Patologia, apoptosi

Apoptosi o suicidio cellulare

L'apoptosi o suicidio cellulare è una morte più delicata della necrosi, in cui si ha la perdita massiva di singole cellule non necessariamente vicine. I neutrofili, cellule del sistema immunitario, mediante eterolisi liberano gli enzimi litici per eliminare l'agente patogeno, dopodiché i neutrofili vanno eliminati in modo che non intacchino le cellule sane. I corpi apoptotici si staccano continuando a diminuire e vengono fagocitati da cellule vicine o macrofagi, con capacità fagocitarie.

Necrosi e apoptosi

Nella necrosi le cellule si disgregano in parti più piccole in seguito a disgregazione della membrana cellulare. L'apoptosi è un processo finemente controllato dalle cellule che richiede l'espressione di geni specifici e la produzione di proteine specifiche:

• Taglio o clivaggio di proteine caspasi che normalmente non sono attive.
• Formazione di legami crociati tra le proteine.
• Rottura del DNA a livello internucleosomiale ad opera di endonucleasi.
• Ricognizione fagocitaria grazie alla presenza della fosfatidilserina che normalmente non è esposta all'esterno della cellula, ma durante l'apoptosi funge da riconoscimento.

Base azotata + pentoso = nucleoside. Base azotata + pentoso + fosfato = nucleotide. I nucleosomi sono le unità ripetitive della cromatina, ciascuna contenente 200 doppiette di DNA e due molecole di ciascun istone H2A, H2B, H3, H4. La cromatina si avvolge intorno agli istoni. Il processo di frammentazione del DNA nella necrosi e nell'apoptosi è diverso. Nell'apoptosi avviene a opera di endonucleasi specifiche a livello dei nucleosomi, il taglio può avvenire ogni 1, 2, 4 nucleosomi.

Elettroforesi

L'elettroforesi è una tecnica analitica e separativa basata sul movimento di particelle elettricamente cariche immerse in un fluido per effetto di un campo elettrico applicato mediante una coppia di elettrodi al fluido stesso. Le particelle si spostano verso il catodo se hanno carica positiva e verso l'anodo se hanno carica negativa. L'elettroforesi su gel di agarosio è una tecnica classicamente utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici. Questa tecnica sfrutta le cariche presenti nelle molecole di DNA o RNA (caricate negativamente) per farle migrare, in un campo elettrico, attraverso un gel di agarosio. Il gel funge da setaccio, essendo costituito da una rete di pori, i quali consentono di separare le molecole in base alla loro grandezza: quelle più piccole attraversano più velocemente i pori rispetto a quelle più grandi, quindi si avrà una separazione in funzione della velocità. L'agarosio è un polisaccaride lineare e neutro formato da unità di D-galattosio e di L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici.

I campioni da analizzare vanno depositati, con una micropipetta, in apposite fenditure verticali, dette "pozzetti", praticate nel gel a poca distanza dal margine dalla parte del polo negativo. Essendo il DNA un polianione, i frammenti migreranno in avanti verso il polo positivo. All'atto del caricamento, al campione viene solitamente aggiunta una "soluzione di caricamento", colorata generalmente con blu di bromofenolo e xilene cianolo, contenente glicerolo per agevolare la precipitazione del campione sul fondo del pozzetto.

L'elettroforesi su gel è una tecnica ideale per determinare le dimensioni dei frammenti di DNA digeriti con enzimi di restrizione. Per questo scopo è necessario costruire una curva di taratura in grado di fornire un valore approssimativo sulle reali dimensioni delle molecole di DNA. Per la taratura bisogna far migrare nel gel un marcatore contenente frammenti di DNA di dimensioni già note. Da questo si vede che esiste una relazione di linearità fra il logaritmo delle dimensioni del frammento e la distanza percorsa dal gel. Dalla curva di taratura è perciò possibile stabilire le dimensioni dei frammenti di DNA.

Per consentire la visualizzazione degli acidi nucleici migrati si possono utilizzare diversi tipi di coloranti; quello più usato in assoluto è l'etidio bromuro. Questa molecola planare si inserisce (intercala) tra le basi dell'acido nucleico a doppio filamento ed emette luce fluorescente quando irradiata con luce ultravioletta (300 nm). L'etidio bromuro può essere aggiunto direttamente al gel (la velocità di migrazione si riduce del 10-15%), al campione, o, alternativamente, dopo l'elettroforesi. Altri tipi di colorazioni utilizzano: sali di argento, blu cresile brillante, blu di metilene.

Quindi, questa tecnica consente di separare da un supporto solido (gel di agarosio) con un polo positivo e uno negativo, in cui il DNA che ha una carica negativa migrerà verso il polo positivo, ed in base al peso e alle dimensioni dei frammenti correrà più velocemente e si fermerà in tempi diversi. Si utilizza bromuro di etidio il quale, sottoposto a raggi UV, dà una colorazione violacea del pattern di DNA. Con questa tecnica si distingue l'apoptosi dalla necrosi, in cui si ottiene invece un caratteristico pattern a forma di stella cometa.

Studi su Caenorhabditis Elegans

Il batterio Caenorhabditis elegans ha 1090 cellule somatiche, di cui 131 vanno in apoptosi. Studi condotti su questo batterio permisero di suddividere il processo apoptotico in tre fasi:

• Induzione della morte cellulare
• Fase esecutrice, in cui vengono attivati i geni specifici e prodotte le proteine specifiche necessarie per attivare il processo apoptotico
• Riconoscimento e fagocitosi

Per avere valore scientifico, gli studi effettuati sono stati confermati con studi applicati ad organismi superiori. I geni in grado di dare risposte stereotipate a stimoli diversi sono così raggruppati:

• Recettore di membrana (Fas, TFN, TRIAL)
• Adattatori (FAAD, APAF1, ced-1)
• Effettori (caspasi, ced-3, endonucleasi)
• Modulatori (anti-apoptotici come Bcl2 e ced-9, pro-apoptotici come il Bax)
• Inibitori (Crma, survivina)
• Induttori (p53, C-myc)
• Fagocitori

Vie del processo apoptotico

Il processo inizia in seguito al legame recettore ligando o alla liberazione di segnali che determinano la fuoriuscita del citocromo C dal mitocondrio. Le due principali vie del processo apoptotico sono:

• La via estrinseca mediata dai recettori di morte. Il legame (stimolo apoptotico) del recettore Fas (localizzato nella superficie delle cellule)