Esercitazione Biotecnologie nella diagnostica di laboratorio e fondamenti di statistica

ESERCITAZIONI DI DIAGNOSTICA

Posto che la proteomica studia le proteine su larga scala (insieme di proteine espresse in un tessuto o presenti in un fluido biologico), quali

tecniche pensi che si possano utilizzare?

- spettrometria di massa: identificazione delle pp e quantificazione, è importante la quantificazione differenziale

- cromatografia: tecnica separativa più accoppiata alla spettrometria di massa→ l’uscita di una colonna cromatografica può essere direttamente

collegata tramite un capillare all’entrata in sorgente dello spettrometro

- tecniche elettroforetiche: accoppiate ad uno spettrometro di massa per rendere l’analisi ancora più efficace

- 2D elettroforesi: il risultato della separazione non è direttamente accoppiabile allo spettrometro di massa

- western blot: non è in grado di analizzare un insieme di proteine, devo conoscere già la pp che vado ad analizzare, è una tecnica di

validazione

Il range dinamico delle concentrazioni nella scoperta di nuovi biomarcatori è un fattore da tenere in considerazione?

- SI, in quanto le molecole più abbondanti mascherano la presenza delle meno concentrate.

- NO, gli strumenti più aggiornati hanno sensibilità tale da superare questo fattore.

La risposta corretta è SÌ.

Il range dinamico è la differenza di concentrazione tra la pp più abbondante dell'estratto proteico e quella meno abbondante.

Il problema è di tipo strumentale; infatti, anche la tecnica più sensibile come lo spettrometro di massa ha dei limiti di sensibilità, perché non riesce ad

analizzare composti che sono 3/5 ordini di grandezza al di sotto della componente più abbondante presente nell’estratto. Le proteine più abbondanti

mascherano quelle meno abbondanti.

Posto che il range dinamico costituisce un ostacolo nella ricerca di biomarcatori, quali metodiche possono essere utilizzate per la sua

riduzione nel caso di un estratto proteico?

- cromatografia: permette di effettuare una buona separazione oltre al fatto di essere facilmente appaiabile con lo spettrometro di massa

- elettroforesi: con isoelettrofocalizzazione possiamo separare le proteine in base al loro punto isoelettrico. Ciascuna frazione del gel può

essere prelevata e analizzata singolarmente (lo vedremo nelle prossime lezioni). Le pp in ambiente acido sono cariche + perchè abbiamo che

il gruppo amminico lega un H+, in ambiente alcalino abbiamo carica - perchè il gruppo carbossilico tende a dissociarsi. Il lato acido viene

messo al polo +, il lato alcalino al polo -. Le pp migrano fino a quando non hanno carica pari a 0 e non sono più attratte dal campo elettrico

- pre-frazionamento delle componenti sub-cellulari, che permette di ottenere una semplificazione dell’estratto andando ad isolare organelli

differenti della cellula. Se in una cellula voglio liberarmi delle proteine strutturali del citosol e sono interessato solo a quelle mitocondriali,

posso isolare i mitocondri e analizzare le proteine al suo interno.

- centrifugazione differenziale: precipito selettivamente organuli a diverse densità mediante centrifugazioni differenziali

- immunoprecipitazione selettiva: faccio precipitare solo le pp più abbondanti, in modo da eliminarle dall’estratto proteico. In commercio vi

sono anche dei kit appositi come quelli che fanno precipitare l’albumina nel siero da analizzare.

- purificazione: uso filtri con differenti cut off

Quale tipo di cromatografia è principalmente utilizzata per la separazione di peptidi?

Le proteine intere possono raggiungere dimensioni di 200k Da, i peptidi ottenuti dalla stessa proteina a seguito di un digerito

triptico (utilizzando come enzima la tripsina) hanno una dimensione media sui 2000-5000 Da, se cambio enzima cambio dimensioni.

Un’altra caratteristica che cambia è l’idrofobicità, i peptidi che derivano dalla digestione di proteine sono meno idrofobici delle

proteine di partenza.

- RPLC (reverse phase), cromatografia di elezione per la separazione di peptidi. È una tecnica che, per le sue caratteristiche

di idrofobicità, possiede una capacità separativa su delle molecole che sono leggermente idrofobiche come i peptidi. La

fase stazionaria è composta da una resina con caratteristiche apolari che è formata da lunghe catene di carbonio C18 (quasi

un acido grasso), i peptidi rimangono adesi a questa fase. Il solvente di eluizione che viene aggiunto ha un range di polarità

che va da acquoso a totalmente apolare (tipicamente miscele di acqua e aceto nitrile), perciò nella scala di eluizione

vengono eluiti prima i peptidi più idrofili e via via quelli più idrofobici = polarità decrescente. La RPLC è una tecnica

inadeguata per la separazione di proteine che, a causa della loro elevata idrofobicità, rimarrebbero adese alla fase

stazionaria anche a seguito dell’eluizione.

- NPLC (normal phase) si ha la situazione opposta alla RPLC, nella fase stazionaria si ha una resina polare che non possiede

un potere selettivo per i peptidi.

- scambio ionico: può essere utilizzata per essere accoppiata ad altre tecniche cromatografiche. Infatti, si possono mettere in

sequenza più tecniche cromatografiche per ottenere un risultato ottimale nella separazione di peptidi. 1

- gel filtration: tecnica che andrebbe utilizzata per la separazione di proteine intere, perché non risulterebbe abbastanza

sensibile nel distinguere peptidi che hanno peso molecolare molto simile. È un gel che possiede delle maglie piccole, ma

non abbastanza piccole da permettere un potere separativo per i peptidi

La spettrometria di massa è di per sé una tecnica quantitativa?

- SI, le intensità dei picchi dello spettro sono sempre proporzionali alla concentrazione della sostanza che li genera, indipendentemente dalla

sua natura.

- NO, ma può essere resa quantitativa tramite approcci che prevedono l’utilizzo di isotopi

La risposta corretta è NO.

La spettrometria di massa NON è una tecnica quantitativa per due motivi:

- ionizzazione: quando iniettiamo un composto all’interno dello spettrometro generiamo dei segnali dovuti alla ionizzazione; tuttavia, è una

caratteristica che dipende dalla natura delle singole molecole presenti nel composto. Le sostanze non si ionizzano allo stesso modo, ci sono

sostanze che si ionizzano meglio di altre e alcune che non si ionizzano proprio. Dato che le diverse molecole si ionizzano in modo diverso

nell’unità di tempo, le sostanze che hanno la stessa concentrazione ma differente ionizzazione, presentano picchi di intensità diverse

- volatilizzazione: il composto deve essere volatile, deve essere in grado di staccarsi dalla sua matrice di origine e viaggiare nell’aria o nel vuoto

spinto dal campo elettrico. Anche questa caratteristica non è uguale per tutti i composti e influisce sull’intensità del picco.

Per rendere la spettrometria di massa una tecnica quantitativa si possono utilizzare gli isotopi, molecole che hanno le stesse caratteristiche chimiche-

fisiche tra loro (stessa ionizzazione e stessa volatilizzazione). Gli isotopi di qualsiasi sostanza all’interno dello spettro rimangono in rapporto molare tra

loro, poiché le intensità dei picchi sono in rapporto con le loro molarità; se un isotopo leggero è la metà di peso rispetto ad un isotopo pesante, avremo

nello spettro due picchi vicini con uno un’intensità doppia dell’altra. Si sfrutta questo concetto per fare delle quantizzazioni su molecole che sono

completamente diverse.

Se voglio confrontare un campione A con un campione B, farò un labeling isotopico: marco tutto l’estratto del campione A con un isotopo leggero e tutto

l’estratto del campione B con un isotopo pesante, mixo tutto e lo inietto nello spettrometro di massa. Nello spettro vedrò vicini tra loro due picchi, uno

del campione A e l’altro del campione B e, mettendo a confronto l’intensità dei picchi, potrò calcolare il rapporto molare.

Per fare una quantizzazione assoluta di una sostanza è necessario un calibrante (standard), prendo un isotopo a concentrazione nota della sostanza che

voglio analizzare e lo inietto insieme alla sostanza di cui voglio calcolare la concentrazione. Confronto i picchi d’intensità dei due isotopi, vedendo

quanto il picco della sostanza a concentrazione ignota è più alto o più basso dell’isotopo a concentrazione nota.

Lo spettro viene misurato in unità arbitrarie (non sono unità fisse), il picco base è il picco più intenso in uno spettro di massa e ha unità arbitrarie pari a

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ISOTOPI E REAGENTI ISOBARICI

Per rendere la spettrometria di massa una tecnica quantitativa si possono utilizzare gli isotopi. Gli isotopi di qualsiasi sostanza all’interno dello spettro

rimangono in rapporto molare tra loro, poiché le intensità dei picchi sono in rapporto con le loro molarità; se un isotopo leggero è la metà di peso

rispetto ad un isotopo pesante, avremo nello spettro due picchi vicini con uno un’intensità doppia dell’altra. Si sfrutta questo concetto per fare delle

quantizzazioni su molecole che sono completamente diverse. Confronto i picchi d’intensità dei due isotopi, vedendo quanto il picco della sostanza a

concentrazione ignota è più alto o più basso dell’isotopo a concentrazione nota.

Vi sono diverse tecniche di labeling isotopico nelle quali la quantizzazione viene effettuata sullo spettro di massa (sorgente →analizzatore →detector):

- SILAC (stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture): è una marcatura isotopica di tipo metabolico, fornisco a diverse colture

cellulari dei substrati (amminoacidi) a diversa marcatura per la costruzione di proteine. Gli amminoacidi marcati vengono incorporati in

maniera differenziale nelle sequenze proteiche delle cellule: si prelevano gli estratti proteici, si digeriscono e si miscelano, le proteine

risultano già marcate in maniera “naturale”.

- ICPL (Isotope-Coded Protein Label): è una marcatura chimica che utilizza un tag che si lega ai residui di lisina

- ICAT (Isotope-Coded Affinity Tag): è una marcatura chimica che marca le proteine con reagenti ‘heavy’ e ‘light’

Nelle tecniche isobariche (TMT E ITRAQ) l’analisi quantitativa viene fatta sullo spettro di frammentazione (massa/massa) e non sullo spettro di massa,

nello strumento in aggiunta alla sorgente e all’analizzatore si ha una cella di collisione per la frammentazione e un secondo analizzatore (sorgente →

analizzatore → cella di collisione → analizzatore → detecor). Grazie alla spettrometria di massa in tandem posso generare due spettri, il primo è il classico

spettro di massa che possiede diversi picchi e il secondo è lo spettro di frammentazione (o massa/massa) che isola ogni singolo picco dello spettro di

massa, frammentandolo e analizzando ulteriormente. Avrò così uno spettro di frammentazione per ogni singolo piccolo dello spettro di massa 3

IDENTIFICAZIONE DI PROTEINE

Per l’identificazione di proteine si può procedere in due modi:

Peptide Mass Fingerprint (PMF): si utilizza uno spettrometro classico che genera solo uno spettro di picchi. Una volta ottenuti i pesi molecolari dei

peptidi di una proteina di interesse, li confronto con i pesi molecolari dei peptidi che vengono generati per digestione in silico di tutte le proteine note

presenti nel database (UniProt). Quando ho identità tra tutti i miei picchi e quelli di una singola proteina del database, ho identificato la proteina.

Facendo dei confronti solo per masse, possono verificarsi dei fraintendimenti perché vi sono dei peptidi diversi con sequenze diverse che però hanno la

stessa massa, tali problemi si possono superare utilizzando la statistica o procedendo con tandem mass spectrometry.

Tandem Mass Spectrometry (MS/MS): necessita di due spettrometri in tandem affinché si possano avere due spettri, quello di massa e quello di

frammentazione. Nella camera di frammentazione, per collisione con un gas, avviene la rottura di ogni singolo peptide su uno dei legami peptidici

(frammentazione casuale), vengono così generati una serie di frammenti con lunghezza e peso molecolare diversi poiché avranno perso n amminoacidi.

Tra i diversi picchi vicini nello spettro di frammentazione ci sono differenze di peso molecolare di un solo amminoacido, conoscendo le masse esatte

degli amminoacidi, posso capire per differenza tra il peso molecolare di un peptide e quello accanto l’amminoacido che è stato “perso”. Tali perdite

permetteranno la ricostruzione della sequenza e quindi la probabilità di misinterpretazioni sarà minore.

Cosa accadrebbe se confrontassi tra di loro proteine di diversi campioni contemporaneamente?

In entrambi gli approcci costruisco i tag, in uno isotopico e nell’altro isobarico, marco i campioni e li mixo. Analizzo i campioni marcati

contemporaneamente.

Utilizzando PMF, nello spettro di massa avrò n volte i picchi ottenuti con un singolo campione con n = numero dei campioni e se immaginassi di

analizzare 10 campioni la situazione si complicherebbe, i picchi si decuplicherebbero. Con lo spettrometro di massa classico, non riuscirei ad ottenere

una risoluzione ottimale per distinguere i picchi vicini, poiché risulterebbero essere uno sovrapposto all’altro.

La soluzione è utilizzare spettrometri in tandem (MS/MS), i tag isobarici permettono la quantificazione dei rapporti molari sullo spettro di

frammentazione per ovviare al problema di sovrapposizione dei picchi. I reagenti isobarici possiedono tutti lo stesso peso e sono composti da un gruppo

reattivo, un reporter che permette l’identificazione del tag stesso e un balance che va a compensare la differenza di peso del reporter. Quando vado ad

analizzare i picchi del primo spettro (di massa), i peptidi uguali di campioni diversi avranno stesso massa, perché saranno tutti taggati con dei tag

isobarici che hanno lo stesso peso molecolare, perciò, il numero di picchi è uguale a quello che avrei nell’analisi di un singolo campione. Le intensità dei

diversi picchi derivano dalla somma del numero di peptidi dei campioni, ma in questo modo dallo spettro di massa non si è in grado di capire quanto

ciascuno di essi vi contribuisce. Quando vado ad analizzare i singoli picchi nel secondo spettro (di frammentazione) possono ricavare informazioni

importanti per l’identificazione della proteina e per la quantizzazione:

- ciascun peptide viene isolato e frammentato, ottenendo dei frammenti peptidici che mi permetto l’identificazione della proteina. I picchi

che otteniamo sono dei frammenti dello stesso peptide nei diversi campioni e mi permettono la definizione della sua sequenza.

- i tag isobarici stessi vengono frammentati nel punto tra reporter e balance, liberando la parte diversa (il reporter) che contraddistingue i

differenti campioni, otterrò tanti picchi tanti quanti sono i campioni che sto analizzando. I picchi del reporter sono situati nella regione più

bassa dello spettro (sono facilmente riconoscibili perché pesano 126-131 Da) a cui poi seguono i picchi dei frammenti. Essendo i reporter

degli isotopi, posso fare un rapporto tra le intensità dei vari picchi per quantif