picco dello ione molecolare molto più alto. Abbiamo un numero minore di informazioni per ricostruire la struttura della molecola.

Scelgo la tecnica in base alla molecola da analizzare.

IONIZZAZIONE ELETTROSPRAY

E' stata inventata per peptidi e proteine → le altre ionizzazioni erano troppo intense → ora si può analizzare il proteoma.

E' una tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione atmosferica. E' una ionizzazione delicata (3-5 eV). E' usata per molecole di polarità medio-alta e composti con basso ed alto PM fino a 150.000. Spesso si formano ioni con carica multipla → tanti aa sono ionizzabili. E' comune la presenza di ioni addotto (se ho ad esempio K).

proteina +è grande, più cariche superficiali ho, più picchi ho. Prendo lo spettro e lo confronto in undatabase e mi viene indicata la pp. Con questo sistema ho spettri più complessi.

MATRIX ASSISTED LASER DESORPTION IONIZATION (MALDI)

Posso ottenere ionizzazione delle pp senza distruggerle e posso ottenere spettri con ioni monocarica.

La ionizzazione delle molecole avviene grazie a un brevissimo ma intenso impulso di luce laser ultravioletta. Il campione è cristallizzato in una matrice solida → la matrice solida serve a proteggere dal calore del raggio laser → assorbe l'energia e la trasferisce a peptidi e proteine. Il desorbimento mediante laser permette di ottenere ioni in fase gassosa. Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare sia di ionizzare il campione.

Il composto è mescolato ad una matrice che assorbe intensamente la lunghezza d'onda del laser. La miscela è asciugata e qualunque solvente rimosso.

sorgente di ionizzazione, in base a m/z. Sono il punto più costoso dello strumento. Ci sono core facilities→ luoghi con diversi tipi di strumenti e i tecnici consentono di poter mandare i campioni in analisi senza pagare il costo della macchina. Si distinguono diversi tipi di analizzatori:

• A deflessione magnetica o singola focalizzazione
• A doppia focalizzazione
• A quadrupolo
• A trappola ionica
• A tempo di volo (TOF)
• A risonanza ionica ciclotronica in trasformata di Fourier (FTICR)
• Orbitrap FTMS

ANALIZZATORI A DEFLESSIONE MAGNETICA

Costituiti da un settore magnetico che devia le traiettorie degli ioni in percorsi circolari. Il raggio di tali percorsi dipende da m/z dello ione. Cambiando le traiettorie degli ioni mediante variazioni del campo magnetico, ioni con differente m/z possono essere focalizzati sul rivelatore.

ANALIZZATORI A DOPPIA FOCALIZZAZIONE

Utilizzano una combinazione di campi elettrici e magnetici per separare gli ioni. Gli ioni sono focalizzati in base

ANALIZZATORI A QUADRUPOLO

Sono i più usati → basso costo. Costituiti da 4 poli o barre di metallo disposte parallelamente (+ opposte le une alle altre, - opposte le une alle altre). L'analisi di massa dipende dal moto degli ioni risultante da una combinazione di campi elettrici continui ed alternati a radiofrequenza. La scansione è effettuata mediante variazione della forza di questi campi. A determinati valori di tensione applicata solo ioni con un preciso m/z attraversano l'analizzatore. Otteniamo spettri dei composti nelle quattro barre.

ANALIZZATORI A TRAPPOLA IONICA

Consiste in un elettrodo ad anello e due elettrodi a semisfera che vengono utilizzati per intrappolare gli ioni prodotti dalla sorgente. La trappola ionica trattiene

Tutti gli ioni che sono poi rilasciati verso il rivelatore variando il campo elettrico attorno ad essa. Sfrutta campi elettrici alternati a radiofrequenza applicati ad elettrodi disposti con geometria "a sandwich". Lo spettro di massa è prodotto variando il potenziale a radiofrequenza in modo da produrre l'espulsione degli ioni secondo un ordine crescente di m/z.

ANALIZZATORI A TEMPO DI VOLO (TOF)

Separazione degli ioni in base al tempo utilizzato per percorrere una distanza nota. Gli ioni sono accelerati ad un'energia cinetica costante e focalizzati verso un "tubo di volo". Il tempo impiegato a percorrere il "tubo di volo" è trasformato nel valore di massa dello ione in base alla relazione: E = mv/2. Ioni con differente massa/carica hanno uguale energia, ma differente velocità dopo l'accelerazione subita nella camera di ionizzazione, ne deriva che il tempo che ciascuno mette per attraversare l'analizzatore.

è differente.

RIVELATORE

Gli ioni sono rivelati trasformando l’energia prodotta dalla loro collisione sulla superficie del rivelatore, in modo da provocare l’emissione da parte di