Prof. Capitanio biotecnologie mediche (esame di biotecnologie in diagnostica di laboratorio e fondamenti di statistica)

METODI IMMUNOISTOCHIMICI

La risposta immunitaria umorale è mediata dagli anticorpi (immunoglobuline), delle glicoproteine che possiedono domini costanti e

domini variabili, in grado di riconoscere antigeni specifici che sono prodotti dai linfociti B

Gli anticorpi strutturalmente più semplici sono le IgG, glicoproteine costituite da due catene leggere e

due catene pesanti che interagiscono mediante ponti disolfuro e interazioni non covalenti formando

una molecola simmetrica a forma di Y

L’enzima proteolitico papaina rompe le IgG in una regione a cerniera (hinge) producendo due

frammenti Fab (antigen binding) identici e un frammento Fc

Le IgG legano gli antigeni in tre regioni ad ansa presenti nei domini variabili

L’unione che si instaura tra un antigene e il corrispondente anticorpo porta alla formazione di un immunocomplesso

Unione altamente specifica, regolata da forze di tipo chimico-fisico (legami di natura non covalente) sistema chiave-serratura

⇾

I metodi immunometrici sfruttando le caratteristiche uniche del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente

specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse

Affinità forza del legame tra un singolo determinante antigenico e un singolo sito di legame dell’anticorpo

⇾ somma delle forze attrattive e repulsive

Avidità forza totale del legame tra un antigene con molti determinanti e anticorpi multivalenti

⇾ IgM hanno 5 siti di legame, sono avide

Specificità capacità di legare selettivamente l’analita distinguendolo da altre molecole di struttura simile

⇾

La tendenza dell’anticorpo a legare altre molecole strutturalmente simili all’analita viene quantificata attraverso la sua reattività

crociata

- capacità di un singolo anticorpo di reagire contro più determinanti antigenici

- capacità di una popolazione di anticorpi di reagire contro più antigeni

Strategie di sintesi dell’immunogeno

La scelta della posizione di funzionalizzazione usata per la sintesi dell’immunogeno permette di ottenere anticorpi per diverse

applicazioni

Si deve decidere prima se avere un target preciso (singola molecola) o target più ampi (classe di molecole)

Possono essere prodotti:

- anticorpi policlonali

derivano dall’immunizzazione ripetuta dell’animale con l’antigene l’antigene presenta molti epitopi, prodotti anticorpi che

⇾

riconoscono molti epitopi

- anticorpi monoclonali

prodotti tramite fusione di un linfocita e una cellula tumorale (di solito mieloma) ibridoma che produce solo un tipo di anticorpo

⇾

che riconosce sempre lo stesso epitopo dell’antigene

Vantaggi dei metodi immunometrici

Elevata specificità

⇾ perché si basano sull’elevata specificità di riconoscimento tra antigene e anticorpo

utilizzati direttamente su campioni fluidi (siero, urina, latte)

utilizzati dopo omogeneizzazione ed estrazione di campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti)

Basso limite di rivelazione

⇾ impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa

i traccianti in questo caso sono anticorpi o antigeni coniugati chimicamente con un marcatore (label)

vengono utilizzati piccoli volumi di campione e di reagenti per effettuare diagnosi precoce e determinare la presenza di sostanze in

tracce

Alta produttività analitica

⇾ impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti che permettono l’analisi di numerosi campioni (circa 40 o 200 in duplicato) nella

stessa seduta analitica

rapida esecuzione, servono poche ore ed è possibile analizzare numerosi campioni per giorno

Possibilità di automazione

⇾ disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici

ottimizzazione delle fasi analitiche: meno errori, aumento della precisione e accuratezza, aumento della rapidità

Elementi base del sistema di rivelazione

Analita molecola la cui concentrazione può essere misurata con un metodo immunometrico

⇾ può essere in due forme: libera o legata (complesso antigene-anticorpo)

Traccianti la formazione di un complesso antigene-anticorpo non è in genere facilmente misurabile

⇾ viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, non viene infatti rivelato l’analita, introducendo un

tracciante che partecipando alla reazione immunologica la evidenzia con alta rivelabilità

viene ottenuto legando un label opportuno (specie facilmente rilevabile con una opportuna tecnica analitica) all’antigene,

a un derivato dell’antigene o a un anticorpo

il tracciante deve essere caratterizzato da un elevato rapporto segnale/massa, il segnale deve essere rilevabile anche con

poca quantità di tracciante

Label più utilizzati sono:

- isotopi radioattivi

- molecole fluorescenti ⇾ fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina)

⇾ fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi)

⇾ fluorescenza polarizzata (fluoresceina)

- molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio)

- enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, β-galattosidasi) determinabili con substrati ⇾ cromogenici

⇾ fluorescenti

⇾ chemiluminescenti

La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità dei marcatori (isotopi, sostanze fluorescenti, radicali liberi, enzimi)

possono essere combinate insieme per compiere un dosaggio immunologico, ossia quantificare con precisione una sostanza antigenica

La tecnica più utilizzata è il dosaggio radioimmunologico (RIA), in cui il tracciante è costituito da un isotopo radioattivo

Vantaggi: elevata sensibilità, invariabilità delle cinetiche di reazione post-marcatura

Svantaggi: alti costi, deperibilità, pericolosità e difficoltà di smaltimento dei composti radioattivi, necessità di personale specializzato

Quando il tracciante è costituito da un enzima, si parla di dosaggi immunoenzimatici (EIA)

non viene misurato direttamente il marcatore, ma la sua attività nei confronti di un suo substrato specifico (ovvero la quantità di

prodotto formato)

E’ da tener presente che l’attività enzimatica, come pure l’affinità antigene-anticorpo, può variare a seguito della coniugazione fra

enzima e anticorpo (o antigene)

Vantaggi: minor costo, assenza di rischi, maggiore praticità

La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in un

prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria

L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di abbassare il limite di rivelazione del metodo

L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima

genera moltissime molecole di prodotto)

Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o

molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori

L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

Vantaggi

- sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili

- sono disponibili numerose metodiche semplici e automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica

- una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto

- è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo

- misurazione anche di piccole quantità di antigene aumentando il tempo di esposizione

Svantaggi

- l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti

- la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica

- si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione

Criteri di scelta dell’enzima

- stabilità alle temperature a cui vengono svolti i saggi (4°C, 25°C e 37°C)

- emivita maggiore di sei mesi quando storato a 4°C

- disponibilità commericale

- possibilità di coniugazione con antigeni o anticorpi

- poco costoso

- attività facilmente misurabile

- alto turn-over

- deve funzionare sempre in ogni saggio, non deve essere influenzato da altre sostanze

Perossidasi

Oloenzima che catalizza l’ossidazione di un substrato in presenza di H O

2 2

Ha come substrati fenoli aromatici o ammine, come donatori di idrogeni

Essendo una molecola piccola, può essere legata in più unità sullo stesso

anticorpo (rapporto 4:1) in modo da aumentare la sensibilità

Fosfatasi alcalina

Metalloenzima contenente due atomi di zinco

Catalizza l’idrolisi del gruppo fosforico presente sul substrato (substrato tipico

è il p-nitrofenil fosfato)

Ha un ingombro sterico maggiore

Classificazione dei metodi immunometrici

Competitivi

Si basano sulla modulazione del segnale analitico dovuta alla competizione tra le molecole di analita e quelle del

tracciante per un numero limitato di siti anticorpali

Il segnale analitico diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita presente nel campione, la curva

dose-risposta ha forma sigmoidale

Non tutto il tracciante è legato, tanto meno quanto più è l’analita nel campione

Non competitivi

Tutto l’analita presente nel campione viene catturato dall’anticorpo in eccesso e rivelato

Il segnale analitico è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, la curva dose-

risposta è lineare

sale grafico in proporzione alla concentrazione dell’analita

Metodi eterogenei

Su fase solida

Il metodo di rivelazione non permette di distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero

Metodi omogenei

Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta o riduce) l’attività

Questi metodi non necessitano della separazione della frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase liquida

Principio di funzionamento dei metodi competitivi

La misura della quantità di analita (An) è basata sulla competizione con il tracciante (An*) per un numero limitato

di siti anticorpali (Ab)

Metodo competitivo ETEROGENEO: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame

⇾

del tracciante all’anticorpo

Interpretazione dei risultati

La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione della lettura del campione incognito su di una curva

dose-risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard

La curva viene prodotta rappresentando B/B in funzione del logaritmo della

0

concentrazion