Concetti e nozioni di microbiologia

COLORAZIONI

L’esame microscopico può essere eseguito a fresco o dopo particolari colorazioni. Nel primo caso la struttura dei microrganismi non viene alterata ma, risulta molto difficile apprezzare le cellule e le loro strutture interne ed esterne, in quanto sono quasi completamente trasparenti alla luce. Al fine di aumentare la visibilità delle cellule vengono utilizzati diversi coloranti. D’altra parte la colorazione richiede la preventiva fissazione della cellula batterica che determina un’alterazione della forma e delle dimensioni. La fissazione può essere effettuata mediante calore o chimicamente; nel primo caso si esegue solo un leggero riscaldamento per non correre il rischio di rovinare la cellula. Nella fissazione chimica si usano miscele a base soprattutto di alcol etilico.

I coloranti possiedono un gruppo cromoforo che ne determina il colore caratteristico. Possono essere basici o acidi. I primi hanno una carica elettrica positiva (cationici), come il blu di metilene, la fucsina basica, il cristalvioletto e si legano ai gruppi acidi della cellula batterica (acidi nucleici e proteine). I coloranti acidi, con carica elettrica negativa (anionici), come la fucsina acida, si legano invece alle strutture cellulari batteriche cariche positivamente (citoplasma). Poiché la cellula batterica è uniformemente basofila, nelle colorazioni batteriologiche è possibile usare solo coloranti basici.

Le colorazioni batteriologiche si distinguono in:

• Colorazioni semplici: si utilizza un solo colorante basico che dà un’indicazione sulla forma, dimensioni e disposizione dei batteri sullo spazio.
• Colorazioni differenziali: si usano diversi tipi di coloranti che consentono di evidenziare differenze di colorazioni tra specie batteriche diverse. Esempi di colorazione differenziale sono la colorazione di Gram e la colorazione di Ziehl-Neelsen.

Colorazione di Gram

Con questa colorazione è possibile distinguere tra batteri gram+ e gram- in virtù delle loro differenze strutturali a livello di parete cellulare. Nella colorazione di Gram il preparato viene sistemato su un vetrino portaoggetti e sottoposto a una colorazione primaria con cristalvioletto o violetto di genziana che colora di viola sia i gram+ sia i gram-. Il successivo trattamento viene fatto con una soluzione mordenzante di iodio e ioduro di potassio (soluzione di Lugol), la quale legandosi al cristalvioletto forma un complesso insolubile e si ha quindi una maggiore stabilità del colorante all’interno della cellula. La decolorazione viene effettuata con alcol etilico a seguito della quale i batteri gram+ trattengono il colorante mentre i batteri gram- rimangono incolori. Questo avviene perché il complesso colorante-Lugol non riesce a passare attraverso lo spesso strato di peptidoglicani dei batteri gram+; al contrario nei batteri gram-, dove lo strato di peptidoglicano è piuttosto sottile si ha fuoriuscita di tale complesso. A questo punto si procede alla colorazione con un colorante di contrasto, la safranina, che lascerà inalterata la colorazione viola dei gram+ ma colorerà di rosso i gram-.

COLORAZIONI

L'esame microscopico può essere eseguito a fresco o dopo particolari colorazioni. Nel primo caso la struttura dei microrganismi non viene alterata ma, risulta molto difficile apprezzare le cellule e le loro strutture interne ed esterne, in quanto sono quasi completamente trasparenti alla luce. Al fine di aumentare la visibilità delle cellule vengono utilizzati diversi coloranti. D'altra parte la colorazione richiede la preventiva fissazione della cellula batterica che determina un'alterazione della forma e delle dimensioni. La fissazione può essere effettuata mediante calore o chimicamente; nel primo caso si esegue solo un leggero riscaldamento per non correre il rischio di rovinare la cellula. Nella fissazione chimica si usano miscele a base soprattutto di alcol etilico.

I coloranti possiedono un gruppo cromoforo che ne determina il colore caratteristico. Possono essere basici o acidi. I primi hanno una carica elettrica positiva (cationici), come il blu di metilene, la fucsina basica, il cristalvioletto e si legano ai gruppi acidi della cellula batterica (acidi nucleici e proteine). I coloranti acidi, con carica elettrica negativa (anionicì), come la fucsina acida, si legano invece alle strutture cellulari batteriche cariche positivamente (citoplasma). Poiché la cellula batterica è uniformemente basofila, nelle colorazioni batteriologiche è possibile usare solo coloranti basici.

Le colorazioni batteriologiche si distinguono in:

• Colorazioni semplici: si utilizza un solo colorante basico che dà un'indicazione sulla forma, dimensioni e disposizione dei batteri sullo spazio.
• Colorazioni differenziali: si usano diversi tipi di coloranti che consentono di evidenziare differenze di colorazioni tra specie batteriche diverse. Esempi di colorazione differenziale sono la colorazione di Gram e la colorazione di Ziehl-Neelsen.

Colorazione di Gram

Con questa colorazione è possibile distinguere tra batteri gram+ e gram- in virtù delle loro differenze strutturali a livello di parete cellulare. Nella colorazione di Gram il preparato viene sistemato su un vetrino portaoggetti e sottoposto a una colorazione primaria con cristalvioletto o violetto di genziana che colora di viola sia i gram+ sia i gram-. Il successivo trattamento viene fatto con una soluzione mordenzante di iodio e ioduro di potassio (soluzione di Lugol), la quale legandosi al cristalvioletto forma un complesso insolubile e si ha