Patologia clinica

Misura dell'ematocrito

La misura dell'ematocrito è di rilevante importanza perché costituisce un valore primario per il calcolo degli indici derivati e viene espresso in valore percentuale o decimale del volume dei GR rispetto al volume totale. I valori di riferimento sono:

• Maschio adulto: 40 - 52% o 0,40 - 0,52
• Femmina adulta: 32 - 47% o 0,32 - 0,47

Vi sono numerosi fattori che possono alterare i fattori di Hct e sono una variazione preanalitica dovuta ad un mantenimento prolungato del laccio emostatico nel corso del prelievo, fattore che produce emoconcentrazione e aumento dei valori di Hct dal 2,5 al 5%. Se il valore dell'Hct scende sotto il livello di riferimento si parla di oligocitemia, caratteristica che rivela la diminuzione della massa eritrocitaria ed un aumento del volume plasmatico. La riduzione della massa eritrocitaria può derivare da crisi emolitica o da emorragia; tali variazioni richiedono una valutazione morfologica.

eritrocitaria edel contenuto di emoglobina nei GR; tipica di questa è la diminuzionedell’ematocrito nelle anemie microcitiche ipocromiche; nei soggetti che vivonoad altitudini elevate si hanno valori maggiori di Hct; nella gravidanza si hadiminuzione dell’Hct; nel caso di emoconcentrazione si ha aumento dell’Hct,l’emoconcentrazione si ha nel caso di disidratazione, disturbi ormonali, ecc.. osi deve ad un aumento del numero di GR, condizione definita poliglobulia, cheentro determinati limiti è fisiologico o può porre il sospetto di patologianeoplastica del midollo osseo; L’Hct e l’Hb possono risultare elevati nel caso diipovolemia dovuta a perdita di liquidi o di plasma, a seguito di occlusioneintestinale o di ustioni estese.

Conteggio dei globuli rossi(RBC)Le tecniche manuali di conteggio dei GR utilizzano apposite pipette di diluizionee le camere di conteggio, e queste mostravano un errore analitico del 15 – 20%e per cui

avevano scarsa precisione ed accuratezza; con i moderni contatori si è ottenuto una diminuzione dell'inesattezza e dell'imprecisione, che si attesta sul 2%; i valori di riferimento della conta dei GR sono:

• maschio adulto 4,3 – 5,9 * 10⁶/µL
• femmina adulta 4,0 – 5,1 * 10⁶/µL
• neonato 3,5 – 5,1 * 10⁶/µL
• 1 – 2 anni 3,6 – 5,2 * 10⁶/µL
• 3 – 7 anni 4,1 – 5,5 * 10⁶/µL
• 8 – 12 anni 4,0 – 5,4 * 10⁶/µL

Vi sono numerosi fattori che possono contribuire a rendere tali valori anomali e sono il vivere ad altitudini elevate, che causa aumento fisiologico del numero di GR, a causa dell'adattamento ad una condizione di ipossia ipobarica, quindi l'aumento del numero di GR può essere collegato al rilievo morfologico di una microcitosi normocromica, nel caso di emoconcentrazione si ha aumento del numero di GR, in relazione alla riduzione di volume plasmatico.

1. Nell'etalassemie si ha aumento del numero di GR, caratterizzato da microcitosi persistente, conosciuta come microcitemia, una diminuzione del numero di GR, collegata a situazioni post emorragiche o ad una crisi emolitica o a riduzione dell'eritropoiesi, una falsa diminuzione del numero dei GR dovuto ad emodiluizione.
2. Gli indici derivati

Gli indici che derivano dal numero di GR, dal valore di Hct e dalla concentrazione di Hb sono di rilevante importanza per valutare le caratteristiche del globulo rosso e sono di utilizzo comune per le anemie e le poliglobulie; i principali indici eritrocitari sono: MCV, MCH e MCHC, a cui si aggiungono nuovi parametri eritrocitari: RDW, HDW e MCHC.

Volume corpuscolare medio (MCV): indica la grandezza media del globulo rosso e si esprime in femtolitri (fL); questo parametro viene calcolato dividendo Hct∗10 [ ]=MCV fL l'ematocrito per il numero dei GR. La formula è la seguente: GRHct => valore percentuale dell'ematocrito10 è un

fattore di correzione per convertire il volume dei GR da dL a L e il numero di GR in milioni Il calcolo di MCV con i contatori elettronici è diretto e viene originato dal passaggio delle singole cellule nella camera di conteggio, mentre l'Hct viene calcolato in base al MCV, tramite la formula: *GRHct=MCV Emoglobina corpuscolare media(MCH): questa costituisce il peso del contenuto emoglobinico per ogni cellula; si calcola con la formula: Hb*10 [ ]=MCH pg GRHb => concentrazione dell'emoglobina, espressa in grammi 10 è il fattore di conversione da dL a L e RBC è il numero di GR espresso in milioni I valori di riferimento sono compresi fra 27 e 33 pg, ma possono aumentare fino a 50 nelle anemie macrocitiche e diminuire fino a 20 pg nelle anemie ipocromiche e microcitiche. Concentrazione emoglobinica corpuscolare media(MCHC): rappresenta la concentrazione media di Hb in un dato volume di GR e si può calcolare da MCH e MCV, o dalla concentrazione di

Hb ed ematocrito. Le formule per calcolarla sono:

MCH = Hb * 100 / MCHC

MCV = Ht / MCHC

MCHC misura la quantità di emoglobina presente nel GR e i valori normali variano da 33 a 36 g/dL; un valore inferiore a 32 g/dL indica ipocromasia delle emazie, ovvero eritrociti più pallidi della norma, condizione tipica delle anemie ipocromiche, mentre un valore circa a 36 g/dL fa sospettare un'ipercromia, mentre un valore superiore a 37 g/dL fa sospettare un errore tecnico, in quanto supera il limite di solubilità dell'emoglobina.

Ampiezza della distribuzione dei GR o Red cell Distribution Width (RDW): questo misura il grado di anisocitosi, ovvero misura la variabilità delle dimensioni dei GR. La formula utilizzata è:

RDW % = DS MCV * 100 / Media MCV

DS => Deviazione Standard

Il range di riferimento è compreso fra 11,5 e 14,5% e la precisione influenza il range di riferimento, in quanto nelle anemie tale valore

tende ad aumentare. Ampiezza della distribuzione della concentrazione di Hb o Haemoglobin Distribution Width (HDW): questo indice di anisocromia ereditaria viene calcolato rapportando il valore della concentrazione emoglobinica media alla distribuzione dei valori.

Conteggio dei globuli bianchi. Tale procedura viene eseguita sia con tecniche manuali che automatiche; sui campioni ematici di norma sono utilizzati contatori automatici, mentre la conta manuale avviene con diluizione del campione e conta con camera a globuli, che viene eseguita nel caso di campioni di liquor, liquido sinoviale o essudati, in quanto sarebbe richiesto un settaggio specifico per il sistema automatico.

I valori di riferimento per i leucociti sono:

• adulto 4.000 – 10.000/ μL
• 6 – 12 anni 4.500 – 13.500/ μL
• 2 – 6 anni 5.000 – 15.000/ μL
• < 2 settimane 5.000 – 21.0000/ μL

Per i diversi leucociti i valori di riferimento sono:

• basofili 0,5 – 1 % o 15

• – 100/ µL
• Eosinofili 1 – 4% o < 450/ µL
• Linfociti 20 – 40 % o 1.000 – 4.000/ µL
• Monociti 2 – 8 % o < 850/ µL
• Neutrofili segmentati 40 – 60 % o 3.000 – 7.000/ µL
• Neutrofili a banda 0 – 3 % o < 350/ µL

Conteggio delle piastrine(PLT)
Con le tecniche manuali e il conteggio nelle camere è un test di difficile standardizzazione, in quanto vi è un ampio range di precisione ed accuratezza, poiché le piastrine presentano dimensione molto ridotta e possono essere difficilmente riconoscibili ed essere confuse con frammenti cellulari. Le PLT tendono ad aggregarsi in ammassi di dimensioni differenti e aderiscono alle pareti delle pipette e della camera; tale problematica in parte è stata risolta con l’utilizzo di materiali monouso in plastica; con il passaggio al sistema di conteggio automatizzato è stato raggiunto un accettabile livello di precisione ed accuratezza.

Anche se questo rimane il test con il maggior coefficiente di variazione (CV) tra i diversi parametri dell'esame emocromocitometrico. I valori di riferimento sono compresi fra i 150.000 e i 400.000/µL ed i fattori che possono influenzare i valori e determinare di conseguenza valori anomali sono: nell'aumento dei valori del conteggio troviamo l'altitudine, le temperature fredde e l'esercizio strenuo, mentre una diminuzione del loro numero si può avere nel periodo premestruale. Infine si valuta il volume medio delle piastrine che corrisponde a 25 µm.

Esame morfologico delle cellule del sangue

L'esame morfologico delle cellule del sangue è fondamentale per una valutazione ematologica ed è un test di semplice esecuzione; questo test viene effettuato su uno striscio di sangue, ottenuto tramite puntura su polpastrello o tramite un campione raccolto in EDTA, con la raccomandazione di agitare accuratamente il campione precedentemente allo striscio.

in modo da assicurare l'uniformità della distribuzione degli elementi. La tecnica dello striscio è critica per ottenere uniforme distribuzione degli elementi della serie bianca, in quanto nel caso di cattiva preparazione questi si raccolgono prevalentemente ai margini dello striscio, cosa che può comportare colorazione di scarsa qualità e errore nelle valutazioni percentuali dei diversi elementi, in quanto i neutrofili e le piastrine si accumulano ai margini dello striscio.

Di rilevante importanza è la rapidità di esecuzione dello striscio, poiché gli elementi contenuti nella goccia di sangue, dopo che questa è stata posta sul vetrino, si potrebbero distribuire in maniera anomala e dar luogo ad impilamento dei GR e ad ammassi piastrinici; di conseguenza è importante anche lo spessore dello striscio, in quanto se questo è troppo sottile, consente una buona colorazione, ma la ricerca degli elementi sarà più lunga.

da eosina, azur II e metanolo, che permette di evidenziare le diverse componenti del sangue, come i globuli rossi, i globuli bianchi e le piastrine. Durante la colorazione, i coloranti si legano a specifiche componenti cellulari, permettendo di distinguere le diverse strutture presenti nel campione. Ad esempio, il blu di metilene si lega alla cromatina dei nuclei cellulari, mentre l'azur II si lega alla cromatina dei cromosomi. L'eosina, invece, si lega alle proteine presenti nel citoplasma. Una volta completata la colorazione, il campione viene osservato al microscopio ottico, permettendo di analizzare le diverse cellule e valutare eventuali alterazioni o anomalie. La colorazione di May Grünwald-Giemsa è ampiamente utilizzata in laboratorio per l'analisi del sangue e di altri campioni biologici, poiché permette una buona visualizzazione delle strutture cellulari e facilita l'identificazione di eventuali alterazioni morfologiche.