Concetti e nozioni di microbiologia

Colorazioni

L'esame microscopico può essere eseguito a fresco o dopo particolari colorazioni. Nel primo caso la struttura dei microrganismi non viene alterata ma, risulta molto difficile apprezzare le cellule e le loro strutture interne ed esterne, in quanto sono quasi completamente trasparenti alla luce. Al fine di aumentare la visibilità delle cellule vengono utilizzati diversi coloranti. D'altra parte la colorazione richiede la preventiva fissazione della cellula batterica che determina un'alterazione della forma e delle dimensioni. La fissazione può essere effettuata mediante calore o chimicamente; nel primo caso si esegue solo un leggero riscaldamento per non correre il rischio di rovinare la cellula. Nella fissazione chimica si usano miscele a base soprattutto di alcol etilico. I coloranti possiedono un gruppo cromoforo che ne determina il colore caratteristico. Possono essere basici o acidi. I primi hanno una carica elettrica positiva (cationici), come il blu di metilene, la fucsina basica, il cristalvioletto e si legano ai gruppi acidi della cellula batterica (acidi nucleici e proteine). I coloranti acidi, con carica elettrica negativa (anionici), come la fucsina acida, si legano invece alle strutture cellulari batteriche cariche positivamente (citoplasma). Poiché la cellula batterica è uniformemente basofila, nelle colorazioni batteriologiche è possibile usare solo coloranti basici.

Le colorazioni batteriologiche si distinguono in:

• Colorazioni semplici: si utilizza un solo colorante basico che dà un'indicazione sulla forma, dimensioni e disposizione dei batteri sullo spazio.
• Colorazioni differenziali: si usano diversi tipi di coloranti che consentono di evidenziare differenze di colorazioni tra specie batteriche diverse. Esempi di colorazione differenziale sono la colorazione di Gram e la colorazione di Ziehl-Neelsen.

Colorazione di Gram

Con questa colorazione è possibile distinguere tra batteri gram+ e gram- in virtù delle loro differenze strutturali a livello di parete cellulare. Nella colorazione di Gram il preparato viene sistemato su un vetrino portaoggetti e sottoposto a una colorazione primaria con cristalvioletto o violetto di genziana che colora di viola sia i gram+ sia i gram-. Il successivo trattamento viene fatto con una soluzione mordenzante di iodio e ioduro di potassio (soluzione di Lugol), la quale legandosi al cristalvioletto forma un complesso insolubile e si ha quindi una maggiore stabilità del colorante all'interno della cellula. La decolorazione viene effettuata con alcol etilico a seguito della quale i batteri gram- perdono il loro colorazione mentre i batteri gram+ rimangono viola. Questo avviene perché il complesso colorante-Lugol non riesce a passare attraverso lo spesso strato di peptidoglicani dei batteri gram+; al contrario nei batteri gram-, dove lo strato di peptidoglicani è piuttosto sottile si ha la fuoricita di tale complesso. A questo punto si procede alla colorazione con un colorante di contrasto, la safranina, che lascerà inalterata la colorazione viola dei gram+ ma colorerà di rosso i gram-.

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Questa colorazione viene utilizzata per mettere in evidenza i micobatteri. Questi batteri a causa degli spessi involucri che circondano la cellula batterica si colorano male con la colorazione di Gram, per questo motivo è necessario utilizzare coloranti addizionati di acido fenico che aumentano il potere di penetrazione dei coloranti attraverso questa spessa parete. I micobatteri sono bacilli acido-resistenti, cioè sono resistenti alla decolorazione a causa della formazione di aril-metano-micolati tra la fucsina fenicata e alcuni componenti degli involucri che circondano i batteri; per questo motivo anche in seguito a decolorazione la fucsina non fuoriesce dalla cellula batterica e i micobatteri manterranno così la colorazione rosa. Al contrario, tutti gli altri microrganismi presenti nel preparato assumeranno il colorante di contrasto (blu di metilene).

OSSERVAZIONE MICROSCOPICA

L'osservazione al microscopio è l'unico mezzo per poter vedere le cellule eucariotiche ed i microrganismi poiché le loro dimensioni sono inferiori al potere di risoluzione dell'occhio umano. Tutti i microrganismi, eccetto i virus, possono essere osservati mediante microscopio ottico, mentre i virus a causa delle loro dimensioni possono essere osservati soltanto al microscopio elettronico.

Microscopio ottico: ha un potere di risoluzione di 0,2 micrometri e può ingrandire fino a 1000-1500 volte. Consiste in un sistema ottico formato da lenti “oculare” e da lenti “obiettivo”. L'oculare è generalmente una lente a basso ingrandimento e produce di solito un ingrandimento 10×, l'obiettivo è al contrario costituito da una lente a maggior ingrandimento (sono normalmente tre ed ognuna di esse produce ingrandimenti differenti, 10×, 40×, 100×). L'ingrandimento totale è dato dal prodotto dell'ingrandimento della lente oculare per quello della lente obiettivo. Una sorgente luminosa e un condensatore permettono l'illuminazione del preparato il quale viene allestito su un vetrino portaoggetti e ricoperto con un vetrino di minor spessore detto coprioggetto. La messa a fuoco dell'oggetto viene realizzata tramite una vite micrometrica (piccoli spostamenti) o macrometrica (grandi spostamenti). Nel microscopi i vari obiettivi sono posti su di un sistema ruotante il quale permette, una volta messo a fuoco con un obiettivo, di avere automaticamente a fuoco gli altri obiettivi. Obiettivi capaci di forti ingrandimenti sono quelli ad immersione (100×), ove si interpone tra lente e vetrino, olio di cedro che ha lo stesso indice di rifrazione del vetro per cui i raggi luminosi penetrano in maniera rettilinea permettendo una visione più nitida dei dettagli.

Esistono diversi tipi di microscopio ottico, tra questi ricordiamo:

• Microscopio in campo chiaro: può essere utilizzato per osservare preparati a fresco di microrganismi vivi (urine) ma a causa del modesto contrasto le immagini non sono nitide per cui soltanto un occhio esperto riesce a scorgere determinate particolari. Tale microscopio viene quindi più spesso utilizzato per osservare preparati colorati. Il potere risolutivo di questo strumento è di circa 0,2 micrometri, quindi non consente di osservare i batteri più piccoli, appiccamenti batteriche e particelle virali.
• Microscopio a fluorescenza: ha un potere risolutivo maggiore a causa del fatto che la fonte luminosa è rappresentata da raggi ultravioletti. Poiché questi raggi non sono visibili all'occhio umano, con questo strumento si possono osservare solo microrganismi naturalmente fluorescenti o resi tali in seguito a particolari colorazioni.

1. Molto spesso una cellula batterica contiene più di un cromosoma (in media 2). Ciò è una conseguenza della mancanza di sincronicità fra la replicazione del materiale cromosomico e la divisione cellulare. Oltre al cromosoma, la maggior parte dei batteri possiede un certo n^o di molecole di DNA, sempre a struttura circolare e di dimensioni ridotte rispetto al "cromosoma", denominate plasmidi dotate di autonomia replicativa.

2. Più frequentemente si tratta di gran glicogeno, di un polimero dell'acido β-idrossibutirrico, di polisaccaridi o di polifosfati.

Membrana esterna. E’ una struttura bistratificata; il suo foglietto interno assomiglia alla composizione della membrana citoplasmatica mentre nel foglietto esterno sono presenti molecole di LPS. Di conseguenza i foglietti di questa membrana sono asimmetrici e le proprietà di questo doppio strato differiscono considerevolmente da quelle di una membrana biologica simmetrica. La capacità della membrana esterna di escludere le molecole idrofobiche è un aspetto insolito e serve a proteggere la cellula dall’azione dei sali biliari. La membrana esterna possiede canali speciali, costituiti da molecole proteiche chiamate porine, che consentono la diffusione passiva di composti idrofili a basso peso molecolare. La membrana esterna inoltre contiene una serie di proteine meno abbondanti che sono interessate al trasporto di molecole specifiche, come la vitamina B12.

Il lipopolisaccaride è composto da un lipide complesso, chiamato lipide A, al quale è attaccato un polisaccaride costituito da un core e una serie terminale di unità ripetute. LPS è unito alla membrana esterna da legami idrofobici e viene sintetizzato sulla membrana citoplasmatica e poi trasportato all’esterno. Il lipide A è formato da una serie di unità di disaccaride di glucosamina fosforilata a cui sono attaccati numerosi acidi grassi a catena lunga. L’acido beta-idrossimiristico, un acido grasso C14, è sempre presente ed è tipico di questo lipide; gli altri acidi grassi variano a seconda della specie batterica. Il core è simile in tutte le specie gram- e le unità ripetute sono di solito trisaccaridi lineari, tetra o pentasaccaridi ramificati. LPS è estremamente tossico per gli animali e viene chiamato endotossina e a causa del suo forte legame con la superficie cellulare viene rilasciato solo quando le cellule sono lisate. Quando LPS viene scisso il lipide A e polisaccaride, la tossicità rimane associata alla prima frazione. Il polisaccaride rappresenta l’antigene principale della superficie della cellula batterica e costituisce il cosiddetto antigene O.

Spazio periplasmico. Lo spazio compreso fra la membrana interna e quella esterna, denominato spazio periplasmico, comprende lo strato di peptidoglicano e una soluzione proteica simile a un gel. Lo spazio periplasmico è circa il 20-40% del volume cellulare. Le proteine periplasmiche comprendono proteine leganti di specifici substrati e enzimi idrolitici. Inoltre il periplasma contiene notevoli di polimeri altamente ramificati di D-glucosio, lunghi da otto a dieci residui.

Enzimi che attaccano la parete cellulare.Il legame beta-1,4 dell’intelaiatura del peptidoglicano viene idrolizzato dall’enzima lisozima che si trova nelle secrezioni animali (lacrime, saliva e secrezioni nasali). I batteri gram+ trattati con lisozima in terreni a bassa pressione osmotica vengono lisati; se la pressione osmotica del terreno viene aumentata fino a bilanciare quella interna della cellula si ottengono protoplasti liberi. La membrana esterna dei gram- impedisce la penetrazione del lisozima, a meno che non sia disgregata da un agente chelante come l’EDTA; in terreni osmoticamente protetti i batteri trattati con EDTA e lisozima formano sferoplasti che possiedono ancora residui della complessa parete cellulare. Gli stessi batteri posseggono delle autolisine: enzimi idrolitici che attaccano il peptidoglicano e che hanno una funzione essenziale nella crescita e nella divisione cellulare, ma la loro attività si riscontra soprattutto durante la disgregazione delle cellule morte. Se gli sferoplasti e i protoplasti sono in grado di crescere e dividersi vengono chiamati forme L; queste vengono prodotte più facilmente con la penicillina che con il lisozima, e ciò fa ritenere che essa innescare la presenza di peptidoglicano residuo. Le forme L possono ritornare a forme baciallari normali dopo l’allontanamento dello stimolo induttore e sono in grado di riprendere la sintesi di una parete cellulare normale. Alcune specie batteriche producono