Modulo di biotecnologie nella diagnostica di laboratorio (esercitazioni in aula)

Esercitazioni biotecnologie nella diagnostica di laboratorio

Prof. Capitanio

Domanda 1

• Spettrometria di massa
• Cromatografia
  Collegabile il cromatografo allo spettrometro di massa. L'uscita dell'eluito da una colonna può entrare direttamente nello spettrometro di massa. A monte, sono parte della trascrittomica.
• Elettroforesi capillare
  Facilmente accoppiabile con lo spettrometro di massa.
• 2D elettroforesi
  Vantaggio: elettroforesi dimensionale separa le proteine anche in base al punto isoelettrico. Nel gel si trovano diverse proteoforme di una proteina dovute a modificazioni post-traduzionali (NB.: non dice quali sono ma che sono presenti), forme di splicing alternativo (isoforme).
  Es.: Il cambio di punto isoelettrico può essere dovuto a fosforilazione (P carico neg) (punto isoelettrico si sposta verso polo positivo, shifta verso anodo). Cambio del peso molecolare (almeno 500 Da per essere distinti nel gel) può essere dovuto a ubiquitinazione, taglio proteolitico, differenze in glicosilazione.

Domanda 2

Anche le tecniche più sensibili hanno dei limiti di sensibilità. La spettrometria di massa non riesce ad analizzare composti di 3-5 ordini di grandezza meno concentrati rispetto alla componente più abbondante presente nell'estratto.

Domanda 3

• Cromatografia
• Elettroforesi
  Es.: elettroforesi in liquido per separare le proteine mediante range di punti isoelettrici.
• Frazionamento cellulare-subcellulare
  Per selezionare proteine presenti solo nei mitocondri, in altri organelli, proteine strutturali nel citosol...
• Immunoprecipitazione
  Se fatta in maniera selettiva, usando un anticorpo per sottrarre le proteine più abbondanti.

Domanda 4

• Dimensione media di un peptide: 3000-5000 Da
• Proteine arrivano anche a 200.000 Da per la separazione di proteine intere è possibile usare e non per i peptidi.
• Gel filtration
  Può essere accoppiato ad altre tecniche cromatografiche.
• Scambio ionico
  Ha una capacità separativa su molecole idrofobiche ma non tanto quanto le proteine (NB.: Proteine più idrofobiche dei peptidi). Nella reverse phase la resina è una fase stazionaria altamente idrofobica, apolare caratterizzata da lunghe catene di atomi di carbonio (18C). (Normal phase, NPLC, ha una fase stazionaria idrofila). Nella RPLC, mettendo un solvente che da polare diventa progressivamente apolare, si eluiscono prima i più idrofili (polari) e via via fino ai più idrofobici.

Domanda 5

Nella spettrometria di massa, dall'analisi dello spettro non si può risalire direttamente alle concentrazioni delle sostanze in esame. Le intensità dei picchi non rispettano le concentrazioni perché la prima fase, la ionizzazione, è diversa: alcune sostanze ionizzano meglio di altre. Nell'unità di tempo si producono diverse quantità di ioni di sostanze diverse.

• Due caratteristiche fondamentali delle sostanze:
  • La sostanza deve essere ionizzabile
  • Le sostanze devono essere volatili, poter staccarsi dalla matrice di origine e, spinte dal campo elettrico, poter viaggiare nel vuoto.
• Quantizzazione istantanea dall'intensità dello spettro non possibile. La spettrometria di massa non è una tecnica quantitativa.
  NB.: Le intensità dei picchi di possono essere confrontate, rimangono in rapporto molare tra loro.
• Isotopi conferiscono stessa ionizzabilità e volatilità. Per ogni specie, gli isotopi che ne fanno parte sono in rapporto, quindi le intensità dei loro spettri, dei loro picchi sono in rapporto molare tra loro. Si sfrutta questo per marcare i campioni e quantizzare anche molecole totalmente diverse.
• La spettrometria di massa è quantitativa se si fa un rapporto tra isotopi.
• Con le tecniche di marcatura isotopica, la quantificazione è fatta sullo spettro di massa MS.
• Con le tecniche di marcatura isobarica, l'analisi quantitativa è fatta sullo spettro di massa-massa MS/MS, uno spettro di frammentazione di un singolo picco dell'MS.
  Vantaggio: quando si hanno molte cose da confrontare tra loro, si costruiscono tag per ciascuna e si mixano i campioni in modo da analizzarli nello stesso esperimento, standardizzazione del sistema.
• In uno spettro MS, con tag isotopici, si avranno tanti picchi vicini (se risoluzione scarsa non si distinguono) tanti quanti sono i tag usati, spettro molto complicato.
• In uno spettro MS/MS, con tag isobarici (NB.: che hanno peso uguale), si ottiene la sequenza del peptide e tutti i picchi degli isotopi che derivano dal tag (si confrontano in rapporto stechiometrico con le quantità del campione).

Non tutte le tecniche possono poi essere traslate in un laboratorio ospedaliero. In ricerca sicuramente si usano approcci più lunghi rispetto a quelli poi applicabili in clinica. Lezioni dedicate all'approccio da seguire per l'identificazione di nuovi biomarcatori proteici a partire da un campione biologico, un estratto cellulare o una biopsia. SLIDE 66 LEZ 5 GELFI.

Due approcci perché in entrambi ci sono vantaggi e svantaggi. La scelta di uno o dell'altro dipende dalla ricerca che si deve condurre, dal tipo di strumentazione a disposizione.

Approccio bottom-up

• Partendo dal campione (estratto da qualcosa), questo viene tutto digerito con un enzima proteolitico a scelta e, solo i prodotti della digestione sono poi separati ed analizzati.
• La fase separativa dei peptidi (uscita del cromatografo) è direttamente collegata allo spettrometro di massa (uscita del cromatografo collegata alla sorgente dello spettrometro di massa) la cui sorgente processa un campione in fase liquida.
• Si ha un miscuglio di peptidi provenienti da un intero proteoma, spettro ottenuto molto complicato.
• Lo strumento deve essere ad alta risoluzione e deve avere alta processività (deve poter elaborare un numero di spettri nell'unità di tempo molto alto).
• Per trovare modificazioni post-traduzionali è necessario cercarle volta per volta con ricerche mirate.
• Analisi dati: si ha una mixtura di peptidi provenienti da proteine diverse.
  Tandem mass spectrometry.

Approccio top-down

• Estratto proteico separato nelle proteine costituenti e poi ciascuna proteina analizzata ed identificata.
• Le proteine sono analizzate una alla volta, sono prese e deposte su una piastra apposita e analizzate con uno strumento che ha una sorgente di tipo impulsivo che produce ioni solo in seguito ad impulso ("a comando"), sorgente di tipo MALDI che lavora in fase solida (campione cristallizzato su un target).
• Può condurre così un’analisi anche su un centinaio di campioni per volta, ma sempre una proteina alla volta.
• Spettri ottenuti più semplici e campioni analizzabili in qualsiasi momento. Strumento ad alta risoluzione e richiesta processività.