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in seguito a stimoli anti-apoptotici: ad esempio la proteina FLIP (che si può trovare nella versione L o S)

sequestra la pro-caspasi 8 che non può quindi formare omodimeri ed attivarsi, disaccoppiando la

stimolazione con l'effetto; alti livelli di FLIP infatti determinano un'assenza di stimolazione pro-

apoptotica anche in presenza di segnalazione.

Questo meccanismo avviene nelle cellule B quando durante la maturazione di affinità del recettore:

quando riescono ad ingaggiare l'antigene vengono trascritti elevati livelli di FLIP in modo da bloccare il

meccanismo, che in realtà è già innescato.

Anche TNF è un monomero che induce la trimerizzazione del recettore: il TNFR1 non può legare

direttamente FAD ma richiede la proteina adattatrice TRADD che attiva la pro-caspasi 8; anche in questa

vie è possibile disaccoppiare il meccanismo accoppiando FADD al fattore anti-apoptotico TRAF che

attiva la cascata chinasica che porta alla segnalazione di NF-KB.

Mutazioni e alterazioni di Fas nei tumori

Nei tumori Fas può essere mutato in due modalità:

1. mutazione a livello del Death Domain che non riesce più a legare le proteine a valle → mutazioni

eterozigoti, è sufficiente una sola mutazione perché sia efficace

2. mutazioni del promotore → ne riducono l'espressione, sono efficaci in omozigosi.

Le alterazioni della via Fas/FADD che determinano la formazione di tumore sono:

1. riduzione dell'espressione della caspasi 8 → aumenta proporzionalmente FLIP, fattore di

sopravvivenza. È determinata da ipermetilazione

2. upregolazione di FLIP → non viene upregolata la sua espressione ma è in genere una

upregolazione funzionale dovuta ad una deregolazione delle vie a monte: essendo Flip un

oncogène viene controllato nella cellula mediante ubiquitinazione, uno degli elementi di controllo

a monte dell'ubiquitinazione è Akt la cui via può però essere mutata da molti fattori! Se viene

bloccata l'ubiquitina ligasi che media la degradazione di Flip, questo si accumula nella cellula e

compete con l'attivazione delle caspasi.

Quando un tumore è riconosciuto poiché esprime un antigene presentato mediante MHC I viene attaccato

da un linfocita T citotossico (mediante granzima o FasLigando); nel momento in cui si ha un tumore che

progredisce viene perso il recettore Fas per deregolazione della via, quindi la cellula tumorale viene

riconosciuta ma non può essere distrutta dal linfocita T mediante questa via.

Poiché per il linfocita T ha anche la via del granzima, la cellula tumorale attiva anche la via del

FasLigando in modo da uccidere il linfocita stesso con lo stesso meccanismo che questa avrebbe

utilizzato. Questo è uno dei meccanismi che utilizzano i siti immunoprivilegiati per evadere dall'attacco

del SI.

Regolatori comuni di via intrinseca ed estrinseca

I tumori possono presentare incremento dell’espressione di IAPs (Inhibitor of Apoptosis Protein) che

legano e antagonizzano l’attivita delle caspasi.

̀

La via estrinseca inoltre puo attivare la via intrinseca: la caspasi 8 attivata puo tagliare e attivare Bid

̀ ̀

(tBid) sequestra Bcl-2 e Bcl-XL permettendo l’inserzione di Bax nella membrana mitocondriale.

A loro volta le proteine anti-apototiche della famiglia Bcl-2 possono sequestrare Bid impedendone

l’attivazione di Bax. 7 Maggio

Alterazioni e sistemi di riparazione del DNA

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Quando all'interno di una cellula vengono alterati meccanismi di riparo del DNA, essa tende ad assumere

una quantità maggiore di mutazioni i cui effetti possono essere diversi; persistono comunque dei sistemi

di controllo che ostacolano l'instabilità genetica dovuta a queste mutazioni, la cellula può ancora essere

controllata ed andare in apoptosi.

La combinazione però tra i sistemi di riparazione ed una perdita di geni anti-apoptotici o l'acquisto di

geni pro-apoptotici è fondamentale per il processo di tumorigenesi.

Le alterazioni a carico del DNA possono essere di varia provenienza:

- danni endogeni → errori della polimerasi, mutazioni acquisite, radicali dell'ossigeno

- danni esogeni → agenti chimici, radiazioni, infezioni virali

Il DNA danneggiato può essere riparato mediante blocco del ciclo cellulare, oppure se non può essere

riparato (perché presenta troppe mutazioni o mutazioni irreparabili) le alternative possibili sono due:

- fissazione delle mutazioni → trasformazione cellulare

- apoptosi → ultima via di salvataggio dalla trasformazione.

I meccanismi di riparo del DNA possono essere:

riparazione diretta della mutazione → possibilità di non dover intervenire con un taglio

• dell'elica;

- fotoriattivazione → sfrutta le attività enzimatiche della fotoliasi che utilizza a livello

energetico la luce solare per rompere i dimeri di timina

- rimozione di gruppi metilici → sfrutta gli enzimi MGMT (O-6-metylguanine-DNA-

metyltransferase) o ALKBH (alkylation repair homologue )

sistemi di riparazione complessi

• - riparazione del danno sulla singola elica → NER, BER, MMR

- riparazione del danno sulla doppia elica → NHEJ, ricombinazione omologa

Danni sulla singola elica

NER (Nucleotide Excision Repair)

Ripara i danni che determinano un'ostruzione dell'elica al passaggio degli enzimi (RNA/DNA polimerasi)

e rappresenta il principale meccanismo deputato alla rimozione dei fotoprodotti nelle cellule umane.

Questo sistema di riparazione ripristina la corretta sequenza del DNA tramite excisione del tratto

contenente il danno, risintesi del tratto mancante e saldatura del filamento di nuova sintesi alla molecola

di DNA.

Il sistema NER sfrutta una serie di attività enzimatiche, in particolare i geni XP la cui mutazione nello

xeroderma pigmentosum causa una serie di malattie con effetti ampi; questa malattia determina anche un

incremento alla sensibilità ai raggi del sole che quindi determinano l'acquisizione di tumori di tipo

cutaneo mentre non si ha un incremento dei tumori interni all'organismo poiché i raggi UV vengono

tendenzialmente bloccati dalla cute.

Questa malattia ha una trasmissione autosomica recessiva.

BER (Base Excision Repair)

Ha come bersaglio piccole modificazioni chimiche delle basi come 8-Oxoguanina o l'inserzione di basi

anomale come uracile e ipoxantina, o il legame di un residuo alchilico. Tali modificazioni talvolta

impediscono la replicazione, ma piu spesso causano “miscoding”.

̀

Il sistema BER ripara anche i “nick”, ovvero le rotture su singola elica.

Le cause principali di queste alterazioni sono gli agenti alchilanti e i radicali liberi dell'ossigeno.

BER excide la singola base dall’elica del DNA che viene successivamente riparata.

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Il primo enzima utilizzato e una DNA glicosilasi che excide la base modificata per creare un sito

̀

apurinico-apirimidinico (AP). La AP endonucleasi poi riconosce il sito AP e effettua un nick creando

un’estremita 3'OH libera.

̀

La DNA polimerasi β estende il nick mediante la sua attivita esonucleasica per rimpiazzare il nucleotide

̀

AP.

La ligasi LigIII in un complesso con la proteina scaffold XRCC1 chiude il nick; questa proteina scaffold

può essere mutata e dare origine al carcinoma del polmone; le altre proteine di questo sistema di

riparazione invece se mutate non sono compatibili con la vita.

MMR (Mismatch Repair)

È il sistema che supporta la precisione della DNA polimerasi soprattutto in presenza di ripetizioni in

tandem: rimuove i nucleotidi non appaiati inseriti per errore della DNA polimerasi (es. A-G; T-C) e

piccole inserzioni o delezioni dovute e scivolamento della polimerasi.

Quando questo sistema salta, nonostante l'attività proofreading della polimerasi si ha un incremento di

mutazioni fino a 100 volte.

In caso di mutazione di questo sistema è possibile valutare la lunghezza dei microsatelliti a livello del

tumore.

Tra i tumori ereditari che vengono acquisiti per la perdita del sistema MMR c'è HNPCC (Hereditary

Non Polyposis Colorectal Cancer), un tumore causato dalla mutazione nella linea germinale di due geni

MMR: - hMSH2 nel 60% dei casi → omologo di MutS in E.coli

- hMLH1 nel 30% dei casi → omologo di MutL in E.coli

I bambini che acquisiscono queste mutazioni tendono a sviluppare il tumore nel tempo (sindrome

autosomica dominante); la mutazione è anche associata ad altri tumori: endometrio, ovaio, stomaco,

pelle.. Tutti questi tessuti sono tessuti labili che proliferano molto velocemente: una proliferazione veloce

in assenza di sistemi di riparazione permette una fissazione maggiore di mutazioni.

MSH2 altera la sensibilità all'apoptosi in quanto determina una instabilità dei microsatelliti che causa

mutazioni frameshift a livello di Bax (la cui ORF presenta un microsatellilte), si ha quindi un incremento

della resistenza all'apoptosi.

La presenza di mutazioni di Bax in pazienti con carcinoma del colon è segno di cattiva prognosi.

Danno sulla doppia elica

Se uno dei due cromosomi viene danneggiato sulla doppia elica ed il danno avviene dopo la fase S, la

cosa più probabile e veloce è che avvenga la riparazione del danno mediante utilizzo del cromatide

fratello che, essendo unito dal centromero, è più vicino rispetto al cromosoma omologo: quindi la

funzione enzimatica viene esplicata all'interno di una stessa molecola ed è infatti più probabile rispetto ad

un'azione intermolecolare.

Nel caso in cui non ci siano a disposizione i cromatidi fratelli, il DNA cromosomale inizia ad espandersi

per favorire l'incontro con l'omologo: se questo viene identificato si ha una riparazione che prevede il

crossing over fra due cromosomi differenti. Questa seconda riparazione è molto meno probabile e quindi

meno veloce.

Se invece non si riesce a ritrovare il cromosoma omologo, il DNA va a localizzarsi nella periferia

nucleare e si possono attivare i sistemi di riparazione alternativa che legano le estremità non omologhe.

Se il danno avviene in fase G1, quando non è ancora disponibile il cromatide fratello interverrà il sistema

di riparazione non omologa (NHEI) che non è preciso poiché non ha a disposizione DNA stampo ma lega

due estremità rotte a caso non necessariamente appartenenti allo stesso cromosoma e spesso introduce

errori nel punto di giuntura. 30

Riparazione omologa (HR o HEJ)

È un sistema di riparazione che interviene quando si ha la possibilità di utilizzare il cromatide

fratello/cromosoma omologo. Le proteine sensore del checkpoint ATM/ATR attivano i geni BRCA1 e

BRCA2, implicati nel trasporto nel nucleo di RAD51, una ATPasi DNA-dipendente coinvolta nella

ricerca e nell'appaiamento dello strand omologo sul cromatide fratello. RAD51 lega altre proteine a

formare il complesso MRN che catalizza la sintesi della doppia elica danneggiata.

BRCA1 e BRCA2, due geni cardine nello sviluppo del carcinoma mammario ereditario (nel 95% dei

casi) e la presenza di questi due geni mutati provoca lo sviluppo del carcinoma nel 30-40% dei casi

(penetranza incompleta)

Mutazioni di ATM causa ataxia-telangiectasia che causa leucemia, linfoma, sensibilità alle radiazioni,

instabilità del genoma.

NHEJ (Non Homologous End Joining)

Questo sistema non è affidabile poiché viene attivato quando non è presente DNA stampo ma si è evoluto

come sistema di riparazione in extremis poiché la cellula altrimenti morirebbe.

Le due estremità della doppia elica vengono legate da KU70 e KU80, subentra poi la proteina DNA PK

che mantiene unite le due estremità fino all'intervento della ligasi4 e della proteina scaffold XRCC4:

mutazioni in questi due geni danno una forte predisposizione a sviluppare leucemie.

I danni al DNA sulla doppia elica sono causati principalmente da agenti ionizzanti ad esempio radiazioni

(raggiX, raggiγ).

L'assenza di Ku70 e Ku80 causa la SCID (Severe Combined Immunodeficiency) poiché questo sistema

funziona a livello della formazione dei recettori per le cellule B e T (tra i sistemi che incrementano la

variabilità nei punti di ricombinazione somatica).

Alterazioni epigenetiche nel cancro

L'entità della trascrizione del DNA non è interamente deputata alla sua sequenza ma dipende anche dalla

disponibilità del DNA alla trascrizione che può essere regolata mediante modificazioni di tipo

epigenetico (stabili o variabili nel tempo).

Acetilazione

La principale modificazione dei cori istonici è l'acetilazione su residui di lisina e arginina, i quali

essendo carichi positivamente e quindi in grado di neutralizzare le cariche negative del DNA in modo da

permettere un compattamento maggiore e quindi la formazione di eterocomatina indisponibile:

l'acetilazione di questi residui tampona le cariche positive ed impedisce il compattamento del DNA

generando una forma più aperta ed accessibile alla trascrizione.

L'acetilazione avviene ad opera delle DNA-acetil transferasi che sono quindi attivatori trascrizionali e

vengono richiamati a seguito di stimoli mitogeni; al contrario le istone-deacetilasi hanno l'effetto

opposto.

Le istone acetilasi e le acetil transferasi sono spessissimo alterate nei tumori proprio perchè possono

promuovere o meno la trascrizione del DNA.

La cromatina può anche avere alterazioni stabili ad esempio modificazioni istoniche stabilmente

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associate con siti attivi/inattivi a livello trascrizionale e che vengono tramandate durante la duplicazione

come fossero delle mutazioni; questo è quello che permette la memoria della cromatina.

Nei tumori queste alterazioni stabili possono essere deregolate: ad esempio la lisina K4 a livello

dell'istone H3 è spesso acetilata nel cancro per una over produzione di metil-transferasi; la presenza di

questa lisina determina cromatina attiva e quindi deregola la quantità di cromatina che viene trascritta e

diventa rilevante se ad essere trascritto è un oncogene. Lo stesso può avvenire nel caso di una

soppressione di oncosoppressori.

L'istone H3 inoltre ha due forme: una più frequente distribuita uniformemente sul cromosoma ed una

detta CENPA che si trova a livello del centromero ed ha quindi una funzione essenziale durante la

formazione del fuso mitotico; una overproduzione di questa forma che ne determina la distribuzione

regolare a livello del cromosoma e porta ad aneuploidie.

Metilazione

La metilazione in posizione 5 delle citosine porta alla formazione di 5-metil-citosina che non causa

modificazioni a livello replicativo ma ha un effetto sulla trascrizione: le citosine si trovano soprattutto

nelle CpG island situate in genere a livello di promotori di geni. La presenza dei gruppi metilici a livello

delle CpG determina silenziamento genico.

Le funzioni del silenziamento genico mediante metilazione sono:

1. ristabilire la metilazione globale in seguito all'impianto dell'embrione

2. ristabilire il pattern di metilazione ad ogni divisione mitotica

3. determinare l'imprinting genomico

4. controllare la trascrizione genica nel processo differenziativo di una cellula: limitano la

trascrizione riducendola a quella dei geni tessuto specifici (limitazione della potenza).

Le modalità con cui la metilazione reprime la trascrizione sono attraverso la modulazione di

reclutamento delle istone-deacetilasi (HDAC1 e HDAC2) e delle proteine che legano il DNA metilato.

Tra le proteine specifiche che legano la citosina metilata vi sono:

- MBD 1,2,3, e 4

- MeCP2

Queste proteine hanno a loro volta la capacità di reclutare HDAC.

La metilazione è uno degli elementi con cui i tumori deregolano la trascrizione:

1. tutti i tumori tendono ad avere fin dall'inizio un ipometilazione globale

2. la ipometilazione è estremamente precoce come elemento di alterazione

L'effetto della metilazione è stato verificato utilizzando un allele ipomorfico (perdita del 10% del

funzionamento) della DNA-metiltransferasi 1 in topi che erano infatti predisposti a sviluppare una serie

di tumori. Gli effetti della ipo-metilazione sono infatti:

attivazione di oncogèni e antigeni associati a tumori

• - R-RAS → adenocarcinoma gastrico

- CyCD2 → carcinoma del pancreas

- MAGE1 → melanoma

motilità dei trasposoni → l'ipo-metilazione può essere causa del mancato silenziamento

• trascrizionale degli elementi trasponibili (che devono infatti essere trascritti prima di essere

trasposti) ed incrementarne la motilità. Essi possono: interrompere la trascrizione, alterare la

trascrizione ponendosi a monte di un gene, fungere da elementi di omologia per i riarrangiamenti

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cromosomici incrementando la quantità di alterazioni, dare luogo ad instabilità epigenetica.

instabilità cromosomica → il DNA ipometilato è un DNA aperto che inibisce la condensazione

• cromosomica durante la mitosi: le regioni non condensate possono aderire ed effettuare crossing

over con conseguente non disgiunzione o rotture cromosomiche.

L'ipometilazione delle regioni centromeriche (in genere fortemente metilate) è presente in molti

tumori e causa alterazioni quali: rottura, formazione di isocromosomi..

L'ipermetilazione nel cancro ha invece l'effetto contrario: è spesso dovuta ad overespressione delle metil-

DNA transferasi ma anche delle proteine che legano il DNA (e richiamano le HDAC) ed è comunque

associata alla comparsa di tumori multipli poiché causa uno spegnimento degli oncosoppressori.

L'ipermetilazione è visualizzabile come dei punti hot spot nelle cellule (più scuri) dovuti appunto ad una

maggiore condensazione del DNA.

Rb è inattivato per metilazione del promotore nel 9% dei casi di retinoblastoma, vi è quindi una

rivisitazione della “teoria dei due colpi” di Knudson.

Altri geni che possono essere ipermetilati sono:

- p16 → è il più frequente

- p14 e p15

- MGMD, hMLH1

- APC

Anche PTEN e PP2A possono essere spenti per ipermetilazione!

Loss of imprinting

È un evento che quando comporta una regolazione di geni coinvolti nella regolazione della proliferazione

può avere un effetto che può favorire la formazione di tumori (es. tumore di Wilms).

Uno dei locus più studiati per la perdita di imprinting è quello di IGF-2 (Insuline Growth Factor) un

fattore mitogeno la cui trascrizione avviene solo a livello dell'allele paterno: la regione regolativa che

regola la trascrizione sia di IGF-2 controlla anche la trascrizione di un gene H19 che codifica per un

RNA che silenzia la trascrizione di IGF-2. La regione promotrice della trascrizione trascrive

preferenzialmente H19 e quindi prevale il silenziamento di IGF-2; a livello dell'allele paterno però si ha

un'ipermetilazione della regione che regola la trascrizione di H19 e che determina la trascrizione anche di

IGF-2.

Nel tumore di Wilms per ipermetilazione della regione di regolazione della trascrizione di H19 questo

non viene più trascritto quindi IGF-2 viene trascritto su entrambi gli alleli che causa una iperproduzione

di un oncogene che dà un vantaggio proliferativo alle cellule. 8 Maggio

Il lncRNA trascritto da H19 va a silenziare una serie di geni tra cui IGF-2, inoltre induce la transizione

epiteliale mesenchimale tipica delle cellule tumorali: l'acquisizione di tutti quei marcatori che permettono

di effettuare il passaggio da una cellula ferma a livello del tumore primario ad una cellula che può

invadere il tessuto circostante ed effettuare metastatizzazione.

Quando viene iperespresso H19 non ha solo la funzione di spegnere IGF-2 ed agire da oncosoppressore

ma è anche un oncogene perché è associato all'insorgenza di vari tumori tra cui quello della vescica.

Un altro effetto deriva dall'attività di CTCF in relazione alla diversa metilazione della regione a monte di

H19: - cromosoma materno → la regione non è metilata, CTCF vi si lega ed impedisce l'azione degli

enhancer che quindi limitano la trascrizione a H19

- cromosoma paterno → la regione è metilata, CTCF non si lega e gli enhancer possono indurre la

trascrizione di IGF-2.

La ipermetilazione quindi determina la perdita di imprinting di un oncogène che se espresso in quantità

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doppie è associato alla sindrome di Beckwith-Wiedmann che dà luogo al tumore di Wilms nel 50% dei

casi.

La metilazione può indurre mutazioni

La presenza di citosine metilate è un elemento che incrementa la transizione tra C e T mediante

deaminazione: questa mutazione è difficilmente riconoscibile e riparabile, quindi le isole CpG metilate

sono spesso soggette a tali mutazioni. Questo avviene spesso in mutazioni di p53.

Alterazioni epigenetiche all'origine di tumori?

Tutti i tumori presentano una ipometilazione globale della massa tumorale: ciò suggerisce che

l'ipometilazione possa precedere i successivi cambiamenti genetici.

Il loss of imprinting di IGF-2 infatti non caratterizza solo i tumori ma anche il tessuto sano di pazienti

affetti da adenocarcinoma del colon-rettale; ciò indica che sia un evento predisponente, precedente al

tumore.

Inoltre l'induzione di loss-of-imprinting di IGF-2 in topi si associa ad una incrementata suscettibilità a

sviluppare adenocarcinoma colon-rettale e ad anomalie nel differenziamento della mucosa intestinale.

Infine il 10% degli individui sani presentano loss-of-imprinting di IGF-2 nelle cellule del sangue

associato a rischio di adenocarcinoma del colon 5 volte superiore alla media.

Ricapitolando, le alterazioni epigenetiche..

1. possono essere un surrogato delle mutazioni genetiche

2. sono ereditabili dalle cellule figlie come le mutazioni

3. hanno un effetto pleiotropico e quindi possono provocare molti cambiamenti senza richiedere

l'acquisizione di molte mutazioni.

Cause di variazione epigenetica

Le cause che possono portare ad una variazione epigenetica sono:

- deregolazione dei livelli di attività di proteine che regolano la trascrizione del DNA a livello

epigenetico (DNA-metil binding protein, metil transferasi..)

- proteine associate al tumore che alterano la regolazione epigenetica

- effetti ambientali che determinano ipometilazione:

- età ed effetti dell'ambiente

- nutrizione

PML/RARα altera la regolazione epigenetica

La traslocazione t(15;17)(q22;q21) determina la formazione della proteina di fusione PML/RARα, che

alterando la regolazione epigenetica porta allo sviluppo della leucemia acuta promielocitica.

RARα è un recettore cellulare che lega l'eterodimero composto dall'elemento responsivo per l'acido

retinoico (RARE) e dal recettore per il retinoide RXR e determina la trascrizione dei geni per il

differenziamento sotto stimolazione dell'acido retinoico.

Quando RARα forma la proteina di fusione con PML, non lega più RXR ma funziona come dimero

poiché PML presenta regioni di omodimerizzazione ed inoltre lega una serie aggiuntiva di siti; quando si

lega alla regione responsiva RARE l'omodimero PML/RARα richiama oltre ad HDAC anche le metil-

transferasi DNMT1 e DNMT3 (de novo), portando alla formazione di un complesso cromatinico chiuso:

anche a seguito di una stimolazione con acido retinoico non viene attivata la trascrizione di geni specifici

e quindi non si ha un differenziamento dei progenitori mieloidi.

Per indurre differenziamento è necessario fornire quantità farmacologiche di acido retinoico in modo da

stimolare il richiamo delle istone acetil transferasi in modo da riaprire il sito e renderlo disponibile alla

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trascrizione.

Cause ambientali nelle variazioni di metilazione

I fattori ambientali che intervengono sono età, nutrizione.. e determinano in genere una ipometilazione.

La differente metilazione è riscontrabile analizzando gemelli monozigoti: in relazione all'influenza

dell'ambiente si ha una differente metilazione del DNA e quindi acetilazione degli istoni.

La nutrizione influisce mediante il metabolismo della metionina, che fornisce i gruppi metilici, e quindi

mediante le vitamine B6, B12, metionina, colina e folato. Diete ricche di questi nutrienti offrono un

livello di protezione rispetto all'ipometilazione associata all'invecchiamento.

Ad esempio nei topi con l'invecchiamento si osserva una ipermetilazione del promotore di p16 nel colon,

associata ai folati assunti con la dieta.

Alcuni farmaci influiscono sullo stato di deregolazione epigenetica nel cancro:

- inibitori delle HDAC → riducono lo stato di deacetilazione

- acido idrossamminico

- acido carbossilico

- benzamide

- agenti demetilanti

- 5-azacitidina → per il trattamento di sindromi mielodisplasiche

- 5-aza-2-deossicitidina.

Instabilità genetica: i telomeri

La cromatina dei telomeri ha una struttura ad anello e si trova ancorata tramite una componente proteica

alla matrice nucleare: il DNA presenta una regione 3' terminale che si inserisce nella doppia elica a

formare un D-loop ed un T-loop.

La componente proteica è costituita da una serie di proteine che formano il complesso Shelterin che si

ripete in modo costante sull'estremità telomerica. La protezione data dal complesso Shelterin è efficace

nel proteggere il DNA dal danno genotossico; le proteine che costituiscono il complesso sono:

TRF2 → regola l'allungamento dei telomeri e li protegge dal danno genotossico; una sua

• overespressione inibisce l'allungamento dei telomeri

POT → è una ss telomeric DNA binding protein ed inibisce il danno su ssDNA.

La telomerasi è l'enzima che si occupa di allungare le ripetizioni alle estremità ad ogni replicazione; la

componente catalitica è costituita da:

TERT → è la trascrittasi inversa, utilizza come stampo l'RNA incluso nell'enzima (TERC)

• TERC → è componente RNA della telomerasi che funge da stampo.

Nelle cellule somatiche l'attività telomerasica è nulla così come nelle colture primarie, infatti nel corso

degli anni i telomeri si accorciano e la cellula va in senescenza e si blocca (indice di Hayflick).

Nelle cellule staminali (e nelle colture immortalizzate) invece la telomerasi è attiva quindi la lunghezza

telomerica rimane stabile.

Nei tumori l'attività telomerasica è attiva nell'85% dei casi quindi la lunghezza dei telomeri è per lo più

stabile: questo permette al tumore di crescere in maniera aberrante.

Telomeri disfunzionali

Normalmente durante l'invecchiamento si ha un progressivo accorciamento dei telomeri. Una volta che

essi sono giunti al livello massimo tollerabile vengono attivate due possibili vie:

p16/INK4A → aumenta con l'invecchiamento, blocca l'attività di CDK4 e CDK6 impedendogli di

• fosforilare Rb che rimane quindi attaccato ad EF2 impedendogli di trascrivere i geni per l'ingresso

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in fase S e determinando la permanenza in fase G0

ATM/ATR → viene attivata in risposta al danno genotossico; ATM/ATR fosforilano Chk1 e Chk2

• che a loro volta fosforilano p53 che quindi attiva p21 oppure induce apoptosi.

In presenza di perturbazioni del complesso Shelterin sono possibili due casi:

- perdita TRF2 → danno sulla doppia elica, attivazione di ATM

- perdita di POT1 → danno sulla singola elica, attivazione di ATR

L'effetto finale è l'induzione di senescenza o apoptosi.

Effetto oncogenico della telomerasi

Il recupero dell'attività telomerasica è essenziale perchè la cellula possa essere immortalizzata ed avere

una crescita continua.

Una cellula che muta deve riacquisire l'espressione della telomerasi per continuare a proliferare:

nell'ambito della vita ogni cellula arriva ad un punto massimo di accorciamento dei telomeri oltre al

quale entra in senescenza. Le cellule tumorali possono avere deregolato l'apparato che permette il blocco

del ciclo cellulare, il potenziale replicativo della cellula può essere ulteriormente esteso perchè p53 non si

attiva, non attiva la p21 quindi l'erosione può progredire: i cromosomi erosi causano instabilità

cromosomale.

L'instabilità cromosomale è determinata dal fatto che i cromosomi erosi possono legarsi fra di loro per

l'attivazione di NHEJ e durante l'anafase si può avere la formazione di un ponte che causa la rottura sulla

doppia elica e quindi la presenza di estremità libere sulla doppia elica che vengono sentite come danno e

si ha l'attivazione di cicli rottura-fusione.

Le cellule acquisiscono un livello di aneuploidia elevato con perdita e acquisizione di materiale genetico.

Oppure può succedere che dopo la formazione del ponte in anafase si abbia un'inibizione della citocinesi

quindi le cellule non si dividono e si può avere come effetto la tetradiploizzazione o una aneuploidia.

In entrambi i casi si arriva ad una instabilità cromosomale elevata si ha una morte cellulare ampia che

porta a crisi.

Una piccola % di cellule però riesce a superare la crisi e ad acquisire un programma di mantenimento dei

telomeri; la riacquisizione di telomerasi può anche avvenire prima se ad esempio il tumore si sviluppa da

cellule staminali.

Effetto oncosoppressivo

La perdita dell'integrità dei telomeri può facilitare l'acquisizione di instabilità genomica.

Una situazione in cui i cicli di rottura-fusione determinano la formazione di nuove alterazioni ed

aberrazioni cromosomali fa sì che l'instabilità genomica possa determinare un incremento della malignità.

In questi casi infatti le cellule hanno un'elevata instabilità genetica che possono fargli acquisire mutazioni

che possono fargli fare il salto e gli permettono di diventare più aggressive.

* in questo momento di crisi la telomerasi funge da oncosoppressore poiché la sua mancanza determina

instabilità genetica.

Lezione dai modelli murini

In topi TERC-/- (senza attività telomerasica) è stato dimostrato che la telomerasi può avere un ruolo di

oncosoppressore: essi infatti sviluppano una serie di tumori con il progredire delle generazioni.

Se inoltre vi sono presenti anche mutazioni in p53 la cellula riesce ad evadere la senescenza e l'apoptosi

quindi si ha l'insorgenza anticipata di neoplasie. La mancanza di telomeri funzionali quindi puo essere

̀

utile nella progressione neoplastica di tumori che abbiano perso p53 e che abbiano un ridotto tasso di

mutazioni, per cui abbiano bisogno di acquisire instabilita genomica per la progressione maligna.

̀

Cause di deregolazione della lunghezza dei telomeri

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1. fattori di crescita e ormoni → ad esempio Akt è responsabile della fosforilazione della

telomerasi, un evento necessario per indurne la traslocazione nel nucleo dove esercita la sua

funzione. Akt è una via spesso deregolata nei tumori

2. c-Myc → attiva la trascrizione della telomerasi

3. p53 inibisce la trascrizione della telomerasi per ingombro sterico

4. ROS accelerano l'accorciamento dei telomeri

5. sindromi determinate da mutazioni di geni coinvolti nella riparazione al danno al DNA (es.

ATM) sono associate all'accorciamento dei telomeri

6. perturbazioni dei componenti Shelterin (es. TRF2 induce accorciamento dei telomeri, la sua

assenza determina l'attivazione al danno genotossico, un suo eccesso determina accorciamento dei

telomeri).

Allungamento alternativo dei telomeri (ALT)

Il 15% dei tumori che non riacquista l'attività telomerasica riesce comunque a mantenere la lunghezza dei

telomeri utilizzando il sistema ALT. Questo sistema si ritrova spesso in tumori aggressivi e quindi di

origine mesenchimale (sarcomi e glioblastoma multiforme) ed è associato a prognosi infausta.

Il sistema ALT determina caratteristiche tipiche dei telomeri:

- i telomeri presentano lunghezze estremamente variabili

- variazioni repentine nella lunghezza dei telomeri

- elevati livelli di ricombinazione dei telomeri

Questo sistema viene infatti ad attivarsi quando si ha una deregolazione della ricombinazione omologa,

ovvero è dovuta ad una ricombinazione omologa che colpisce i telomeri e che in genere non avviene.

Le cellule ALT positive presentano un DNA telomerico extracromosomale a cerchio che può essere di

due tipi:

cerchi telomerici (t-circle) → derivano dalla risoluzione delle giunzioni dei T-loop

• cerchi ricchi in C e G (C- o G-circle) → sono costituiti da un'elica completa ricca in C ed una

• complementare incompleta, si trovano anche nel sangue che quindi può essere utilizzato come

metodo di screening per tumori ALT+.

Sono stati proposti due meccanismi per spiegare l'allungamento dei telomeri:

- scambio telomerico sbilanciato fra cromatidi fratelli → a livello delle estremità le regioni

omologhe possono fare CO ineguale a formare un cromatide molto lungo ed uno corto; questo

evento riportato su tutti i cromosomi determinerebbe il passaggio di una media del 50% dei

cromosomi allungati e il 50% corti alla cellula figlia, quindi è stato scartato

- sintesi del DNA dipendente dalla ricombinazione omologa → la coda di un telomero a singolo

filamento ne può invadere una a doppio filamento ed utilizzarla come stampo per allungare il

proprio filamento che verrà poi completato.

Quale sia il templato non è ancora chiaro ma potrebbero essere:

- DNA telomerico stesso mediante formazione di T-loop

- telomero del cromatide fratello

- frammento extracromosomale lineare

- circles extracromosomali. 37 11 Maggio

Cancerogenesi virale

Esistono alcuni virus oncogeni per l'uomo:

- epstein Barr → linfoma di Burkitt

- papilloma virus

- HTVL-1 → leucemia/linfoma a cellule T

HTVL-1

È l'unico retrovirus in grado di trasformare le cellule umane; la capacità di provocare tumore è dovuta a

due tipi di processi:

- acuto → il virus porta il gene v-onc

- cronico → il virus sfrutta gli oncogèni della cellula c-onc

Tra gli oncogèni coinvolti nella cancerogenesi virale c'è ad esempio sis che può essere acquisito nel

genoma virale; altri oncogeni virali sono: Myc, erbB, Akt, H-ras, Fos e CBL che possono essere utilizzati

dai virus.

Generalmente questo tipo di attivazione del processo di cancerogenesi virale non avviene nell'uomo.

La tumorigenesi si verifica a seguito dell'attivazione di oncogèni o dell'inattivazione di oncosoppressori

mediante il processo di mutagenesi inserzionale, ovvero il provirus avendo specificità per una o più

regioni del genoma si integra nei pressi dell'oncogène virale: se ad esempio si inserisce nei pressi di Myc,

la cellula utilizza gli enshancer del pro-virus per attivare la trascrizione e va a dare origine a trascritti che

contengono Myc e quindi conferiscono alla cellula un vantaggio proliferativo rispetto alle cellule

circostanti.

Nel caso di mutagenesi inserzionale i geni coinvolti possono essere: Myc, p53, IL-2, CycD..

HTLV-1 è un virus che infetta le cellule T CD4+ senza causare danno tranne per pochi individui che dopo

un lungo periodo di latenza possono acquisire una leucemia a cellule T.

Oltre a possedere i classici geni virali, HTVL porta l'oncogene TAX che svolge tre funzioni:

1. si lega al fattore bZIP ed insieme costituiscono il fattore trascrizionale che riconosce gli elementi

responsivi per TAX ed attivano la replicazione del virus transattivando le LTR

2. attiva alcuni geni dell'ospite che fungono da oncogèni e sono responsabili della proliferazione

cellulare (c-sis, IL-2, IL2R, c-fos,, GM-CSF)

3. impedisce il legame inibitorio di p16INKA4 con CDK4/6: CDK4 determina la fosforilazione di Rb

e l'ingresso della cellula in fase S.

Meccanismo tumorigenico

In genere quando HTLV1 infetta le cellule queste muoiono causando un processo infiammatorio; una

piccola quantità di cellule diverse tra loro però integra HTVL1 dando origine ad un processo di

38

proliferazione policlonale che viene sostenuta per via autocrina (producono IL-2 e ne posseggono i

recettori) e paracrina (producono GM-CSF che va a stimolare i macrofagi, i quali producono IL-1 che

continua a stimolare la crescita dei cloni).

Man mano che vengono acquisite mutazioni nei linfociti T che permettono la deregolazione della cellula

in senso maligno si ha la trasformazione maligna che porta alla formazione di leucemie: questo evento è

più raro ed avviene in genere in un solo tipo di cellula dando quindi origine ad una leucemia a cellule T

monoclonale.

Papilloma virus

HPV determina una forma tumorale responsabile del 10% dei tumori umani maligni, ed in particolare è

diffuso quello alla cervice uterina. Comprende circa 200 ceppi di cui alcuni sono oncogenici e possono

causare tumore (carcinomi) mentre altri non sono oncogenici e causano papillomi squamosi benigni

(verruche); tra i ceppi oncogenici i principali sono HPV16 e HPV18.

In generale infettano le mucose orali e genitali (raramente la cute) e possono dare a tumori più o meno

aggressivi: carcinoma della cervice, verruche genitali a basso potenziale maligno.

HPV si può mantenere nella cellula in due forme:

- episomale → nella fase premaligna

- integrato → nella fase maligna; il sito di integrazione è casuale e aspecifico.

Carcinoma alla cervice uterina

Le cellule della cervice vengono infettate da HPV che rimane a livello episomale e crea una riserva nelle

cellule basali: l'infezione causa lesioni locali che guariscono in circa 2 anni. Può succedere però che HPV

si integri e nell'arco di 10-30 anni è possibile che sviluppi un tumore aggressivo.

L'integrazione di HPV avviene utilizzando la regione del genoma virale contenente E2, la cui funzione

normale è di inibire la trascrizione dei geni virali E6 ed E7; a seguito dell'integrazione si ha la

disattivazione di E2 e quindi la trascrizione di questi due geni.

E6 → recluta una ubiquitina-ligasi cellulare (E6AP) e la trasloca su p53 inducendone la

• degradazione nel proteasoma (media la funzione di MDM2 cellulare).

E7 → lega Rb e lo sequestra impedendogli di legare E2F che quindi funziona in modo costitutivo

• ed induce l'ingresso della cellula in fase S.

L'affinità di questi due fattori per Rb e p53 determina l'aggressività di ciascun ceppo: un ceppo

aggressivo possiede E6 ed E7 particolarmente efficienti nel legare queste due proteine, quindi in ceppi ad

alto rischio si ha una perdita di funzione mentre in ceppi a basso rischio si ha una riduzione di funzione

che determina la formazione di forme che rimangono per lungo tempo benigne.

Virus di Epstein-Barr

È un herpes virus associato a diversi tipi di tumore:

- forma africana del linfoma di Burkitt

- linfoma a cellule B in pazienti immunodepressi

- carcinoma nasofaringeo

- linfoma di Hodgkin.

Linfoma di Burkitt

Colpisce i bambini ed è associato allo sviluppo di EBV.

EBV è un virus endemico in tutto il mondo che normalmente causa una forma asintomatica o la

39

mononucleosi, una malattia che viene limitata dal SI; tuttavia pazienti immunodepressi o pazienti con

HIV che contraggono EBV possono sviluppare tumori multifocali a cellule B nel tessuto linfatico o nel

SNC: sono tumori policlonali che possono dare origine a successive proliferazioni monoclonali. Il

tumore può regredire a seguito di sospensione della terapia immunosoppressiva.

Le prove a favore che EBV sia l'agente eziologico di LB sono:

- il 90% dei pazienti africani presenta EBV

- il 100% dei pazienti africani ha un elevato titolo anticorpale contro gli antigeni del capside di

EBV

- la presenza di anticorpi contro EBV è associato al rischio di sviluppare EBV

- solo il 15-20% dei pazienti con LB presenza il genoma di EBV, ma entrambe le forme di LB

(africana e classica) presentano la traslocazione di c-myc t(8;14) che porta myc a valle degli

enhancer dei geni per le catene pesanti delle immunoglobuline.

Tuttavia tutte le cellule immortalizzate da EBV non formano tumori in vivo.

Meccanismo tumorigenico

EBV infetta le cellule epiteliali e nel linfociti B attraverso CD21; questo virus porta una serie di

alterazioni che causano un'espansione policlonale di cellule che proliferano ed esprimono le proteine

virali, tra cui vi sono degli antigeni che, in caso di efficienza del SI, vengono riconosciute dai linfociti T

CD8 che attivano meccanismi di distruzione (perforine/Fas-FasL).

La proliferazione cellulare è dovuta al fatto che il genoma di EBV codifica per alcune proteine:

LMP-1 → mima CD40 e attiva costitutivamente le vie di proliferazione e sopravvivenza tipiche

• dei linfociti B (attivazione, segnali di sopravvivenza, proliferazione, espressione di FLIP, switch) e

quindi rende la cellula B infettata indipendente dai segnali del linfocita T helper mediati

dall'associazione di CD40-CD40L

EBNA-2 → mima parzialmente la funzione di Notch: agisce a livello nucleare transattivando vari

• geni dell'ospite tra cui c-Myv, cycD1 e LMP-1 virale

BHRF1 e BALF2 → sono omologhi di BCL-2, sono oncogèni con un effetto anti-apoptotico

• EBNA1 → attiva il sistema di riarrangiamento delle immunoglobuline aumentando la possibilità

• della t(8;14).

Quindi nel caso in cui l'immunoregolazione delle cellule T non sia funzionale (ad esempio

immunodepressione da malnutrizione) la continua spinta proliferativa ed anti-apoptotica porta ad una

instabilità genetica e ad una maggiore probabilità di ricombinazione somatica che porta a sviluppare la

traslocazione t(8;14) e quindi ad una overespressione di myc. A poco a poco vengono acquisite altre

mutazioni che portano alla formazione del linfoma, in particolare la mutazione di Ras.

Carcinoma nasofaringeo

Questo tumore colpisce e cellule epiteliali della naso-faringe; è molto diffuso in Cina, Turchia e nella

popolazione eschimese.

EBV gioca un ruolo fondamentale poiché il 100% dei pazienti presenta il genoma di EBV; tuttavia sono

necessarie anche una componenti genetiche e ambientali che contribuiscono alla formazione di questo

tipo di tumore; tra i fattori ambientali possono esserci anche co-infezioni con altri virus endemici in

queste zone. 40 12 Maggio

Cancerogenesi chimica e fisica

Il danno al DNA può avere diversi effetti: se il danno è massivo la cellula va in necrosi, nel caso in cui

sia potenzialmente riparabile la cellula avvia i meccanismi di riparazione ma se questo non viene riparato

la cellula può prendere due vie:

- andare in apoptosi

- fissare la mutazione e trasmetterla alle cellule figlie, compiendo il primo step che porta

all'instabilità genomica.

Le fonti di danno possono essere:

endogene → errori della replicazione o attacco da parte di specie reattive dell'ossigeno

• esogene →

• - ROS esogeni

- raggi UV, radiazioni ionizzanti

- tossine vegetali

- agenti chimici naturali e artificiali

- virus

Ossidazione

I ROS vengono normalmente prodotti durante il metabolismo cellulare, per questo la cellula possiede dei

meccanismi fisiologici che la proteggono da eventuali danni: vitamine E/C, antiossidanti tioli.

I tioli sono composti sulfidrilici presenti nell'organismo liberi in forma ridotta come disolfuri o legati alle

proteine, capaci di ridurre i ROS; esempi sono: cisteina, glutatione, omocisteina.

A proteggere la cellula dai radicali intervengono anche degli enzimi detossificanti:

2-

- superossido dismutasi → O + O + H → H O + O

2 2 2 2 2

- catalasi → 2H O → 2H O + O

2 2 2 2

- perossidasi → richiede l'azione di un substrato riducente verso H O come donatore di elettroni:

2 2

H O + RH → 2H O + O + R

2 2 2 2 2

La stessa reazione può essere catalizzata dalla glutatione S-transferasi, un'enzima polimorfico che

si trova quindi a livelli diversi ed isoforme diverse all'interno della popolazione che portano

reazioni diverse a composti chimici o farmaci.

Nel caso di perturbazioni dell'omeostasi (infiammazione, farmaci..) i ROS possono reagire con il DNA

ed avere effetti dannosi.

Quando reagiscono con il DNA causano la deaminazione ossidativa che può dare origine a tre diverse

mutazioni:

- C → U poiché viene inserita U nella sequenza di DNA il danno viene in genere riconosciuto e

riparato

- 5-metil-C → T viene più difficilmente riconosciuta e causa l'inserzione di una mutazione

puntiforme

- 8-ossi-deossiG → T causa l'inserzione di una mutazione puntiforme

41

Cancerogenesi chimica

La cancerogenesi chimica è un processo che prevede due fasi entrambe essenziali per lo sviluppo del

tumore:

1. iniziazione → avviene il danno al DNA che può potenzialmente essere trasmesso alle cellule

figlie ma se la cellula iniziata non è indotta a proliferare non si va in contro a tumorigenesi

2. promozione → ad opera di sostanze non tumorigeniche ma che permettono la proliferazione della

cellula mutata.

Questa caratteristica bifasica della cancerogenesi chimica è dimostrabile mediante un esperimento:

1. la sola somministrazione dell'agente iniziatore non provoca tumore perché la cellula iniziata non

prolifera;

2. l'esposizione anche a più dosi dell'agente promotore porta allo sviluppo di tumore se segue un

danno irreversibile. Il tumore si può formare anche se la stimolazione del promotore non è

immediatamente successiva a quella dell'iniziatore.

3. la somministrazione prima del promotore e poi dell'iniziatore non causa tumore

4. la sola somministrazione del promotore non causa tumore

5. la somministrazioni del promotore a dosi blande e razionalizzata nel tempo non causa la

formazione di tumore poiché il danno è reversibile.

Per valutare la mutagenicità di una sostanza è possibile utilizzare il test di Ames che sfrutta il carattere

auxotrofico his- di un ceppo di Salmonella, che non è quindi in grado di sopravvivere in un terreno privo

di istidina. Dopo aver piastrato i batteri vengono messi a contatto con la sostanza chimica di interesse: se

la sostanza non è mutagena i batteri muoiono e non proliferano, se invece la sostanza è mutagena i batteri

acquisiscono la capacità di sintetizzare his e sopravvivono.

Questo test non considera però il metabolismo dei farmaci e dei composti chimici all'interno

dell'organismo e quindi non permette di valutare l'eventuale tossicità di quelle sostanze che divengono

tossiche solo dopo essere state metabolizzate: il terreno viene quindi implementato con omogeneizzato di

ratto, un mix di enzimi che metabolizzano le sostanze e permettono lo studio dei metaboliti.

Gli agenti cancerogeni inizianti possono essere specie radicaliche che danno origine a specie reattive

oppure essere gia reattive elettrofile, ovvero avere atomi carenti di elettroni e quindi la tendenza a

̀specie

reagire con composti piu nucleofili (ricchi di elettroni).

̀

Questi causano la formazione di addotti covalenti tra il cancerogeno e il nucleotide.

I cancerogeni inizianti vengono divisi in due categorie:

cancerogeni ad azione diretta → per espletare la loro funzione non necessitano di trasformazione

• chimica

cancerogeni ad azione indiretta o pro-cancerogeni → richiedono una conversione metabolica in

• vivo per diventare attivi e dare origine a cancerogeni terminali

Il cancerogeno inoltre va incontro ad una attivazione metabolica; il potere cancerogeno è dato da:

- reattività intrinseca

- equilibrio tra attivazione metabolica e inattivazione (detossificazione)

La maggior parte delle sostanze chimiche è metabolizzata dalle monoossigenasi citocromo P450, enzimi

composte dal citocromo P450 e da una NADPH-P450 reduttasi: questo enzima aggiunge un gruppo

42

ossidrile rendendo le sostanze più trasportabili

+ +

NADPH + H + O + RH → NADP + H O + R-OH

2 2

L'enzima si trova localizzato a livello di fegato, cute, tratto GI e polmoni; anch'esso è polimorfico nella

popolazione e ne esistono 50 isoforme diverse.

Questo complesso metabolizza anche gli idrocarburi policiclici aromatici e quindi è responsabile anche

della maggiore o minore probabilità di sviluppare carcinoma al polmone.

Cancerogeni chimici inizianti

Esistono diversi tipi di cancerogeni chimici che fungono da iniziatori:

1. agenti alchilanti

- mostrarde azotate → sono cancerogeni deboli, non richiedono attivazione, e vengono riparati da

BER se su singola elica; si presentano sotto forma di gas inodore e incolore. Alcune agiscono

anche da antiblastico in leucemie, linfomi e nel mieloma

- fosfamidi → in particolare la Ciclofosfamide e un agente alchilante usato nella terapia anti-

̀

neoplastica ed e un immunosoppressore usato nelle malattie autoimmuni

̀

- aziridine →

- la esametilen-melammina si usa per il carcinoma ovarico ed il retinoblastoma.

- il tio-TEPA e usato principalmente come mielo-ablativo, ovvero e talmente tossico che uccide

̀ ̀

tutta la popolazione cellulare del midollo osseo. Per tale motivo, e utilizzato per preparare i

̀

pazienti che devono ricevere un trapianto di midollo osseo

2. idrocarburi policiclici aromatici → vengono prodotti dalla combustione di tabacco e petrolio e

sono costituiti da due o più anelli aromatici, sono fra i più potenti cancerogeni.

Richiedono un'attivazione che avviene nel fegato ad opera del citocromo P-450 (spesso portano

alla formazione di epatocarcinomi) e determina la formazione di specie elettrofile reattive che per

essere smaltite vengono portate alla vescica dove può portare alla formazione di un carcinoma.

Poiché vengono detossificati dalla glutatione S-transferasi ed anch'essa è polimorfica, il 50%

della popolazione con un locus deleto è più predisposta a sviluppare tumore al polmone e alla

vescica.

3. nitrosamine e amidi → si formano dalla combustione di carni animali e provocano l'alichilazione

del DNA (riparata di norma da BER) che spesso causa la formazione di carcinomi gastrici.

4. cancerogeni naturali → un esempio è l'aftotossina B1, è un potente cancerogeno che si accumula

a livello del fegato e può agire in sinergia con il virus dell'epatite B che ne impedisce la

detossificazione favorendo la cancerogenesi epatica.

Sostanze promuoventi

I promotori possono essere:

- esogeni → ad esempio fumo o infezioni virali; inducono un danno tissutale che provoca la

proliferazione delle cellule iniziate e trasmettono danno alle cellule figlie;

- endogeni → sali biliari, fattori di crescita, ormoni.

Cancerogenesi fisica 43

Il trasferimento da parte di energia radiante avviene da parte di due tipi di radiazioni:

- elettromagnetiche → si propagano come quanti di energia a massa 0

- corpuscolate → hanno massa variabile a quella sub-atomica e sono dotate di carica.

Le radiazioni possono anche essere suddivise in base al livello di energia in:

- eccitanti → l'energia è sufficiente e spostare un atomo all'orbita superiore, senza espellerlo; non

sono cancerogene

- ionizzanti → radiazioni corpuscolate, raggi X e raggi γ; hanno energia sufficiente a far espellere

gli atomi per ionizzazione primaria.

Radiazioni UV

Sono radiazione eccitanti a cui siamo continuamente esposti e possono essere suddivise in:

- UV-C → vengono assorbite completamente dall'ozono

- UV-B → vengono assorbite parzialmente dall'ozono e provocano un aumento dei melanosomi

che determinano un abbronzatura lenta ma danno una protezione efficace e duratura;

- UV-A → non vengono assorbite dall'ozono e determinano la fotossidazione della melanina

preesistente che ci dà un protezione immediata ma transitoria.

La più frequente alterazione è la formazione di dimeri di pirimidine che possono essere corretti dal

sistema NER; se non vengono riparati causano un aumento di T: i dimeri TT possono appaiarsi con AA

senza introdurre errori mentre ogni C coinvolta nei dimeri di pirimidina è deaminata dalla fotoliasi ad

uracile e può indurre una transizione C → T se non riparato dalla uracil-N-glicosilasi.

Uno dei geni più mutati è p53 che può quindi indurre la formazione di carcinomi basocellulari della cute.

Radiazioni ionizzanti

Possono essere elettromagnetiche (raggi X, raggi γ) o corpuscolate (particelle α, particelle β, protoni,

neutroni); si distinguono a seconda della capacità di penetrazione e del potere ionizzante. Le particelle β

sono più pericolose perché sono più penetranti anche se hanno un ridotto potere ionizzante.

Le radiazioni ionizzanti possono: -

1. indurre ionizzazione primaria → gli atomi che hanno perso un e sono reattivi

-

2. indurre ionizzazione secondaria → gli e persi possono a loro volta cedere energia

3. agire per azione indiretta → porta alla radiolisi dell'acqua che forma radicali liberi

- + 0

H O + Radiazione → H O+ + e → H + OH

2 2

Se non riparati possono quindi indurre danno genotossico, danno alle proteine...

Fattori che caratterizzano l’effetto delle radiazioni

Le radiazioni sono caratterizzate da:

- effetto cumulativo

- frazionamento della dose → una singola dose massiccia provoca più danni rispetto alla stessa

dose frazionata nel tempo grazie all'effetto dei sistemi di riparazione del DNA

- periodo di latenza → la cellula può accumulare e fissare la mutazione prima della

trasformazione neoplastica

- tipo tissutale → le cellule proliferanti sono più sensibili di quelle quiescenti

- stato di salute della cellula → la presenza di scavenger e di agenti ossidanti all'interno della

cellula proteggono dal danno al DNA.

Caso Eternit

Le fibre da asbesto vanno ad accumularsi nei polmoni e provocano inizialmente una asbestosi

(infiammazione) che va poi a formare il mesotelioma pleurico un tumore raro maligno. Gli effetti

dell'esposizione all'amianto compaiono a più di 10 anni di distanza.

Al momento è un tumore mortale e porta alla morte entro 3-5 anni dalla diagnosi: l'ipotesi è che le fibre

44

di asbesto interagiscano direttamente con le cellule del mesotelio provocando effetti indiretti in

combinazione con cellule infiammatorie, in particolari i macrofagi che fagocitano le fibre ma non

riescono a distruggerle; queste si accumulano nel mesotelio ed accrescono l'infiammazione: un ambiente

infiammatorio è infatti prono a sviluppare mutazioni e quindi cancro.

*l'interazione con un fattore di trascrizione ed un agente ionizzante è insidiosa poiché può andare ad

aumentare la trascrizione di oncogèni. 14 Maggio

La progressione neoplastica

La progressione neoplastica è determinata da due categorie di cause:

1. aspetto intrinseco della cellula tumorale → legata alla sua instabilità genetica che le permettono

di acquisire nuove mutazioni

2. effetto del microambiente circostante (nicchia tumorale) → in alcuni casi il microambiente è

talmente rilevante che senza il suo effetto il tumore non riuscirebbe a progredire (es. mieloma

multiplo).

La velocità con cui avviene la progressione neoplastica è determinata da entrambi questi effetti.

Per progressione neoplastica di intende un percorso tale per cui:

la cellula acquisisce instabilità genetica (crescita incontrollata, assenza di apoptosi, mutazione di geni

responsabili della riparazione del DNA..)

l'instabilità genetica causa l'accumularsi di mutazioni che riguardano una serie di caratteristiche

biologiche:

- indipendenza da fattori di crescita

- immortalizzazione

- perdita dell'inibizione da contatto

- farmaco resistenza

- capacità di indurre angiogenesi

- invasività locale

- capacità metastatiche

- aumentato trasporto del glucosio

- evasione della risposta immunitaria → l'acquisizione di proteine alterate determina la presenza

di epitopi non self che potrebbero causare il riconoscimento della cellula tumorale da parte del SI

l'aquisizione di mutazioni permette il passaggio da una situazione di monoclonalità ad una di

oligoclonalità

viene selezionato il clone con la maggior fitness

La massa tumorale è costituita da numerosi cloni: alcune caratteristiche possono essere anche indotte da

altri cloni, ovvero non è detto che l'angiogenesi sia indotta dal clone che fa metastasi.

Angiogenesi

Con angiogenesi si intende quel processo che porta alla formazione di nuovi vasi a partire dai vasi

precedentemente formati.

I tumori sono in grado di indurre angiogenesi poiché rilasciano molecole angiogenetiche e inducono il

microambiente a rilasciarne a sua volta; l'effetto è un aumento della vascolarizzazione che quindi infiltra

il tumore.

L'angiogenesi può essere indotta da un serie di cause ma la principale è l'ipossia: quando la massa

45

tumorale raggiunge 1-2mm le cellule centrali non ricevono più nutrienti ed ossigeno, vanno in ipossia ed

attivano il rilascio di molecole angiogenetiche.

In presenza di nutrienti ed ossigeno il tumore può quindi riprendere a crescere, altrimenti rimane piccolo

(questo non significa che non sia comunque aggressivo).

L'angiogenesi è un passaggio cruciale però per la crescita e l'espansione del tumore ed è un sintomo

negativo.

Oligoclonalità

Durante la progressione tumorale esistono diversi cloni che si formano e acquisiscono diverse

competenze che ne permettono o meno l'espansione.

Ciò è stato verificato mediante un esperimento in cui sono state prese delle cellule di liposarcoma e sono

state iniettate sottocute in un topo: nel tempo da queste cellule si è formato un tumore sottocutaneo. La

massa tumorale è stata poi prelevata e tagliata in piccoli frammenti che sono stati iniettati sottocute in

altri topi e a seguito del trapianto si è misurata la crescita dei diversi tumori nel tempo: si è constatato che

nonostante la massa iniziale fosse la stessa, lo sviluppo di diversi tipi di cloni determina appunto una

diversa capacità di accrescimento del tumore derivante da diversi tipi di cloni.

Controllo dell'omeostasi dell'ossigeno

Fisiologicamente diversi contesti gestiscono l'omeostasi dell'ossigeno nell'organismo:

- a livello sistemico → l'eritropoietina induce la produzione di eritrociti

- a livello locale → i mediatori locali VEGF e SDF1 (lega CXCR4) inducono angiogenesi e

vasculogenesi

- a livello cellulare → enzimi glicolitici e trasportatori del glucosio (GLUT1) inducono la

glicolisi anaerobia poiché la massa può trovarsi in assenza di ossigeno, quindi è necessario un

incremento dell'intake di glucosio. Le cellule tumorali innalzano i livelli di GLUT1, quel

trasportatore che garantisce i livelli basali di glucosio, ma non è inducibile.

Questo processo viene diviso in:

vasculogenesi → formazione di strutture vascolari da parte di cellule endoteliali staminali

• circolanti o tissutali, è particolarmente attiva nello sviluppo embrionale del sistema vascolare. È

indotta da SDF-1, una chemochina omeostatica che viene prodotta in diversi tessuti e richiama i

progenitori endoteliali circolanti che quindi forniscono gli elementi staminali per dare origine a

nuovi vasi

angiogenesi → formazione di nuovi vasi sanguigni da parte di vasi preesistenti, è attiva

• nell'adulto (es. formazione di granulazione).

A seguito di una lesione i macrofagi vengono reclutati per primi, vengono trasformati da M1 a M2

e si trascinano fibroblasti e cellule endoteliali che infiltrano e formano dei vasi a partire da quelli

circostanti (degranulazione); questi nuovi vasi sono incompleti poiché le giunzioni sono ancora

altamente permeabili a livello delle terminazioni.

Il tumore è invece in grado di indurre la neoangiogenesi tumorale che è un processo alterato dato

dall'effetto mediato dalla cellula neoplastica con il contributo di cellule stromali e leucociti

infiltranti che inducono la produzione di citochine infiammatorie (TNFα, VEGF, FGF2, PDGF) e

inattivano molecole anti-angiogenetiche.

Tale processo è indotto da VEGF, VEGF-C e VEGF-D che induce anche la linfoangiogenesi che

permette poi alle cellule di infiltrare ed arrivare fino ai linfonodi.

I vasi sanguigni possono avere due scopi: portare nutrienti ed ossigeno per permettere al tumore di

progredire ed essere utilizzati come via di fuga delle metastasi; la neoangiogenesi presenta una

46

serie di aspetti che permettono di esplicare al meglio queste funzioni: sono vasi di nuova

formazione che alle terminazioni hanno un'elevatissima permeabilità e quindi permettono

l'ingresso di più nutrienti ma anche l'uscita di più cellule tumorali, inoltre il meccanismo di

neoangiogenesi (mista tra vasculogenesi e angiogenesi) determina la formazione di grovigli, di un

endotelio mal fatto che quindi implica la diffusione di tantissimi nutrienti e l'ingresso di cellule

favorendo il processo metastatico.

L'endotelio linfatico invece non ha bisogno di fare un neolinfoangiogenesi per essere permeabile:

il suo scopo è quello di drenare elementi liquidi e solidi e di permettere l'ingresso di cellule

infiammatorie che devono portare gli antigeni nei linfonodi, quindi le terminazioni dell'endotelio

linfatico sono di per sé più permeabili e permettono l'ingresso delle cellule tumorali; il tumore

quindi in genere preferisce l'endotelio linfatico per effettuare metastasi che quindi compaiono

prima a livello del linfonodo (spesso comunque il tumore attiva la neolinfoangiogenesi).

Il passaggio da una situazione di pre-angiogenesi a neoangiogenesi è dovuto ad uno uno spostamento

dell'equilibrio tra i fattori anti-angiogenici e quelli pro-angiogenici che a livello dell'ambiente circostante

a favore dei secondi: questo effetto è mediato dalle cellule tumorali, dalla matrice circostante e dalle

cellule circostanti.

Per le cellule tumorali il primo imput per indurre angiogenesi è lo stimolo ipossico che ha due effetti:

- blocca la crescita

- induce la trascrizione di geni che inducono angiogenesi (VEGF, SDF1, EPO) e che permettono

alla cellula di vivere anche in assenza di vasi.

L'ipossia induce un accumulo di HIF-1 α e p53

L'angiogenesi viene attivata dalle proteine HIF la cui regolazione dipende dal livello di ossigeno nella

cellula.

HIF-1α può agire come fattore trascrizionale in complesso con HIF-1β che si trova nel nucleo:

normalmente i due non interagiscono poiché in situazioni di normossia una prolil-idrossilasi agisce su

HIF-1α, la idrossila e determina una conformazione che ne permette il riconoscimento da parte del fattore

VHL che si lega a HIF-1α e funge da adattatore per una ubiquitina ligasi; quindi in condizioni di

normossia HIF-1α viene ubiquitinata e degradata nel proteasoma.

In condizioni di ipossia la proli-idrossilasi non può agire per l'assenza di ossigeno, quindi HIF-1α non

viene ubiquitinata e degradata, entra nel nucleo dove forma un complesso con HIF-1β che attiva la

trascrizione dei geni EPO, SDF1, GLUT1, PDGF, VEGF.

HIF-1α inoltre blocca l'attività di MDM2 che quindi non può più indurre la degradazione di p53: quindi

in situazioni di ipossia p53 sale e in una prima fase blocca il ciclo cellulare.

Nel momento in cui l'angiogenesi permette l'apporto di ossigeno, il ciclo si sblocca ed il tumore può

continuare ad espandere ed acquisire nuove mutazioni.

È anche possibile una deregolazione di alcuni fattori angiogenici quali PDGF-BB che formano degli

omodimeri che hanno la capacità di influenzare l'angiogenesi delle cellule endoteliali e possono agire

anche sulla muscolatura liscia circostante i vasi.

L'effetto di fattori angiogenici sull'endotelio dei vasi ematici è mediato dalle integrine

L’ingaggio dei recettori per fattori angiogenici secreti dal tumore stimola l’espressione di integrine sulle

cellule endoteliali.

L'attivazione dei recettori per i fattori endoteliali induce il reclutamento di Src (tirosin chinasi) che

attraverso l’attivazione delle FAK porta alla formazione di un complesso tra recettore angiogenico e

integrine (punto di adesione focale), che aumenta l’affinita delle ultime per la ECM e la responsivita del

̀ ̀

recettore angiogenico.

Le integrine nei tumori svolgono un ruolo importante ed il loro effetto dipende dalla possibilita di

̀

47

interazione con la matrice extracellulare (es. vitronectina, fibronectina, fibrinogeno, osteopontina):

1. effetto dell'interazione a livello delle adesioni focali → attivano la migrazione cellulare

2. attivazione della sopravvivenza e crescita.

Effetto di SDF1

SDF1 può essere prodotto dalle cellule tumorali ma anche dal microambiente; una sua iperproduzione ha

due effetti:

- paracrino → si lega al suo recettore CXCR4 che stimola crescita e sopravvivenza

- endocrino → produce un gradiente chemotattico che va a richiamare i progenitori endoteliali

circolanti (EPC) che esprimono CXCR4 e reclutati localmente vanno a supportare l'angiogenesi

tumorale con un fenomeno di vasculogenesi.

Squilibrio tra fattori promuoventi e inibenti

I fattori anti-angiogenici possono essere prodotti da:

- cellule tumorali (es. trombospondina-1)

- microambiente circostante → per digestione di molecole della matrice extracellulare da parte di

metallo-proteasi che portano alla produzione di molecole anti-angiogenetiche:

- plasminogeno → angiostatina

- collagene XVIII → endostatina

- transtiretina → vasculostatina

Nei tumori avviene uno spostamento dell’equilibro verso angiogenesi

inattivazione VHL → ↑ HIF-1α → ↑ VEGF

Effetti della neoangiogenesi tumorale

Gli effetti che derivano dall'induzione di neoangiogenesi sono:

1. la perfusione fornisce ossigeno ed apporti nutritivi

2. i vasi neoformati possono essere il sito attraverso il quale le cellule che hanno acquisito capacità

metastatica vanno in circolo

3. le cellule endoteliali neoformate stimolano la crescita delle cellule tumorali e dell'infiltrato

leucocitario secernendo fattori di crescita e citochine:

- IGF (Insuline like Growth Factor)

- PGDF (Platelet Derived Growth Factor)

Effetti della neo-linfoangiogenesi tumorale

Il tumore stimola anche la linfoangiogenesi: i vasi linfatici comunque costituiscono la via preferenziale di

metastatizzazione indipendentemente dalla neolinfoangiogenesi in quanto i capillari linfatici permangono

privi di periciti e cellule muscolari lisce e hanno giunzioni permeabili rappresentando quindi il primo

organo di metastasi tumorale.

I vasi linfatici però non provvedono all’approvvigionamento di ossigeno e nutrienti

* La presenza di metastasi linfonodali e di infiltrazioni di vasi sanguigni nel tumore sono correlati con

una cattiva prognosi anche perché la presenza di metastasi linfonodali indica la probabile presenza di

altre metastasi nell'organismo. 48

Metastasi

La formazione della metastasi consiste nella formazione di una massa tumorale a partire da quella

primitiva ma in una sede lontana. Non è un processo efficiente ed avviene con una frequenza

estremamente bassa tuttavia quando il tumore acquisisce un'instabilità genetica sufficientemente alta la

produzione di cellule in grado di metastatizzare è un processo continuo ed è quindi sempre più probabile

che avvenga.

Il processo di metastatizzazione può avvenire per tre vie:

1. linfatica

2. ematogena

3. per contiguità → sfrutta liquidi dell'organismo (es. cavità peritoneale).

Invasione: transizione epiteliale-mesenchimale

La cellula tumorale epiteliale deve acquisire delle caratteristiche tipiche delle cellule mesenchimali per

poter metastatizzare, quali:

- capacità di interagire meglio con la matrice rispetto ad altre cellule

- capacità di migrazione

Queste caratteristiche sono più o meno facili da acquisire a seconda del contesto tumorale.

Questo processo avviene nel carcinoma: normalmente le cellule epiteliali hanno una porzione basale che

lega la lamina basale e le cellule sono tra loro legate da giunzioni aderenti e serrate che permettono la

coesione e la formazione di barriere. Queste caratteristiche vengono tendenzialmente perse: le cellule si

trasformano in un tipo mesenchimale in cui viene persa la polarizzazione e la forma (diventano fusate),

inoltre tendono ad aderire mediante le adesioni focali. Le E-caderine e le catenine, che costituiscono le

giunzioni ancoranti, vengono downregolate con conseguente perdita dell'inibizione da contatto.

Le cellule tumorali inoltre esprimono N-caderine, fibronectina e vimentina: integrine che permettono

di acquisire una maggiore adesione con la matrice.

Questo aspetto è fondamentale perché permette alle cellule di migrare: la capacità migratoria si traduce

nel fatto che le cellule possono metastatizzare in un sito secondario.

Durante la fase di transizione epiteliale-mesenchimale le cellule smettono di proliferare ed iniziano a

migrare finché non arrivano nel sito secondario dove effettuano una transizione mesenchimale-epiteliale.

Entrambe queste transizioni sono un processo che avviene fisiologicamente a livello embrionale.

La transizione epiteliale-mesenchimale è quindi un processo a più tappe:

1. Perdita di giunzioni intercellulari mediante downregolazione di E-caderina e catenine che

permette il distacco della cellula e determina la perdita dell'inibizione da contatto

2. Espressione di N-caderina, vimentina, fibronectina e redistribuzione di molecole di adesione alla

matrice con perdita della distribuzione polarizzata

Distacco dalla massa primitiva, degradazione della matrice extracellulare e della lamina basale

3. mediante:

- proteasi → serin-proteasi, cistein-proteasi, metallo-proteainasi

- collagenasi IV → specifica per la lamina basale

Questi enzimi possono essere prodotti sia dalle cellule tumorali che dalle cellule reclutate dal

tumore (macrofagi, fibroblasti).

La degradazione della matrice promuove la formazione di prodotti di clivaggio che promuovono

angiogenesi, motilità cellulare e proliferazione cellulare, in particolare:

- uPA (attivatore del plasminogeno tipo urochinasi ) → induce la degradazione della

trombospondina, che ha azione anti-angiogenica

- ADAM17 → libera pro-EGF dalla membrana (tumore mammella)

49

La migrazione cellulare viene incrementata in diversi modi ma soprattutto grazie alla presenza di

4. fattori chemiotattici e chemiocinetici (chemiocinesi = capacità di muoversi in modo non-

direzionale) che possono essere prodotti da:

- cellula tumorale → produce un fattore autocrino di motilità (AMF) che viene recepito da

recettori specifici della cellula

- ECM degradata → produce molecole con attività promuovente la chemiotassi

- cellule endoteliali neoformate e fibroblasti associati al tumore → producono IGF1 che oltre

ad essere un fattore di crescita ha anche una funzione sulla migrazione cellulare poiché induce

la trascrizione di chemochine che vengono rilasciate dalla cellula tumorale e vanno ad

ingaggiare i recettori chemotattici inducendo una migrazione direzionale

Il supporto da parte del microambiente può essere rilevante o meno, infatti la migrazione può avvenire in

due modi:

- la cellula tumorale può effettuare un'invasione nei vasi sanguigni attraverso un percorso solitario

- se l'epitelio non riesce a fare la transizione epiteliale mesenchimale e le cellule rimangono legate

l'una all'altra possono spostarsi insieme: questo fenomeno è spesso diretto da fibroblasti che si

trascinano dietro le altre cellule. Le cellule muovendosi deformano la matrice e creano un canale

in cui possono passare veicolate dalla prima.

Diapedesi inversa

Per entrare nei vasi sanguigni o linfatici le cellule tumorali effettuano una diapedesi inversa. Ciò è

possibile in quanto:

- i capillari linfatici non hanno periciti e muscolatura liscia attorno

- i capillari neosintetizzati a livello del tumore non hanno un rivestimento endoteliale completo e

cio facilita grandemente l’ingresso di cellule tumorali in circolo.

̀

Le cellule tumorali quindi passano nel circolo sanguigno o linfatico, tendono ad aggregarsi con altre

cellule tumorali o comunque cellule del sangue e piastrine a formare un embolo che può anche occludere

vasi; in genere comunque gli emboli non sopravvivono.

In circolo le cellule tumorali incontrano diversi ostacoli:

- riconoscimento mediato da anticorpi seguito da lisi mediata dal complemento

- attacco diretto da parte di linfociti T citotossici

- attività citotossica dei linfociti

- traumi meccanici a livello dei filtri capillari (polmoni) e del cuore.

Impianto cellulare

La fase di extravasazione può avvenire mediante due meccanismi:

meccanismo anatomico

Dipende da come è fatto il circolo che infatti presenta alcuni punti che facilitano la extravasazione.

Ad esempio il tumore alla mammella mediante i vasi linfatici raggiunge i linfonodi drenanti più vicini

ovvero quelli del cavo ascellare, quindi quando una donna viene operata di tumore alla mammella se è

maligno vengono asportati anche i linfonodi ascellari per verificare la presenza di metastasi.

Il tumore inoltre spesso va a metastatizzare nell'organo bersaglio che drena il sangue refluo dal tumore

primitivo: ad esempio nel caso dell'adenocarcinoma del colon il sangue viene drenato dalla vena cava che

si porta al fegato e quindi il tumore metastatizza nel fegato.

Questo meccanismo dipende anche dalla presenza nel circolo sanguigno di filtri capillari come i polmoni

e i reni: tumori della pelle ed altri spesso colonizzano polmoni poiché questi costituiscono il primo letto

capillare a valle del tumore.

tropismo tissutale

Il tumore ha una preferenza per l'extravasazione in un tessuto o in un altro dell'organismo a seconda delle

50

caratteristiche del tessuto stesso.

Gli eventi che determina la preferenza di extravasazione in sede rispetto ad un'altra sono ad esempio

molecole che facilitano l'extravasazione: CD44 è un glicoproteina normalmente espressa sulla superficie

del linfociti T che ne permette la migrazione di essi a livello dell'endotelio alto dei linfonodi poiché si

lega all'acido ialuronico (particolarmente espresso in questa sede anatomica); questa glicoproteina viene

utilizzata per favorire la metastatizzazione a livello linfonodale.

Inoltre le cellule tumorali si arrestano più facilmente a livello dell'endotelio dei vasi si un determinato

organo se questo è danneggiato da:

- esposizione all'ossigeno

- danno da leucociti

- susseguirsi di emboli epatici → l'embolo può danneggiare i capillari causando un danno che può

favorire la permanenza dell'embolo localmente e quindi la migrazione nei tessuti circostanti.

Inoltre alcuni contesti sono accoglienti poiché possono fornire fattori di crescita e sopravvivenza

particolarmente rilevanti per quel tumore: un esempio è il midollo osseo dove si trova un quantità elevata

di cellule staminali differenti che danno origine a diversi tessuti e rappresentano quindi una riserva;

quando un tumore inizia ad interagire con le cellule dello stroma si viene ad intrattenere un rapporto in

cui la componente tumorale sostiene la componente stromale che gli interessa ed inibisce quelle che non

gli interessano, ad esempio un tumore delle ossa inibisce gli osteoblasti e incrementa gli osteoclasti:

l'effetto è che la matrice ossea viene degradata e contemporaneamente il tumore riceve un effetto

benefico poiché la matrice ossea rilascia TGFβ, uno dei principali immunosoppressori che quindi inibisce

la risposta immunitaria che non più eventualmente riconoscere il tumore.

Quindi le cellule tumorali inducono anche un cambiamento delle cellule stromali che quindi iniziano ad

avere un pattern di espressione differente e modulano anche il comportamento di componenti non ancora

differenziate: ad esempio viene indotto il differenziamento di componenti che servono al tumore.

Inoltre c'è la possibilità che alcunii siti lontani siano più adatti alla localizzazione di un embolo

proveniente da un tumore primitivo perché producono chemochine in grado di richiamare le cellule

tumorali (SDF1, CCL-19 e CCL-21 sono delle chemochine espresse a livello linfonodale che tendono a

richiamare le cellule tumorali).

Disseminazione del tumore primitivo nelle cavità

Questa via di metastatizzazione per contiguità è un meccanismo misto in cui si ha un richiamo

chemotattico ma soprattutto il tumore tende a metastatizzare in quegli organi contenuti nella cavità

stessa: ad esempio un tumore di un organo peritoneale tenderà a creare metastasi a livello degli organi del

peritoneo diffondendo mediante il liquido peritoneale che viene anche iperprodotto (liquido ascitico) e

spesso si formano diversi noduli che si distribuiscono in tutto il peritoneo.

Un altro esempio sono i tumori del SNC che possono utilizzare il liquido cefalo-rachidiano per

diffondersi e metastatizzare.

Immunità antitumorale

L'interazione del tumore con il SI è un'interazione reciproca: infatti è vero che il SI è pronto per

contrastare il tumore ma è anche vero che il tumore attiva una serie di tecniche di evasione e di immuno-

modulazione.

Il concetto di immunosorveglianza è stato coniato da Burnet secondo cui il SI è costantemente in allerta

ed è in grado di riconoscere il tumore poiché questo presenta varianti antigeniche che ne permettono

l'identificazione rispetto alle cellule normali.

Con immunosorveglianza si intende la continua sorveglianza globale da parte del SI di controllo sulla

51

produzione di varianti antigeniche all'interno del tumore che ne permettono il riconoscimento; questo può

avvenire prima della formazione del tumore o durante la progressione neoplastica.

Le evidenze a favore di questa teoria sono principalmente tre:

- i tumori umani sono antigenici

- i tumori xenotrapiantati possono essere rigettati

- i pazienti immunocompromessi sono più suscettibili a sviluppare cancro (es. EBV correlato a

linfoma B).

I tumori sono antigenici

Questa evidenza è stata dimostrata isolando le cellule che riconoscono gli antigeni tumorali ma anche

isolando gli antigeni stessi.

Le cellule tumorali di un individuo sono state recuperate e messe in linea; dallo stesso individuo sono

stati poi purificati i linfociti tra cui vi sono anche quelli attivati dalle cellule dendritiche che hanno

incontrato la cellula tumorale e ne hanno prelevato gli antigeni e presentati ai linfociti.

I linfociti vengono posti in coltura con la linea di cellula tumorali affinché quelli che hanno ricevuto il

priming siano stimolati e a formare cloni che si espandono; i cloni vengono poi isolati mediante

ELISPOT.

È possibile anche isolare gli antigeni: una volta isolati i cloni specifici per gli antigeni, è possibile

riprendere le cellule di tumore messe in linea, costruire una libreria di cDNA con dei vettori e con essi

trasformare delle cellule. Queste cellule trascriveranno l'antigene e lo presenteranno sull'MHC: facendo

una coltura mista con i linfociti attivati e isolati e le cellule che esprimono gli antigeni tumorali è

possibile identificare quali cellule esprimono l'antigene riconosciuto dal linfocita ed è quindi possibile

isolare il vettore corrispondente.

Il tumore può essere rigettato

È possibile immunizzare un topo con cellule tumorali radiate (cellule morte ma con antigeni presenti).

Sul topo si possono poi fare due trattamenti diversi:

- trapiantare le cellule stesse tumorali per cui il topo è immunizzato ma vive (non radiate) → il

topo non sviluppa tumore perché il SI è in grado di uccidere le cellule tumorali quindi il topo è

riuscito a rigettare il tumore.

Il topo ha la capacità di rigettare il tumore anche se riceve solo dei linfociti T recuperati

precedentemente da un altro topo che aveva sviluppato risposta contro quel tumore

- trapiantare cellule di un altro tumore che esprimono antigeni differenti → il topo sviluppa

tumore perché non era immunizzato per gli antigeni espressi da quel tumore.

I pazienti immunocompromessi sono più suscettibili a sviluppare tumori

Per diversi tipi di tumore, tra il numero dei casi osservati di tumori in pazienti immunocompromessi ed il

numero di casi atteso c'è spesso una discordanza elevata a dimostrazione del fatto che i pazienti

immunocompromessi sono più proni a sviluppare tumori; mediamente infatti il 5% in più dei pazienti

immunocompromessi rispetto a quelli sani sviluppa neoplasia.

Esempi inoltre sono:

- pazienti immunodeficienti non sono solo sensibili a infezioni da EBV, ma nel 30-40% sviluppano

linfoma di Burkitt

- sindrome linfoproliferativa legata al cromosoma X (LPX) → sindrome ereditaria rara causata

da una mutazione sul cromosoma X associata ad immunodeficienza, causa una iperproliferazione

della componente linfocitica

- sindrome di Chediak-Higashi → autosomica recessiva, è causata da un difetto congenito della

52

proteina CHS1/LYST una proteina necessaria per la degranulazione di macrofagi, cellule NK,

neutrofili e mastociti. È associata a frequenti infezioni da EBV, aumento di linfomi e tumori.

Cause di antigenicità del tumore

Il tumore è antigenico poiché può esprimere dei TSA (Tumor Specific Antigen), ovvero antigeni specifici

di quel tumore e diversi da quelli espressi dalle cellule sane che derivano da prodotti di geni mutati

durante il processo neoplastico (k-Ras, p53..). L'instabilità genetica delle cellule tumorali incrementa

questo processo.

Per essere efficaci i TSA devono essere espressi a densità sufficientemente elevata per innescare una

risposta immunitaria: essi mostrano cambiamenti quantitativi nel loro profilo di espressione temporale o

tessuto- specifico che li rende riconoscibili dai linfociti.

Tra i TSA che possono essere riconosciuti ci sono:

- antigeni virali → innescano una risposta citotossicca (es. E6, E7)

- antigeni idiotipici → gli antigeni che vengono a formarsi in seguito a riarrangiamenti, ad

esempio Ig o TCRβ

- antigeni che non variano come sequenza genica ma che possono variare per modificazioni post-

traduzionali (es. muc-1 presenta una riduzione della glicosilazione).

Un'altra categoria di antigenicità è data dai TAA (Tumor Associated Antigen) ovvero quegli antigeni che

possono essere già presenti a livello della linea germinale e possono essere espressi in alcuni momenti

ma non vengono normalmente espressi nelle cellule differenziate mentre il tumore li può esprimere ed

innescare una risposta immunitaria; oppure antigeni che vengono espressi ma in quantità non sufficienti

da innescare una risposta mentre nel tumore vengono overespressi.

Tra i TAA vi sono:

- antigeni oncofetali → solitamente espressi a livello delle cellule embrionali, codificano per

fattori di crescita e quindi vengono riattivati nel tumore (es. α-fetoproteine e antigene carcino-

embrionale)

- antigeni tumorali del testicolo (TCA) → sono espressi dai tessuti riproduttivi adulti e non solo

maschili (siti immunoprivilegiati) e dai tumori (es. famiglia MAGE, di cui non si conosce l'esatta

funzione ma comunque sono spesso associate ai tumori)

- antigeni di differenziamento tessuto-specifici → vengono espressi sono in alcuni tessuti a

basso livello e nel tumore che vi origina ad alto livello e continuano ad essere espressi nelle

metastasi (es. tirosinasi, coinvolta nella sintesi di melanina, è espressa nei melanociti in piccole

quantità ma la sua espressione aumenta nel melanoma)

- antigeni overespressi → antigeni che normalmente sono espressi in piccole quantità ed in

seguito a deregolazione vengono espressi a livelli quantitativamente diversi (es. RBB2)

Cellule coinvolte nella risposta antitumorale

Le cellule coinvolte nella risposta antitumorale sono principalmente tre:

Cellule NK, linfociti T citotossici ma anche T helper di tipo 1 che inducono la risposta macrofagica e T

helper di tipo 2 che attivano la produzione di anticorpi contro il tumore.

Linfociti T citotossici

Dopo il priming sono attivati per distruggere cellule che presentano l'antigene su MHC-1 senza possedere

le molecole co-stimolatorie: inducono apoptosi grazie all'azione della perforina e del granzima che attiva

le caspasi effettrici.

Normalmente questo meccanismo induce solo apoptosi, essendo però la perforina un enzima che causa la

formazione di pori e che quindi tende a creare discontinuità di membrana se l'effetto è molto forte causa

in vitro la lisi cellulare. 53

I linfociti T utilizzano anche il meccanismo Fas/FasL che quindi attraverso FADD porta all'attivazione

della pro-caspasi 8 fino all'apoptosi.

I tumori evadono la risposta Fas-mediata in diversi modi:

- upregolando FLIP che interagisce con la caspasi-8 al posto di FADD;

- mutazioni/riduzione dell'espressione di Fas

- incremento delle proteine inibitrici dell'apoptosi IAPs

Le cellule tumorali inoltre contrattaccano i linfociti T e li uccidono mediante lo stesso meccanismo

Fas/FasL.

Cellule NK

Non possono riconoscere un antigene e quindi utilizzano un meccanismo complementare che permette

anche di far fronte ad alcune forme di evasione attivate dai tumori.

L’attivazione delle NK e dovuta allo squilibrio dei segnali attivatori e inibitori ricevuti dalla cellula

̀

tumorale:

- attivatori → sono indotti dall'ingaggio di un recettore da proteine associate allo stress

- inibitori → riconoscono MHC-I ed inibiscono l'attività di killing delle NK sulle cellule sane. La

downregolazione di MHC-I sulle cellule tumorali riduce la segnalazione inibitoria e potenzia

l'attivazione delle cellule NK.

L'attivazione della cellula NK contro la cellula tumorale può essere indotta anche da un altro

meccanismo: la cellula NK può riconoscere la cellula tumorale in seguito a produzione di antigeni

specifici della cellula tumorale, produzione di anticorpi ecc.. che se prodotti in quantità sufficienti

inducono la degranulazione della NK e quindi produzione di granzima B, perforina, FasL e TRAIL (per

attivare il recettore del TNF) e di molecole ad azione anti-tumorale come IFN-γ che induce l'attivazione

di macrofagi, morte cellule tumorali, produzione di chemochine anti-angiogeniche.

Macrofagi

Come meccanismi antitumorali utilizzano:

- citotossicità antigene-dipendente cellulo-mediata → mediante gli Fc receptors

- produzione di molecole → radicali liberi (ROS, NO), citochine (TNFα che può indurre apoptosi

attivando i recettori del TNF, IL-1) ed eicosanoidi (PGs, LTs).

- apopotosi → mediante produzione di ROS, NO, IL-1, TNF-α

Immunoediting

Il sistema immunitario può distruggere un tumore ma può anche far sì che resti in uno stato dormiente

che porta ad un aumento della malignità. Può instaurarsi una situazione di equilibrio: in una prima fase la

cellula tumorale esprime degli antigeni che la mettono a rischio di essere riconosciuta e quindi il SI

reagisce ed attiva i meccanismi di uccisione che forniscono una protezione iniziale; il tumore però è

prono a sviluppare mutazioni quindi la popolazione che non viene riconosciuta permane e rimane in

equilibrio con il SI: man mano che si formano cloni immunogenici il SI li attacca ma la popolazione

tumorale non immunogenica permane. Questa popolazione è la più aggressiva!

Si ha quindi una selezione da parte del SI delle cellule tumorali meno aggressive e rimangono solo quelle

più aggressive che il SI non riesce ad eliminare. Se questo meccanismo procede la situazione di

equilibrio viene persa ed una serie di cellule del tumore dà origine a cloni che possono espandere perché

non vengono più riconosciuti.

Lo stesso può succedere con la chemioterapia: se il chemioterapico non rimuove l'intera massa tumorale,

alcune cellule residue (probabilmente la componente staminale tumorale) permangono a fornire il nucleo

di cellule tumorali che nel tempo ridaranno origine al tumore. La componente staminale è anche meno

immunogenica. 54


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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti completi del corso di laurea in patologia generale tenuto dalla professoressa Raffaella Chiaramonte
(Voto 30/30)

Programma
Classificazione dei tumori/biologia della cellula neoplastica.
Cancro e deregolazione del ciclo cellulare.
Cancerogenesi chimica, fisica e virale.
Oncogèni.
Oncosoppressori e geni coinvolti nel processo di apoptosi.
Geni che mantengono l’integrità del genoma.
Alterazioni epigenetiche nel cancro.
Erosione dei telomeri e attività telomerasica.
Microambiente tumorale: matrice extracellulare e neoangiogenesi.
Meccanismo di invasione e metastasi.
Immunologia dei tumori.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie mediche
SSD:
Università: Milano - Unimi
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher _ariiel di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunologia e patologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano - Unimi o del prof Chiaramonte Raffaella.

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