Nozioni, Microbiologia Generale

Microbiologia

Introduzione alla microbiologia farmaceutica

La microbiologia in ambito farmaceutico studia tutti quegli organismi di diametro inferiore al micron (1/1000 mm) capaci di interagire positivamente o negativamente con il nostro organismo. Nel primo caso si agisce cercando di tutelare la loro presenza nel nostro corpo, mentre nel secondo caso si studiano i punti deboli di questi organismi per poterli eliminare.

Tipi di microorganismi

Fra i microorganismi abbiamo:

• Batteri
• Virus
• Funghi, miceti e procarioti

I microorganismi hanno morfologia diversa, ma non possiamo riconoscere un microorganismo solamente basandoci sul loro aspetto esteriore. Possono essere:

• Cocchi (di forma tonda e circolare)
• Rod (forma allungata con lunghezza nettamente superiore alla larghezza)
• Spirillum (con forma leggermente arcuata)
• Spirochete (con sinuosità che si ripetono per tutta la lunghezza)

Quando cocchi o bacilli si dispongono formando una catena si dicono strepto; quando si dispongono a grappolo si dicono straphilo. Secondo la tassonomia, in straphilococcus aureus, straphilo si riferisce al genere, aureus alla specie.

Persistenza dei batteri

I batteri non si sono mai estinti per due cause:

• Non vivono mai da soli, ma si riuniscono in colonie. In questo modo possono procurarsi sostanze nutritive con più facilità
• Di solito non uccidono l’organismo ospite, a differenza dei virus

Ad esempio, ospitiamo miliardi di batteri nel nostro intestino. Se avessimo un intestino sterile rimarrebbero molecole non metabolizzate dai batteri, e conseguentemente non digeribili dal nostro organismo.

La colorazione di Gram

La colorazione di Gram è un’importante colorazione differenziale ampiamente utilizzata in batteriologia. In base alla risposta alla colorazione di Gram, i batteri possono essere suddivisi in due categorie: Gram + (si presentano colorati in viola) e Gram - (si presentano colorati in rosso). Ci sono diverse fasi in questo tipo di colorazione:

• Ricoprire lo striscio fissato al calore con cristal violetto per 1 minuto (tutte le cellule si coloreranno di viola)
• Aggiungere soluzione iodata per 1 minuto (le cellule rimarranno viola)
• Decolorare in alcool per circa 20 secondi (Cellule Gram + risulteranno viola, quelle Gram - incolori)
• Contro-colorare con safranina per 1-2 minuti (Cellule Gram + risulteranno viola, quelle Gram - avranno una tonalità che va dal rosa al rosso)

Le differenze strutturali nella parete dei Gram - e Gram + sono in qualche modo responsabili della diversa reattività alla colorazione di Gram. Nella colorazione di Gram un complesso insolubile di cristal-violetto si forma all’interno della cellula: esso viene estratto con alcool nei batteri Gram-negativi ma non nei batteri Gram-positivi. I Gram-positivi, infatti, hanno una parete cellulare molto spessa, costituita da numerosi strati di peptidoglicano, che si disidrata in presenza di alcool. Ciò comporta la chiusura dei pori sulla membrana, impedendo al complesso insolubile cristal-violetto/iodio di uscire.

Nei batteri Gram-negativi il solvente penetra rapidamente attraverso la membrana esterna: il sottile strato di peptidoglicano non riesce ad ostacolare il passaggio del solvente, cosicché il complesso cristal-violetto/iodio viene facilmente rilasciato. Con la colorazione di Leifson si rilevano i movimenti di un microorganismo. In questo modo si colora sia il corpo del batterio che i suoi flagelli.

Strutture dei batteri (procarioti)

Vi sono:

• Strutture accessorie: possono essere presenti o meno ma la loro presenza si rivela molto importante. Strutture di questo tipo sono i flagelli, i corpi di inclusione, il pilo, la capsula (sostanza polimerica extracellulare).
• Strutture fisse: sono sempre presenti, come nucleoide o cromosoma batterico (senza membrana nucleare!), citoplasma, membrana citoplasmatica, cell wall (parete cellulare), il ribosoma e i mesosomi.

Macromolecole

Le macromolecole sono associazioni di subunità primarie.

• Gli amminoacidi costituiscono proteine (flagelli, pili, parete cellulare, membrana citoplasmatica, ribosoma e citoplasma)
• Gli zuccheri costituiscono polisaccaridi (parete cellulare, capsula, inclusioni che fungono da storage=magazzino)
• Gli acidi grassi costituiscono fosfolipidi (membrane)
• I nucleotidi costituiscono acidi nucleici (DNA nel nucleoide, cromosoma e nei plasmidi, mentre RNA nei ribosomi, in rRNA, mRNA, tRNA e citoplasma)

Composizione a secco di E. Coli

• 55% proteine
• 20,5% RNA
• 3,1% DNA
• 9,1% fosfolipidi
• 3,4% lipopolisaccaridi
• 2,5% peptidoglicano
• 2,5% glicogeno
• 2,9% precursori, metaboliti e vitamine
• 1% ioni inorganici

Questo è importante perché quando coltivo un batterio devo fornirgli in necessario. È estremamente utile conoscere il suo metabolismo.

Strutture dei batteri

Nucleoide o Cromosoma batterico: materiale genetico della cellula. È formato da un solo cromosoma (aploide) chiuso ad anello con due eliche di DNA; il cromosoma batterico è raggruppato in tu piccolo spazio non delimitato da membrana nucleare. In E. Coli sono presenti 50 domini di super-avvolgimento, dove il DNA viene stabilizzato da poliamine (proteine, a basso peso molecolare, simili agli istoni delle cellule eucariotiche), che servono a neutralizzare il pH acido dell’acido nucleico e a proteggerlo da variazioni di temperatura. Il DNA di un batterio è 1000 volte più lungo della sua struttura, ed è per questo motivo che si parla di super-avvolgimento.

Citoplasma: sostanza amorfa con grossa componente interna che lo rende gelatinoso. Non contiene reticolo endoplasmatico come avviene negli eucarioti. Sono presenti:

• Riserve di glicogeno (come materiale di riserva)
• Riserve di lipidi (il cui accumulo avviene in granuli avvolti in una membrana semplice)
• Inclusioni provviste di membrana semplice, come i carbossisomi, costituiti da acido poli-beta-idrossibutirrico (deposito di nutrienti di natura lipidica, riserva di carbonio e di energia; molecola che costituisce la plastica alternativa)
• Inclusioni sprovviste di membrana: come i granuli di polifosfati e i granuli di zolfo

Ribosomi: sito di traslazione dove vengono sintetizzate le proteine; è formato da RNA ribosomiale e proteine ribosomiali. A causa dell’assenza di reticolo endoplasmatico, tendono ad addossarsi alla membrana citoplasmatica, perché a livello della stessa sono presenti tutti gli enzimi respiratori e le fonti energetiche; sono diversi da quelli delle cellule eucariotiche: sono infatti 70S (50+30 le singole sub-unità).

Plasmide: materiale genetico extra-cromosomico. Diventa episoma quando il DNA plasmidico si integra completamente al cromosoma. Nelle cellule procariote si segue un’economia energetica: non si producono molecole o proteine se queste non servono e non fanno attività di riserva come le cellule eucariotiche. Di solito i plasmidi vengono utilizzati quando il batterio deve affrontare una situazione anomala (es. aggredire un altro organismo); inoltre, i plasmidi, contengono i geni responsabili della resistenza da parte dei microrganismi agli antibiotici.

Mesosomi: invaginazioni della membrana citoplasmatica che si ritrovano solo nei batteri Gram+. Il cromosoma batterico dei Gram-positivi, trovandosi più lontano dalla membrana non è in grado, senza aiuto, di attuare la duplicazione; per questo motivo, è la membrana che nei Gram-positivi forma dei prolungamenti, i mesosomi, apportando direttamente energia al nucleoide. I ruoli principali del mesosoma sono:

• Intervengono nella prima fase della replicazione cellulare
• Intervengono quando il batterio si deve dividere creando il setto trasverso
• Trasportano i due filamenti di DNA ai poli o agli emisferi delle cellule neoformate
• Intervengono nella formazione delle spore

Inclusioni: localizzate nel citoplasma e, nella maggior parte dei casi, separate da esso tramite una sottile membrana unitaria. Svolgono quasi sempre funzioni di accumulo di energia e riserve di nutrienti, mentre altre hanno altre funzioni specifiche: alcune, ad esempio, contengono magnetite che permette al batterio di seguire le linee di forza del campo magnetico. Le inclusioni cellulari hanno composizione variabile: possono contenere carboidrati, lipidi, proteine o materiale inorganico.

Membrana citoplasmatica: struttura sottile che circonda completamente la cellula. Spessa soltanto 8nm, questa struttura di importanza vitale è la barriera che separa l’interno della cellula (il citoplasma) dall’ambiente esterno. Essa è anche una barriera altamente selettiva che permette di concentrare all’interno della cellula specifici composti metabolici e di espellere all’esterno sostanze di rifiuto. La struttura generale consiste di un doppio strato fosfolipidico; i fosfolipidi contengono sia una componente idrofobica (acidi grassi) che una componente idrofilica (glicerol-fosfato). Dal momento che i fosfolipidi in soluzione acquosa si aggregano, essi tendono a formare spontaneamente strutture a doppio strato, con gli acidi grassi rivolti all’interno, mentre le porzioni idrofiliche rimangono esposte verso il mezzo esterno. I due foglietti fosfolipidici sono asimmetrici fra loro. L’asimmetria è dovuta alla presenza di proteine in un foglietto rispetto all’altro, creando un disequilibrio numerico di proteine fra i due foglietti. Alcune glicoproteine di superficie fungono da recettori e mediano l’entrata e l’uscita di diverse sostanze:

• Proteine peri-plasmatiche: proteine che si trovano nella regione tra la membrana interna e la membrana esterna dei batteri Gram-negativi.
• Proteine integrali di membrana: lipoproteine localizzate all’interno della membrana citoplasmatica che contengono all’estremità amino-terminale una coda lipidica che àncora la proteina alla membrana stessa.

La membrana citoplasmatica, all’apparenza rigida, è in realtà una struttura fluida in cui i fosfolipidi e le proteine hanno una elevata libertà di movimento. Esse possono essere quindi immaginate come un mosaico fluido nel quale proteine globulari si estendono attraverso uno strato fosfolipidico, altamente mobile, ma ordinato. Molecole simili agli steroli eucariotici, chiamate opanoidi, sono presenti nella membrana citoplasmatica di numerosi batteri; gli opanoidi contribuiscono a stabilizzare la struttura della membrana e a renderla meno flessibile.

La membrana citoplasmatica non è solo una barriera che separa l’interno dall’esterno della cellula, ma ha anche molte altre funzioni:

• Rappresenta una barriera di permeabilità che impedisce il passaggio passivo del contenuto citoplasmatico dall’interno verso l’esterno della cellula e viceversa.
• È la sede di diverse proteine coinvolte nel trasporto di sostanze dall’interno verso l’esterno della cellula e viceversa
• È la sede principale della conservazione dell’energia cellulare; essa può esistere in una forma energeticamente carica nella quale, attraverso la superficie, si viene a creare una separazione degli H⁺ dagli ioni OH^-. Questa separazione di cariche è una forma di energia chiamata forza proton-motrice, determinante nella motilità, nel trasporto e nella biosintesi di ATP.

Parete cellulare

La parete cellulare (cell wall), differente nei gram-positivi e nei gram-negativi, conferisce alla cellula forma e rigidità. La parete dei gram-negativi è una struttura piuttosto complessa e multi-stratificata, mentre quella dei batteri gram-positivi consiste di un singolo tipo di molecola ed è molto più spessa. Quando il microrganismo è privo di parete cellulare si definisce protoplasto e continua a sopravvivere solo se posto in soluzione isotonica. Se invece rimangono residui di parete si parla di sferoplasto; anche questo batterio è fragile e scoppia se posto in ambiente non isotonico.

Gram +: previene l’osmosi litica e conferisce rigidità e forma alla cellula. È composta da peptidoglicano; un peptide è una corta sequenza di 5, 6 amminoacidi. Il peptidoglicano di gram + è la mureina che viene complessata con acidi teicoici e proteine associate. Un batterio gram + si riconosce per l’assenza di una membrana esterna, dalla presenza di uno spesso strato di mureina sotto la quale si trova la membrana plasmatica.

La mureina è composta da N acetil glucosammina (Nag) e N acetil muratico (Nam); Nag e Nam sono uniti fra loro tramite legami glicosidici e si alternano a formare strati di mureina. Ogni acido muranico porta legato un tetra peptide formato da:

• L Alanina (L ala)
• D glutamico (D glu)
• Lisina (Lys)
• D Alanina (D ala)

Con legami peptidici queste proteine (D ala legato a lys) creano legami di transpeptidizzazione, ovvero fra piani diversi tramite ponti formati da 5 molecole di glicina. Nei legami di transpeptidizzazione partecipano solamente i Nam; tutti i Nam possiedono questo tipo di legame e ne risulta una mureina molto stabile e rigida. Nella mureina si trovano molecole di acido teicoico (ribitol fosfato); servono per rendere più stabile la struttura di peptidoglicano e frenano l’azione degli enzimi litici durante il ciclo di lisi cellulare. (N.B. il lisozima è capace di rompere i legami glicosidici fra Nam e Gam; è presente nelle lacrime. È una difesa di barriera aspecifica).

Gram -: previene l’osmosi litica e conferisce rigidità e forma alla cellula. Presenta una membrana esterna permeabile e costituita da una complessa parte lipidica (lipopolisaccaridi e alcuni fosfolipidi) e una parte proteica. Dall’esterno verso l’interno è costituita da una membrana esterna, costituita da fosfolipidi e dove sono presenti proteine, lipidi e porine; da uno strato sottile di mureina; da uno spazio periplasmatico vuoto; da una membrana citoplasmatica costituita da fosfolipidi. La presenza di più membrane che circondano il batterio favorisce la sua presenza anche in luoghi molto ostili perché permettono una sorta di protezione.

Qui la mureina è composta diversamente; i tetra peptidi sono:

• L alanina (L ala)
• D glutamico (D glu)
• A. diamino pimelico (D ap)
• D alanina (D ala)

I legami di transpeptidizzazione avvengono fra D ala e D ap ma non tutti i Nam e i Nag vengono legati fra di loro tramite un ponte CO-NH; questi sono i legami che vengono rotti dalla penicillina. La mureina crolla e si viene a modificare lo shape della cellula.

Le porine fanno parte della membrana esterna dei gram -; sono costituite da tre subunità identiche con un canale per singola subunità. Sono responsabili della diffusione passiva (che non richiede energia). Le proteine strutturali invece sono indispensabili per stabilizzare la membrana esterna.

I lipopolisaccaridi sono costituiti da:

• Parte lipidica (lipide A), che serve per ancorarsi ai lipidi della membrana esterna. Se liberato il lipide A può essere tossico per l’organismo ospite; provoca innalzamento febbrile e shock anafilattico.
• Core polisaccaridico costante
• Parte O specifica, quella più sporgente e più lontana dalla membrana esterna; cambia da una specie all’altra (antigene).

Lo spazio periplasmatico contiene enzimi idrolitici che servono alla degradazione di molecole nutritive, proteine di legame che innescano i processi di trasporto per i substrati e chemorecettori, cioè proteine coinvolte nella risposta chemotattica. Il sistema di trasporto (SecYEG) è costituito da proteine in grado di trasportare verso l’esterno le proteine prodotte e verso l’interno altre proteine in membrana nel giusto orientamento.

Elementi facoltativi

Capsule: sono elementi facoltativi. Esistono batteri che, pur essendo dotati di capsula (steptococcum pneumoniae), la perdono durante la coltivazione; ciò significa che nel codice genetico di certi organismi sono contenute informazioni in grado di produrre la capsula in certi ambienti. Si tratta delle varianti (diverso da mutanti!). Di solito la capsula è carica positivamente, così da potersi legare facilmente alla superficie cellulare carica negativamente. La capsula è frequentemente composta da zuccheri più o meno complessi prodotti dalla cellula stessa, oppure da materiale inorganico come a. ialuronico. I batteri dotati di capsula sono maggiormente protetti dall’ambiente esterno e resistono all’attacco dei macrofagi.

Il biofilm invece è composto da una formazione reticolare di fibrille che ricopre la struttura più periferica del batterio; è in grado di aderire tenacemente a superfici organiche e inorganiche. Il biofilm è spesso immune ai farmaci e l’unico modo per liberarsene e rimuoverlo.

Flagelli

Flagelli: servono per muoversi in un ambiente liquido. Sono costituiti da una proteina, la flagellina e hanno una lunghezza di 20 micron. A seconda della loro presenza o meno i batteri si classificano in:

• Atrichi, ovvero senza flagelli
• Monotrichi, con un flagello
• Anfitrichi, con un flagello ad entrambi i poli
• Lofotrichi, con un ciuffo di flagelli in uno o in due poli
• Peritrichi, con molti flagelli

Nei procarioti i flagelli sono costituiti da 3 fibrille elicoidali unite che formano un microfilamento. Il flagello si divide in filamento, cioè la parte esterna; uncino, che connette il filamento al corpo basale; il corpo basale.

Quest’ultimo è strutturato diversamente a seconda della parete in cui deve essere inserito. Nei gram + vi è un solo sistema a doppio disco che si inserisce nella membrana plasmatica, mentre nei gram - una coppia di dischi (anello M + S) è situata nella membrana plasmatica, mentre l’altra (anello P + L) nella membrana esterna. L’albero connette le due coppie di dischi fra di loro.