Modulo di biotecnologie nella diagnostica di laboratorio (esercitazioni in aula)

GEL FILTRATION può essere accoppiato ad altre SCAMBIO IONICO tecniche cromatografiche.

ha una capacità separativa su molecole RPLC idrofobiche ma non tanto quanto le proteine (NB.: Proteine più idrofobiche dei peptidi).

Nella reverse phase la resina è una fase stazionaria altamente idrofobica, apolare caratterizzata da lunghe catene di atomi di carbonio (18C). (normal phase, NPLC, ha una fase stazionaria idrofila)

Nella RPLC mettendo un solvente che da polare diventa progressivamente apolare si eluiscono prima i più idrofili (polari) e via via fino ai più idrofobici.

Domanda 5: Nella spettrometria di massa, dall'analisi dello spettro non si può risalire direttamente alle concentrazioni delle sostanze in esame.

Le intensità dei picchi non rispettano le concentrazioni perché la prima fase, la ionizzazione, è diversa, alcune sostanze ionizzano meglio di altre.

Nell'unità di tempo si producono diverse

quantità di ioni di sostanze diverse. Due caratteristiche fondamentali delle sostanze:

1. La sostanza deve essere IONIZZABILE
2. Le sostanze devono essere devono VOLATILI, poter staccarsi dalla matrice di origine e, spinte dal campo elettrico, poter viaggiare nel vuoto.

Quantizzazione istantanea dall'intensità dello spettro non possibile → La spettrometria di massa non è una tecnica quantitativa → NB.: Le intensità dei picchi di possono essere confrontate, rimangono in rapporto molare tra loro hanno un ISOTOPI rapporto quantitativo.

Gli isotopi conferiscono stessa ionizzabilità e volatilità. Per ogni specie, gli isotopi che ne fanno parte sono in rapporto, quindi le intensità dei loro spettri, dei loro picchi sono in rapporto molare tra loro. Si sfrutta questo per marcare i campioni e quantizzare anche molecole totalmente diverse. → La spettrometria di massa è quantitativa se si fa un rapporto tra isotopi.

Con le

1. Tecniche di marcatura isotopica: la quantificazione è fatta sullo spettro di massa MS.
2. Tecniche di marcatura isobarica: l'analisi quantitativa è fatta sullo spettro di massa-massa MS/MS, uno spettro di frammentazione di un singolo picco dell'MS.

Vantaggio delle tecniche di marcatura isobarica: quando si hanno molte cose da confrontare tra loro, si costruiscono tag per ciascuna e si mixano i campioni in modo da analizzarli nello stesso esperimento per una standardizzazione del sistema.

In uno spettro MS con tag isotopici, si avranno tanti picchi vicini (se la risoluzione è scarsa, non si distinguono) tanti quanti sono i tag usati, rendendo lo spettro molto complicato.

In uno spettro MS/MS con tag isobarici (NB: che hanno peso uguale), si ottiene la sequenza del peptide e tutti i picchi degli isotopi che derivano dal tag (si confrontano in rapporto stechiometrico con le quantità del campione).

Non tutte le tecniche possono poi essere traslate in un laboratorio ospedaliero. In ricerca.

sicuramente si usano approcci più lunghi rispetto a quelli poi applicabili in clinica. Lezioni dedicate all'approccio da seguire per l'identificazione di nuovi biomarcatori proteici a partire da un campione biologico, un estratto cellulare o una biopsia.

SLIDE 66 LEZ 5 GELFI→ Due approcci perché in entrambi ci sono vantaggi e svantaggi. La scelta di uno o dell'altro dipende dalla ricerca che si deve condurre, dal tipo di strumentazione a disposizione...

APPROCCIO BOTTOM-UP→ Partendo dal campione (estratto da qualcosa), questo viene tutto digerito con un enzima proteolitico a scelta e, solo i prodotti della digestione sono poi separati ed analizzati.
• La fase separativa dei peptidi (uscita del cromatografo) è direttamente collegata allo spettrometro di massa (uscita del cromatografo collegata alla sorgente dello spettrometro di massa) la cui sorgente processa un campione in fase liquida.
• →Si ha un miscuglio di peptidi

provenienti da un intero proteoma spettro ottenuto molto complicato.

Lo strumento deve essere ad e deve avere (deve poter elaborareALTA RISOLUZIONE ALTA PROCESSIVITÀun numero di spettri nell’unità di tempo molto alto).

• Per trovare modificazioni post-traduzionali necessario cercarle volta per volta con ricerche mirate.
• Analisi dati: si ha una mixtura di peptidi provenienti da proteine diverse.

TANDEM MASS SPECTROMETRYAPPROCCIO TOP-DOWN

Estratto proteico separato nelle proteine costituenti e poi ciascuna proteina analizzata ed identificata.

• Le proteine sono analizzate una alla volta, sono prese e deposte su una piastra apposita e analizzate con uno

strumento che ha una sorgente di tipo impulsivo che produce ioni solo in seguito ad impulso (“a comando”)sorgente di tipo MALDI che lavora in fase solida (campione cristallizzato su un target).

può condurre così un’analisi anche su un centinaio di campioni

Per volta, si ma sempre una proteina alla volta.

• Spettri ottenuti più semplici e campioni analizzabili in qualsiasi momento.

Strumento ad e richiesta

ALTA RISOLUZIONE PROCESSIVITÀ PIÙ BASSA.

• Si possono usare tecniche separative sulle proteine intere questo permette di analizzare nel proteoma anche modifiche alle proteine che nel bottom-up non si vedono alla prima separazione.
• Es.: modificazioni post-traduzionali (si osservano nel gel 2D) che alterano punto isoelettrico o peso molecolare.
• "quella"

Analisi dati: identificazione più semplificata, si hanno solo le masse dei peptidi provenienti da proteina.

masse trovate da confrontare con le masse delle proteine nel database.

PEPTIDE MASS FINGERPRINT:

Se fallita identificazione (es.: peptidi con sequenza diversa ma stessa massa) si procede con:

si prende ciascun peptide che si frammenta così si ottiene la sequenza

TANDEM MASS SPECTROMETRY

che permette l'identificazione.

APPROCCIO BOTTOM-UP OTTENIMENTO DI UN BUON ESTRATTO PROTEICO: Step fondamentale: Obiettivo: solubilizzare con maggior resa possibile le proteine portandole in soluzione in un adeguato tampone.

• LISI DEL CAMPIONE

TAMPONE DI LISI che contiene:

• detergente che solubilizza le proteine (es.: non utilizzabile in questo caso SDS perché è un detergente anionico e rende le proteine tutte con la stessa carica. Usati NP40, detergente non ionico che non apporta cariche pur facilitando la solubilizzazione del prodotto oppure detergenti zwitterionici)
• soluzione tampone che ricostituisce le condizioni fisiologiche
• β-mercaptoetanolo - agente riducente dei ponti disolfuro (es.:)
• agente denaturante, una sostanza che interferisce con le interazioni deboli che una proteina fa nella sua struttura secondaria (es.: urea ad alte concentrazioni 7-8 M, temperatura, pH)
• inibitori delle proteasi

particolare per la conservazione del campione+ nucleasi per rimuovere gli acidi nucleici (rendono viscoso l'estratto e intoppano per esempio le maglie deigel), oppure si ottiene lo stesso risultato tramite sonicazione ad ultrasuoni→ necessario rifarla perché la riduzione non è un cambiamento irreversibile e gli agenti riducenti2. RIDUZIONE evaporano dopo un po', quindi idel tampone di lisi ponti disolfuro possono riformarsi, riossidarsi.NB.: Si possono formare sia nelle stesse catene ma anche tra catene diverse.l'agente alchilante attacca lo zolfo→ e si lega ad esso. Si trova così uno S legato3. ALCHILAZIONEcovalentemente ad un alchile.Così si bloccano in modo permanente le cisteine nello stato ridotto. Non si formeranno più i ponti disolfuro.l'estrazione in fase solidaIl procedimento descritto è il workflow classico di laboratorio, ma si può fare con colonnine,con dei kit, dove è possibile

Eseguire questi step più velocemente e con più semplicità. Preso l'estratto, si quantifica e si procede alla digestione.

4. DIGESTIONE PROTEICA

Si usano diversi enzimi proteolitici, il più comune è la tripsina che produce peptidi di massa ben adatta ad essere usata in spettrometria di massa (3000-5000 Da).

La tripsina, come tutti gli enzimi proteolitici, è venduta in forma liofilizzata ed è da conservare in una soluzione acida (circa pH 2) per mantenerla inattiva necessario perché altrimenti in forma attiva si avrebbe auto-proteolisi della stessa tripsina.

Per attivare la tripsina il campione deve essere a circa pH 8. La tripsina taglia a valle di un residuo lisina o arginina (affinità maggiore per questa) spesso si possono trovare dei missed-cleavage (tagli mancati proprio dove c'è la lisina). Per ottenere un vero digerito triptico si può aggiungere una proteasi Lys-C che rende tutto

più efficiente perché assicura il taglio presso le lisine.

5. RIMOZIONE DI CONTAMINANTI ED INTERFERENTI

PIU’ ADATTO PER L’ANALISI IN SPETTROMETRIA DI MASSA

6. SOSPENSIONE PEPTIDI NEL TAMPONE

Le colonnine esistenti sono di diversi tipi.

Si fanno aderire le molecole di interesse ad una fase stazionaria, che ha affinità per la molecola di interesse e non per altre componenti, per pulirle.

Le molecole poi sono eluite per ristaccarle dalla colonnina e si ottiene un purificato.

7. PEPTIDE QUANTIFICATION ASSAY

È necessario semplificare il miscuglio di peptidi/proteine presente nel campione per avere poi nello spettrometro di massa picchi singoli, analizzabili.

Questo si può fare tramite: CROMATOGRAFIA IN FASE LIQUIDA

Una fase di separazione in (LC):

→LC, HPLC, UPLC

Ci sono diversi tipi di cromatografia liquida: cambiano le dimensioni delle particelle di fase stazionaria, diminuisce il diametro da LC a UPLC. Questo migliora molto la risoluzione. (aumentano

I costi ovviamente da LC a UPLC e anche problemi nell'uso)

HPLC

Componenti fondamentali :

• Solvente
• Pompa
• Iniettore
• Colonna
• Detector (più usato consiste in uno spettrofotometro)
• Immagine, cromogramma
• Computer per data acquisition

Differenti tipi di cromatografia:

• Fase stazionaria è NORMAL PHASE LC: un composto polare e fa passare una fase mobile non polare
• Fase stazionaria è un composto non polare (idrofobica caratterizzata da lunghe catene REVERSED PHASE LC: di carbonio come C18) e fa passare una fase mobile increasing non polare (non ha sempre la stessa concentrazione ma un gradiente, passa da polare a quasi non polare).

I peptidi idrofobici, ma meno delle proteine intere, tendono a rimanere adesi alla fase stazionaria