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PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Bisogna cercare di ottenere estratti proteici che siano sempre riproducibili fra di loro e che riassumano tutto il proteoma. Diventa fondamentale ottimizzare i protocolli di estrazione per cercare di ottenere un estratto che comprenda più proteine possibili.
Preparazione buffer di lisi
Si fa un buffer di lisi per l'estrazione proteica contenente:
- Detergente che ha la capacità di solubilizzare le proteine mascherando le loro porzioni idrofobiche. Il più efficiente è il detergente anionico SDS, ma non va bene con alcune tecniche a valle perché interferisce con esse, ad esempio non è tollerato per isoelettrofocalizzazione perché conferisce a tutte le proteine carica - mascherando le cariche naturali della proteina. Ci sono anche detergenti cationici, non ionici (NP40) e zwitterionici (CHAPS). Questi sono compatibili con isoelettrofocalizzazione. Bisogna già sapere cosa fare col campione.
- Agente denaturante: può
essere anche il calore, scaldando a 90-95°C e mettendo subito in ghiaccio. Esistono anche agenti denaturanti come l'urea, ma dopo aver aggiunto urea non posso scaldare il campione- agenti riducenti: rompono ponti disolfuro → DTT e mercaptoetanoloβ- inibitori delle proteasi: hanno azione molto aggressiva vs pp e la cellula li tiene separati, ma quando facciamo lisi mettiamo a contatto e quindi abbiamo degradazione, nonostante siano anch'esse sottoposte a denaturazione (si denaturano lentamente e rinaturano in maniera spontanea) → si usano cocktail che vanno ad inibire le proteasi
Queste serve per ottenere pp denaturate → ottengo la struttura primaria, per ottenere pp alla struttura naturale evitto agenti denaturanti e riducenti e detergenti blandi.
Solubilizzazione
Abbiamo diversi metodi di solubilizzazione:
- metodi delicati: lisi osmotica, se le cellule sono dotate di parete (cellule vegetali) posso aggiungere cellulasi
- metodi a media forza:
Alchilazione
Dopo aver ridotto il campione non voglio che i ponti disolfuro si riformino dopo aver rimosso il DTT. I ponti disolfuro che si formano fisiologicamente nella cellula sono intramolecolari ma se avvengono in un miscuglio di pp saranno intermolecolari. Devo far sì che i ponti disolfuro ridotti siano bloccati in maniera definitiva → alchilazione: uso iodoacetamide. Si lega il complesso allo zolfo che quindi non può reagire con altri gruppi sulfidrilici. Ma devo tenere conto in spettrometria di massa che ho modificato in questo modo le cys → cys hanno una massa più grande.
Digestione pp
Per la digestione aggiungo tripsina overnight e poi la inattivo aggiungendo un acido. L’acidificazione favorisce anche la ionizzazione con elettrospray.
Posso utilizzare anche altri enzimi proteolitici, l’importante è sapere quale enzima è stato
utilizzo per la pulizia delle proteine, in cui le proteine si legano alla resina e gli interferenti vengono lavati via. In questo modo ottengo proteine pulite da tutti gli interferenti. Per la spettrometria di massa, è necessario che le proteine siano altamente purificate. Nell'estratto proteico possono essere presenti molecole interferenti come lipidi, polisaccaridi, sali e acidi nucleici. Per rimuovere questi interferenti, posso utilizzare la sonicazione e la nucleasi. Inoltre, per ottenere un vero digerito triptico, viene aggiunta la lys-c che ha un'efficienza maggiore nella digestione delle lisine. Questo ottimizza la digestione e diminuisce il numero di missed-cleavage. La tripsina ha due possibilità di taglio, a valle di un residuo di lisina o arginina. Tuttavia, l'enzima ha una maggiore affinità per l'arginina rispetto alla lisina, quindi potrei trovare dei missed-cleavage a valle dei residui di lisina.contengono un filtro con un cut-off molecolare in modo tale da far passare solo le molecole al di sotto del cut-off e lasciare soprale molecole di interesse. Agisce come un vero e proprio setaccio, ottenendo così un frazionamento delle proteine basato sul peso molecolare. Dopo aver lavato e recuperato le pp, se il tampone usato non è adatto alla spettrometria di massa porto a secco le pp e poi le risospendere nel tampone corretto. Cromatografia in fase liquida L'analisi prevede un passaggio in HPLC dopo aver ottenuto i peptidi provenienti da tutto l'estratto. Collegata allo spettrometro di massa con colonna reverse fase c'è HPLC. Il digerito triptico è iniettato in questa colonna che è collegata con lo spettrometro di massa. È necessario avere un sistema ultraHPLC. Esistono diverse cromatografie che differiscono per le dimensioni delle particelle di fase stazionaria: - LC (liquid chromatography) - HPLC (High-performance liquid chromatography)- LC (liquid chromatography)
- HPLC (high-performance liquid chromatography)
- UPLC (ultra-performance liquid chromatography)
Il diametro dei granuli della fase stazionaria diminuisce da LC a UPLC, passando da 50 micron a 2 micron. La diminuzione del diametro dei granuli di fase stazionaria implica il miglioramento della risoluzione. Si ottengono dei picchi che sono ben separati e ampi → ben risoluti e facili da quantificare.
Minore è il diametro della colonna, maggiore è la possibilità di interazione con la colonna → maggiore pressione perché la colonna è più impaccata e maggiore definizione perché aumenta il numero di piatti teorici della colonna.
Vi è un solvente, la pompa che spinge il solvente all'interno della colonna, un iniettore per depositare il campione all'interno della colonna, la colonna stessa che determinerà la separazione, un detector per identificare i composti che escono e il computer per avere l'immagine del cromatogramma.
Posso mettere in linea
cromatografie di tipo diverso per ottenere separazioni più precise. Questo funziona bene per le identificazioni.
QUANTIFICAZIONE DELLE PROTEINE
Per avere quantificazione utilizzo isotopi → non risentono delle differenze di ionizzazione e volatilizzazione. Vengono mantenuti i rapporti tra isotopi.
All'interno dello spettro riesco a distinguere gli isotopi e l'altezza dei picchi è confrontabile tra loro. Utilizzo molecole che interagiscono coi peptidi di interesse e nella loro struttura possono contenere isotopi leggere e pesanti → ottengo tag: marco gli estratti proteici che provengono da campioni diversi.
Prendo due campioni differenti che sono controllo e patologico e marco con tag leggero e pesante → nello spettro li ottengo vicini e quantificabili. Non faccio corse indipendenti perché sono soggette ad errori che possono avvenire in una corsa e non nell'altra → ho minore riproducibilità.
Approccio label free (no tag)
consigliato su grandi campioni → variabilità attenuata. Se ho pochi campioni faccio marcatura. Il vantaggio del tag è che lifaccio correre una sola volta nello spettrometro → ho robustezza maggiore del dato. Ci sono due grandi categorie di marcatori:- isotopici → ICAT lega le cys, posso aggiungere isotopi → gli idrogeni possono essere sostituiti dai deuteri a seconda di quanto deuterioaggiungo. In questo modo recupero tutti i peptidi che contengono una cys → cys non è un aa così frequente
- isobarici
I TMT (tandem mass tag) o tag isobarici vengono utilizzati nel tandem mass spectometry e sono formati da 3 diverse porzioni:
- un reactive group, reagisce con un gruppo della proteina
- un balance group, compensa le differenze di peso del reporter in modo che le ultime due porzioni abbiamo lo stesso peso in tutti i tag. All’aumentare del peso del reporter diminuirà il peso del balance in modo che la somma sia sempre uguale
reporter group, permette l'identificazione del tag stesso ed è quello che andrò a quantificare all'interno dello spettro di massa-massa. Il peso di tale porzione cambia al cambiare dei campioni poiché vengono utilizzati diversi isotopi. Uso tag diversi per ogni campione. I peptidi marcati vengono mixati, separati per HPLC e iniettati in uno spettrometro di massa in tandem, ottenendo due spettri. Quando vado ad analizzare i picchi del primo spettro (di massa), i peptidi uguali di campioni diversi avranno stesso massa, perché saranno tutti taggati con dei tag isobarici che hanno lo stesso peso molecolare, perciò, il numero di picchi è uguale a quello che avrei nell'analisi di un singolo campione. Le intensità dei diversi picchi derivano dalla somma del numero di peptidi dei campioni (è proporzionale alla concentrazione di ciascun peptide nel campione), ma in questo modo dallo spettro di massa non si è in grado di
Capire quanto ciascuno di essi vi contribuisce. Quando vado ad analizzare i singoli picchi nel secondo spettro (di frammentazione) possono ricavare informazioni importanti per l'identificazione della proteina e per la quantizzazione → doppio risultato: identificazione peptide e quantizzazione del peptide nei diversi campioni.
Il vantaggio di usare un tag isobarico rispetto a uno isotopico è che usando un tag isotopico per marcare 8-10 campioni lo spettro MS1 si affollerebbe di picchi → li vedo tutti nel primo spettro di massa → lo spettro è così affollato che i picchi si sovrappongono. Questo problema non si pone nel tag isobarico che mostra una sola massa per peptide e permette la quantificazione → isobarico è l'evoluzione di questa marcatura.
TANDEM MASS SPECTROMETRY
Il primo vantaggio che otteniamo è che se dovessi analizzare 6 campioni differenti, li marchiamo con 6 tag differenti e successivamente li mixiamo tutti insieme.
per formare un unico campione; quindi, al posto di iniettare 6 campioni nello spettrometro, ne inseriamo solo 1. Questo ci fa risparmiare 5 corse all'interno dello spettrometro di massa, considerando che sono 100 minuti per corsa, risparmiamo 500 minuti = guadagno in tempi e in costi.
In secondo luogo, sto facendo correre tutti i peptidi derivanti da 6 campioni nello stesso momento e con la stessa condizione sperimentale, perciò correranno tutti allo stesso modo. Quando replico un'analisi cercando di tenere le stesse condizioni sperimentali per quanto lo strumento sia preciso, avanzato e costoso non otterrò mai la stessa analisi. Se riesco a far correre 6 campioni nello stesso momento, quei 6 campioni sono corsi esattamente allo stesso modo: aumento la riproducibilità e la sensibilità della mia analisi.
Posso avere uno strumento che mi dà le masse dei peptidi che inietto, una prima identificazione può essere effettuata direttamente su
questo spettro →dalle masse posso risalire ad identificare la pp, se la pp è depositata in un database come uniprot riesco ad identificarla. So che proteasi ho usato perottenere i peptidi → tripsina, ottengo peptidi di una lunghezza facilmente ionizzabile e quindi individuabili nello spettro. Dallo spettrometro c
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