Prof. Capitanio biotecnologie mediche (esame di biotecnologie in diagnostica di laboratorio e fondamenti di statistica)

Preparazione del campione e tecniche di frazionamento

Percorso analitico

• Ottenere un campione rappresentativo
• Trasformare il campione in forma adatta all’analisi
• Rimuovere o mascherare le interferenze
• Eseguire l'analisi

Preparazione del campione

Dobbiamo trasformare il campione nella forma più adatta possibile per l’analisi.

Fase pre-analitica

Sequenza cronologica di tutti gli eventi relativi a un’analisi chimico-fisica che avvengono prima dell’attività analitica vera e propria. La standardizzazione dei metodi di raccolta e di pre-trattamento dei campioni biologici è una delle fasi più importanti e delicate dell’intero processo analitico, contribuendo al buon esito dell’analisi di laboratorio. La rigorosa applicazione delle corrette modalità di prelievo, trasporto, trattamento e conservazione del campione è condizione preliminare ed essenziale per garantire l’attendibilità dei risultati ottenuti con le tecniche di biologia molecolare.

Prelievo, conservazione (temperatura, tempo) e trasporto sono fasi molto importanti da un punto di vista analitico. L’attendibilità del dato analitico finale, quindi la sua qualità, dipende non solo dalla bontà del metodo utilizzato e dalla qualità di esecuzione del metodo stesso, ma anche dall’appropriatezza delle modalità di campionamento, prelievo e conservazione dei campioni, che devono essere quindi standardizzate. Queste fasi determinano la variabilità pre-analitica di un metodo.

La variabilità pre-analitica dipende da condizioni che possono influenzare:

• Composizione del materiale biologico del soggetto: campionamento (da dove viene effettuato il prelievo), variabilità biologica (sesso, età, etnia).
• Composizione del materiale biologico come conseguenza delle modalità di effettuazione del prelievo (es: emolisi).
• Composizione, proprietà o morfologia del materiale biologico come conseguenza della conservazione.

Conservazione dei campioni

• Idealmente, il campione biologico dovrebbe essere analizzato immediatamente. Nella realtà questo accade solo per le urgenze; negli altri casi, i campioni vengono conservati per un certo tempo prima dell’analisi per ragioni economiche ed organizzative. Inoltre, può essere necessario conservare i campioni per ripetere l'analisi o effettuare analisi diverse successivamente.
• Un altro fattore critico da tenere in considerazione è il trasporto del campione dal luogo di prelievo al laboratorio di analisi.

Cause di alterazione dei campioni

I campioni biologici possono alterarsi per cause diverse e in tempi diversi:

• Cause di natura fisica: tempi relativamente lunghi.
• Cause di natura chimico-fisica: tempi brevi o medi.
• Cause di natura biochimica/biometabolica: tempi brevi o brevissimi.

Cause di natura fisica

Riguardano prevalentemente i cambiamenti di fase (liquido-solido, liquido-vapore):

• Evaporazione: provoca un aumento della concentrazione degli analiti, quindi inficia l’accuratezza della misura. Dipende dalla temperatura, umidità relativa, ventilazione, geometria e volume di riempimento del contenitore.
• Solubilità: sangue, siero e plasma hanno una componente proteica che funge da stabilizzatore. Nell’urina, abbassamenti di temperatura a valori ambiente o di frigorifero (+ 4°C) e variazioni di pH possono ridurre la solubilità.
• Adsorbimento: elementi oligominerali (metalli) possono essere adsorbiti sulla parete dei contenitori, per questo sono necessari materiali inerti.
• Desorbimento: cessione di materiale dai contenitori, in particolare metalli. Il vetro presenta questo problema, propilene e teflon sono più appropriati.

Cause di natura chimico-fisica

Includono processi in grado di indurre modificazioni nella composizione o nella struttura di alcuni costituenti biochimici:

• Fotolisi: dovuta all’interazione della luce solare con molecole fotoassorbenti che vengono alterate (es: bilirubina, composti porfirinici, vitamine).
• Denaturazione: modificazione sterica o strutturale di siti attivi di proteine enzimatiche o recettoriali tissutali. Può dipendere da tempo, temperatura, pH, composizione della matrice biologica.
• Aggregazione: a carico di proteine tra cui si formano legami a basso contenuto energetico: ponti disolfuro, legami idrogeno, forze di Van der Waals ed elettrostatiche, alterazione delle caratteristiche di legame delle proteine stesse.

Cause di natura biochimica/biometabolica

In vivo, è attivo un sistema di regolazione omeostatica che mantiene costante la concentrazione dei metaboliti. In vitro questo meccanismo manca e inoltre cambiano la temperatura e si ha il contatto con l’aria. Anche in poche ore si possono avere drastici aumenti o decrementi di concentrazione di alcuni analiti.

Provvedimenti

• Conservazione alla temperatura ottimale
• Conservazione al buio
• Liofilizzazione
• Modificazione del pH
• Aggiunta di sostanze chimica per evitare fenomeni indesiderati (es: sostanze che impediscono l’ossidazione dei gruppi -SH e la formazione di ponti disolfuro, quali il ditiotreitolo DTT)

Emolisi

Rottura dei globuli rossi con conseguente liberazione di emoglobina nel siero o nel plasma. Visibile macroscopicamente perché il colore del plasma passa dal giallo al rosato-rosso. L’emolisi è una delle ragioni più frequenti di inadeguatezza qualitativa dei campioni di sangue. Fenomeno che può essere dovuto a:

• Errori di tipo analitico metodologico:
  • Interferenze fisiche: assorbimento dell’emoglobina attorno a 405 nm e 550-575 nm, interferisce su analisi colorimetriche. Errori sono controllabili mediante strumenti che effettuano letture a due lunghezze d’onda.
  • Interferenze chimiche: inibizione di reazioni di diazotazione o di reazioni enzimatiche utilizzate per la determinazione di certi analiti.
• Errori dovuti a cause fisiologiche: ineguale distribuzione di molte sostanze tra la parte liquida e la parte corpuscolata del sangue. Glucosio, colesterolo totale, esteri del colesterolo, Na⁺, Cl^- hanno concentrazione più elevata nel plasma che nei globuli rossi, in caso di emolisi si ha una diluizione di questi componenti. Fosfatasi acida, transaminasi, lattato deidrogenasi al contrario, enzimi quali K⁺ hanno concentrazione più elevata all’interno degli eritrociti piuttosto che nel plasma, quindi in caso di emolisi si ha una sovrastima.

Cause di emolisi

• Biologiche: anemie emolitiche per difetti endogeni o esogeni:
  • Endogeni: difetti morfologici o deficienze di enzimi endoeritrocitari.
  • Esogeni: anticorpi (emolisine) acquisiti in seguito a reazioni trasfusionali, anemie emolitiche autoimmuni, infezioni, assunzione di farmaci.
• Meccaniche: uso di aghi troppo sottili e/o aspirazione eccessiva durante il prelievo; centrifugazione a velocità troppo elevate.
• Chimiche o osmotiche: presenza di disinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche sulla cute, nell’ago o nella provetta.
• Fisiche: conservazione prolungata del campione in condizioni non idonee, soprattutto di temperatura (troppo elevata o troppo bassa). Ad esempio, il congelamento provoca cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria e rottura delle membrane.

Preparazione del campione

L’analisi dei campioni richiede una fase preliminare che consiste nel portare il campione nella forma più opportuna ai fini della determinazione analitica. La maggioranza delle analisi si effettuano per via umida: il campione, se non è già liquido, va portato in soluzione, o quantomeno va solubilizzata la parte che contiene l’analita di interesse. La varietà delle matrici fa sì che sia difficile enunciare regole valide per ogni tipo di campione. A seconda della sua natura chimica (organica o inorganica, acida, basica o neutra, solubile in ambiente acquoso o in solventi organici) e della tecnica analitica utilizzata, si dovrà selezionare il metodo di pre-trattamento più opportuno.

Fase 1: Omogeneizzazione e trattamenti pre-estrazione

Ha l’obiettivo di rendere omogenee matrici disomogenee e di rendere disponibile l’analita al solvente di estrazione. Tipo di campione: tessuti (biopsie, in paraffina, etc.), colture cellulari, fluidi biologici (sangue, urina, liquor, saliva, etc).

Per prima cosa bisogna rompere le cellule. La rottura delle cellule consiste nella rottura delle membrane e pareti cellulari, con rilascio dei componenti intracellulare. I metodi impiegati cambiano a seconda del tipo di materiale di partenza e a seconda di cosa si intende studiare.

Metodi blandi:

• Shock osmotico: le cellule vengono poste in un ambiente ipo-osmotico, l’acqua così viene richiamata nella cellula.
• Digestione enzimatica: se le cellule sono dotate di una parete (vegetali e batteri).
• Utilizzo di detergenti per dissolvere la membrana cellulare (come l’SDS).
• Omogenizzatori di tipo potter: viene sfruttata l’azione meccanica, le cellule si rompono perché sottoposte a forza di attrito.

Metodi moderati:

• Omogenizzatori a lama: utilizzato per organi interni.
• Macinazione con mortaio e pestello (assieme ad azoto liquido).

Metodi vigorosi:

• French press: grosso cilindro munito di una valvola, la compressione costringe le cellule a passare in un foro molto sottile.
• Sonicazione: puntale che vibra alla frequenza degli ultrasuoni che disgregano il tessuto stesso.
• Macinazione con microsfere: avviene in liquido in cui si trovano nelle palline molto piccole che messe in agitazione vanno a disgregare le cellule.

Trattamento dei fluidi biologici

Il sangue è formato da una parte liquida (plasma) e una parte corpuscolata (eritrociti, leucociti e piastrine). Il plasma viene ottenuto per centrifugazione in presenza di anti-coagulanti. Il siero invece viene ottenuto senza utilizzare gli anti-coagulanti, il campione viene lasciato per un paio d’ore a temperatura ambiente e avviene la coagulazione. Centrifugazione siero (plasma privato del fibrinogeno).

Ematocrito (%) = volume corpuscoli / volume totale x 100.

Il plasma è formato per il 90% di acqua e da un 10% di sostanze solide: albumina, globuline, fibrinogeno, proteine coniugate (lipoproteine e glicoproteine), enzimi, sali inorganici. Il plasma riflette l’attività di altri organi e la sua composizione non è modificata sostanzialmente da una propria attività metabolica. La misura dell’attività di enzimi plasmatici può essere utilizzata, oltre che per la diagnosi, anche a scopo prognostico. Quando si deve analizzare la parte liquida del sangue, si potrebbero utilizzare indifferentemente plasma o siero, tranne quando si deve determinare il fibrinogeno. Di solito viene utilizzato il plasma perché il processo della coagulazione in vitro coinvolge non solo la parte corpuscolata e i fattori della coagulazione ma, attraverso i danni subiti dalle cellule inglobate dal coagulo, induce la liberazione di parte del contenuto cellulare, con conseguente variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma. Per ottenere il plasma bisogna però aggiungere delle sostanze che potrebbero alterare il campione a loro volta.

Anti-coagulanti

• Chelanti del calcio: EDTA e i suoi sali, citrato (determinazione della VES e funzionalità piastrinica).
• Eparina: cofattore dell’antitrombina III, in combinazione con la quale inattiva rapidamente la trombina e il fattore X attivato. Non può essere utilizzata per studi morfologici (conferisce colorazione scura alle cellule).

L’utilizzo improprio o inaccurato degli anti-coagulanti può contribuire ad aumentare la variabilità pre-analitica. Se l’analisi viene effettuata sul siero, il campione di sangue viene lasciato a 1-2 ore a temperatura ambiente per consentire la formazione del coagulo. Viene poi centrifugato per consentire il recupero del maggiore volume possibile di siero. Spesso, per facilitare la separazione tra il coagulo e il siero, le provette in cui il sangue viene raccolto contengono delle sostanze con peso specifico intermedio tra quelli delle cellule ematiche e del siero. Il siero deve essere separato dal coagulo il più presto possibile per evitare il rilascio di sostanze dalle cellule, che potrebbero alterarne la composizione. Il sangue arterioso viene prelevato per determinare la concentrazione dei gas ematici CO₂ e O₂ e il pH (valutazione dell’equilibrio acido-base ematico).

Fase 2: Estrazione

Separazione dell’analita da matrice e interferenti.

Estrazione liquido-liquido

Permette di portare in soluzione gli analiti di interesse lasciando la matrice quasi intatta. Si effettua in contenitore chiuso ponendo il campione a contatto con un solvente con esso immiscibile, nel quale siano solubili gli analiti. L’estrazione si effettua ponendo in agitazione (analita si deve ripartire tra i due solventi) il campione ed il solvente per un tempo determinato, attendendo poi la separazione di fase e recuperando la fase solvente che contiene gli estratti di interesse. Presente un separatore che separa le due fasi (passa solo il solvente organico perché è una membrana idrofobica). L’ampia gamma di solventi a disposizione permette di effettuare estrazioni molto selettive.

Estrazione con fasi solide

L’estrazione con fasi solide prevede l’utilizzo di una fase estraente costituita da una colonna impaccata con materiale avente proprietà sorbenti utilizzata per estrarre selettivamente gli analiti di interesse e per purificare i campioni che si vogliono analizzare. La tecnica sfrutta l’affinità di una fase sorbente per alcune sostanze presenti nel campione, che possono essere sia gli analiti di interesse sia sostanze interferenti che si desidera eliminare dal campione. La scelta del materiale sorbente più opportuno rende possibile modulare la procedura a seconda delle necessità. La fase solida tiene legato l’analita e fa passare tutto il resto, viene poi legata con un tampone più affine per l’analita al fine di permettere l’eluizione. Se si desidera eliminare gli interferenti anziché trattenere gli analiti, è sufficiente usare una fase solida con affinità per i composti che si vuole eliminare dal campione. Rispetto all’estrazione liquido-liquido è più rapida, economica, ha rese più elevate, è più precisa (evitate cross-contaminazioni), consente una minore manipolazione del campione, non provoca danni ai campioni più delicati, è più sicura.

Estrazione degli acidi nucleici

Metodi: fenolo/cloroformio, kit commerciali, sistemi automatizzati. La scelta del metodo dipende da:

• Tipo di acido nucleico da estrarre
• Materiale di partenza
• Risultato desiderato in termini di resa, purezza, tempo impiegato
• Applicazione prevista post-estrazione

Fasi

1. Lisi della membrana cellulare
2. Denaturazione e separazione delle proteine
3. Isolamento degli acidi nucleici dai residui cellulari associati

Metodo del fenolo/cloroformio

Metodo di estrazione classico basato sulla diversa solubilità delle molecole in soluzione tra due fasi non miscibili:

• Lisi delle membrane con detergente (SDS)
• Trattamento con enzimi proteolitici (proteinasi K)
• Estrazione con solventi organici (fenolo/cloroformio) che denaturano le proteine e le veicolano nella fase organica
• Precipitazione delle proteine utilizzando sali ad elevata concentrazione (salting-out)
• Centrifugazione

Estrazione di DNA su colonnina

Piccole quantità di campione di partenza, campioni biologici come sangue fresco o congelato, campioni prelevati a scopo forense, sangue su cartoncino rapida (30 minuti), produce DNA di alta qualità.

Purificazione DNA su gel di silice

Metodo basato sulla proprietà degli acidi nucleici di adsorbirsi alla silice, a differenza delle proteine e altri composti organici:

• Lisi del campione con tampone contenente detergenti, proteinasi K, sali (56°C per 10 minuti)
• Adsorbimento del DNA al gel di silice contenuto in una colonna in presenza di etanolo e sali cautropici; il DNA si lega alla silice
• Lavaggi con soluzioni contenenti alcool in grado di rimuovere le proteine denaturate e gli altri componenti cellulari e lasciare il DNA legato alla silice
• Eluizione del DNA con acqua o soluzioni a bassa concentrazione salina

Estrattore automatico

Eliminazione delle variabili e dei rischi associati alla preparazione manuale dei campioni. Aumento della standardizzazione e della sicurezza delle indagini di diagnostica molecolare:

• Lisi delle membrane con buffer di lisi
• Aggiunta di particelle magnetiche che legano il DNA
• Eluizione dei contaminanti e ritenzione del DNA mediante magnete
• Distacco delle particelle magnetiche con buffer di lavaggio
• Ritenzione delle particelle mediante magnete ed eluizione del DNA