Morfologia, embriologia e biologia cellulare

MORFOLOGIA (I modulo)

Il termine MORFOLOGIA deriva dal greco e vuol dire forma. Fu coniato da Goethe nel

1785 per indicare l’anatomia comparata e la descrizione delle forme. E’ una branca

della biologia che studia la forma e la struttura degli esseri viventi.

Quando si parla di morfologia esterna, ci si riferisce alla descrizione della forma

esterna dell’organismo e i rapporti di posizione delle varie parti o di organi visibili

esternamente; quando invece si parla di morfologia interna, ci si riferisce

all’indagine sulla struttura interna visibile ad occhio nudo (anatomia macroscopica)

o al microscopio (anatomia microscopica).

La morfologia che si occupa delle cellule prende il nome di citologia, quella che studia

i tessuti si chiama istologia, mentre quella che tratta le trasformazioni delle forme

durante lo sviluppo è l’embriologia.

Lo studio morfologico può essere di tipo descrittivo, se fornisce la descrizione delle

strutture di un organismo; comparato, se paragona le strutture nei diversi organismi

morfogenesi

e sperimentale, se studia i processi della (insorgenza e differenziamento

della forma) e i meccanismi o fattori che la influenzano.

Oltre ad avere diversità morfologiche nelle cellule, nei tessuti e negli organi di una

stessa specie, si riscontrano diversità in specie diverse. Esempio tipico è il CUORE, che

è diverso nei diversi animali. Le differenze di struttura del cuore si riflettono

sull’apparato cardiocircolatorio e sul tipo di circolazione. Inoltre, nei vertebrati il

sangue non bagna i tessuti ma rilascia CO2 e O2 per diffusione.

Per uno studio microscopico è necessario seguire tre parametri fondamentali:

ingrandimento (rapporto fra la dimensione dell’immagine al microscopio rispetto a

quella reale), contrasto e risoluzione (fa emergere dettagli e nitidezza ed è la distanza

minima che deve esserci tra due punti, affinché questi

siano percepiti separati). Quest’ultima dipende

dall’EQUAZ. DI ABBE’ , in cui λ è la lunghezza d’onda o il fascio di elettroni, n l’indice

di rifrazione mentre α è l’apertura angolare. La miglior lente teorica dovrebbe essere

di 90°, mentre quella reale è di 70°.

I microscopi possono essere di tipo OTTICO o ELETTRONICO. I microscopi ottici

funzionano con raggi luminosi proiettati alla retina di chi guarda e utilizzano lenti di

ingrandimento. Questi hanno raggiunto il top delle qualità, il futuro in questo campo

sarebbe solo collegare delle videocamere, a loro volta collegate a dei PC così da

filmare i processi ed osservali senza l’operatore e di aumentare la qualità

dell’immagine.

IN CAMPO CHIARO. Il campione è attraversato direttamente dalla luce,

 appare chiaro su sfondo chiaro.

IN CAMPO SCURO. La luce viene proiettata sul campione con un angolo

 non diretto ed il campione riflette la luce raccolta dal condensatore,

apparendo chiaro su fondo scuro.

A CONTRASTO DI FASE. Ha un sistema di lenti tali da produrre immagini di

 campioni trasparenti, osservabili grazie alle diverse densità dei campioni

e dunque, alla presenza di zone più chiare e zone più scure. A

CONTRASTO DI FASE INTERDIFFERENZIALE (è più sensibile, in quanto

possiede un sistema di polarizzazione, prisma di Wollaston e un

analizzatore. Ciò divide il fascio di luce in 2 raggi che seguono diverse

direzioni. Dopo aver attraversato il campione, essi vengono ricombinati,

ma non allo stesso modo, e aumenta la risoluzione).

A FLUORESCENZA. Usa la monocromatica per stimolare il fenomeno

 naturale (o autofluorescenza, prodotta da sostanze presenti nel tessuto) o

artificiale (con i fluorocromi) della fluorescenza (capacità di alcune

molecole di assorbire la luce ad una λ ed emetterla ad una λ maggiore)

presentato dal campione. Viene utilizzato per sapere come sono

distribuite le strutture all’interno delle cellule.

A EPIFLUORESCENZA. In esso, la luce viene mandata dall’alto sullo

 specchio rispetto al campione basso.

A FLUORESCENZA CONFOCALE. In cui, la luce che proviene da un laser

 passa attraverso il campione che emette la luce fluorescente. Questa

passa poi all’apertura confocale prima di arrivare al rilevatore. Tale

sistema considera un solo piano di fuoco ed esclude gli altri.

A LUCE POLARIZZATA. Ha un filtro polarizzato, con il quale si evidenziano

 le strutture ordinate (cristalline) che danno il fenomeno della

birinfrangenza.

OTTICO COMPOSTO. Ingrandisce l’immagine attraverso passaggi

 successivi, passando attraverso più lenti che ingrandiscono le immagini

volta per volta.

COMPOSIZIONE

Parte meccanica o stativo. Questa comprende la base (pesante per

o minimizzare le vibrazioni), la sorgente d’illuminazione (proietta la luce verso

l’alto) e il braccio, a cui sono attaccati il vetrino portaoggetti con sistema di

pinze, manopole per spostare il vetrino e manopole per spostare il vetrino

portaoggetti (monometrica, per mettere a fuoco e micrometrica, per piccoli

aggiustamenti)

Parte ottica o sistema di lenti. E’ la parte più importante e comprende il

o condensatore (che raccoglie ed indirizza verso il campione la luce, attraverso un

diaframma con apertura che regola la quantità di luce), l’obiettivo (ogni

microscopio lo possiede con diverse capacità di ingrandimento ed è posto su un

REVOLVER con possibilità di ingrandimento. Più è corto, maggiore sarà

l’ingrandimento) e l’oculare (che a sua volta ingrandisce l’immagine

nuovamente).

IL PRODOTTO DELL’IMMAGINE VISTA E’ IL PRODOTTO FRA OCULARE E

OBIETTIVO.

I microscopi elettronici, invece, sono utili per analizzare le strutture subcellulari e

vengono usati in ambienti in cui è stato creato il vuoto, poiché se ci fosse l’aria gli

elettroni sarebbero dispersi.

TEM (a trasmissione). Viene utilizzato per sezioni molto sottili dei tessuti.

 E’ formato da un cannone elettronico che consiste in un filamento

metallico portato ad incandescenza grazie ad una corrente elettrica di

50/100 K. Presenta un tubo elettronico con un catodo all’apice, che

trasmette elettroni attratti dall’anodo. Vi sono una serie di lenti che

fungono da condensatore ed indirizzano, dunque, il fascio sul campione,

il quale è precedentemente fissato e colorato con Sali di metalli pesanti.

Le lenti sono bobine elettromagnetiche capaci di creare un campo

elettromagnetico variabile, che fa focalizzare sul campione gli elettroni,

che lo colpiscono passando attraverso lenti intermedie e poi

raggiungendo il rilevatore per avere un’immagine. Viene effettuata poi

una fotografia.

SEM (a scansione). E’ molto più piccolo del TEM ma fornisce immagini

 3D, un’ampia gamma di informazione su morfologia, composizione e

struttura e presenta comunque il tubo elettronico, in cui passano gli

elettroni. Quando questi arrivano sul campione (precedentemente

preparato, fissato, disidratato e dorato), si ha un’emissione di elettroni

secondari, catturata dal rilevatore che ha un oscillatore che emette fotoni

quando viene eccitato dagli elettroni che lo colpiscono. I fotoni generano

un’immagine visibile dai monitor.

A FORZA ATOMICA. E’ un SEM potentissimo di sonda, in grado di fornire

 un’ottima risoluzione a livello di molecole e atomi. E’ possibile osservare i

campioni biologici prima di fissarli e trattarli.

Preparazione dei campioni (procedimento istologico)

1. DISSEZIONE/PRELIEVO, per studiare la morfolgia (anatomia interna), per l’analisi

istologica di organi e tessuti, per rinvenire parassiti negli organi, per definire la

condizione riproduttiva ed espiantare materiale utile per trapianto o colture

cellulari.

PROCEDURA ED ATTREZZATURA

Preparare gli strumenti necessari, quali bisturi, pinze, pinzette, forbici,

o aghi manicati, sonde ed eventualmente stereomicroscopio.

Orientare correttamente l’animale poiché il cordone nervoso è

o posizionato diversamente.

INVERTEBRATI (iponervi) vengono dissezionati sulla superficie dorsale,

in quanto hanno il cordone nella zona ventrale, bisogna aprirlo dalla parte

opposta.

VERTEBRATI (epinervi) vengono dissezionati sulla superficie ventrale,

poiché hanno il cordone dorsalmente.

Taglio non troppo profondo e per non danneggiare gli organi bisogna

o rivolgere sempre la punta verso l’alto.

2. FISSAZIONE (cruciale), immergendo il campione in una soluzione liquida così da

stabilizzarlo e per impedire che vada incontro ad AUTOLISI post-portem per

mezzo di una autodigestione degli enzimi contenuti nelle cellule o che i tessuti

si DEGRADINO a causa di agenti esterni. Inoltre, in questo modo si protegge il

campione dallo stress delle fasi successive.

METODI DI FISSAZIONE

Fisici, utilizzando alte e basse temperature con N liquido, isopentano ecc

o in modo veloce.

Chimici, utilizzando sostanze e miscele di sostanze (fissativi 1:10) nelle

o quali si va ad immergere il campione per un tempo variabile o perfusione,

inserendo il fissativo nel torrente circolatorio dell’animale.

PRINCIPALI FISSATIVI

Aldeidi (formaldeide/formalina o gluteraldeide)

o Alcoli (etanolo)

o Acidi organici e minerali (acido acetico, tricoloracetico, pirico, cianico)

o Sali di metalli pesanti (bicromato di potassio, cloruro di mercurio)

o

MISCELE DI FISSAZIONE

Liquido di Bouin, miscela di soluzione satura di acido pirico, acetico e

o formalina, indicato per pezzi voluminosi.

Liquido di Carnoy, miscela di etanolo, cloroformio ed acido acetico, per

o fissare cellule isolate.

3. INCLUSIONE, si ottiene un blocchetto in paraffina (miscela di idrocarburi saturi

non miscibili in acqua) all’interno del quale c’è il campione, che permette il

taglio in fette sottili.

FASI Disidratazione in solventi organici (etanolo) a gradazione crescente (70-

o 80-90-100)

Chiarificazione nello xilolo, che riesce a miscelarsi sia con il campione

o che con la paraffina.

Inserimento del pezzo nella paraffina fusa ed a causa del calore

o fuoriesce lo xilolo ed entra la paraffina. Una volta solidificato, al pezzo

può essere aggiunto un sostegno che funga da base di aggancio al

microtomo.

Se i pezzi non devono essere visti al MO ma al TEM, l’inclusione viene fatta

con RESINE

IPODOSSIDICHE, più dure e che permettono di tagliare fette più sottili.

4. TAGLIO (MICROTOMIA), per ottenere sezioni sottili utilizzando il microtomo.

MICROTOMO ROTATIVO

Portapezzo, dove si aggancia il blocchetto. Viene mosso di una quantità

o di µm impostata ogni volta che si va ad agitare il volano in senso orario.

Portalama, dove è inserita la lama monouso, molto tagliente. Questa

o taglia le fettine ogni volta che avviene una rotazione e poi quest’ultime

vengono raccolte con dei pennelli, messe a bagnomaria per distendere il

tessuto all’interno di esse e poi una volta raccolte su un vetrino

portaoggetti, fatte asciugare per permettere un’adesione migliore. I

vetrini si conservano a -80°C fino a quando non avverrà la colorazione.

Volano.

o

ULTRAMICROTOMO

Serve per tagliare campioni inclusi in RESINE EPOSSIDICHE destinate al TEM.

Ha gli stessi elementi

del microtomo (+ un binoculare poiché i pezzi sono molto piccoli) ma il

materiale è diverso.

Acciao (microtomo e miostato).

o Vetro o Diamante (ultramicrotomo).

o

5. COLORAZIONI, per colorare i campioni che per lo più sono trasparenti ed

aumentare il contrasto dei componenti della cellula e dei tessuti, per identificarli

meglio al microscopio. Viene scelta i base a ciò che interessa osservare,

alterandolo il meno possibile. Di solito vengono usate polveri e soluzioni.

CLASSIFICAZIONE

Acquosi

o A base alcolica

o Vitali (utili su cellule vive che li assorbono, accumulandoli nelle strutture

o affini) TRIPANBLU (per studiare la fagocitosi dei macrofagi)

 VERDEGIANUS (per individuare i mitocondri)

 BLU DI METILENE (per le cellule nervose)



Non vitali (usati nei campioni fissati, ma non vivi).

o Naturali (hanno origine nel mondo animale e vegetale)

o Artificiali (sono sintetici)

o Acidi (COOH, si deprotonerà e legherà cariche +, SOSTANZA ACIDOFILA)

o Basici (NH2, si protonerà e legherà cariche -, SOSTANZA BASOFILA)

o Neutri (posseggono entrambi i gruppi)

o

TIPI DI COLORAZIONE

Diretta, quando il colorante agisce direttamente senza che ci sia stati dei

o trattamenti preventivi di preparazione.

Indiretta, quando prima di immergere nel colorante si devono fare dei

o trattamenti con sostanze mordenti per far acquisire al tessuto la capacità

di assorbire il colore.

Progressiva, quando si inseriscono le sezioni nel colorante fino a quando

o non si raggiunge la gradazione desiderata. Il colorante è SELETTIVO per

determinare strutture ed è usato a concentrazioni basse.

Regressiva, quando si inseriscono sezioni a lungo ad alta concentrazione

o e non selettive. Le sezioni si sovracolorano e con lavaggi il colorante viene

tolto fino ad avere il quadro cromatico desiderato.

Semplice, si basa su un solo colorante (mono o metacromato).

o Combinata, si usano due o più coloranti.

o Successive, se le colorazioni vengono fatte una alla volta.

 Simultanee, tutti i coloranti insieme.



Istomorfologiche, per individuare delle strutture/ tessuti rispetto ad

o altri.

Istochimiche, per individuare composizioni chimiche specifiche del

o tessuto.

COLORAZIONI ISTOLOGICHE

Ematossilina-Eosina, veloce e semplice. Può essere usata per qualsiasi

o tessuto e per discriminare fra nuclei e citoplasmi.

Tricomica di Masson, tre coloranti (ematossilina e uno verde luce/blu di

o metilene), di cui uno colora la matrice extracellulare dei tessuti connettivi

ed evidenzia le fibre collagene. Usata per discriminare le componenti

intracellulari rispetto alla matrice.

COLORAZIONE CITOLOGICA

May-G-Giemsa o Giemsa e Wright, per gli strisci di sangue o tessuti

o solidi, evidenziano granulociti.

Impregnazione argentica, per identificare le cellule nervose e le fibre

o reticolari difficili da mettere in evidenza.

Reazione di PAS, per evidenziare i carboidrati nelle cellule e nei tessuti

o (glicogeno, glicoproteine, amido, cellulosa e polisaccaridi).

Reazione di FEULGEN, per colorare in modo specifico il DNA.

o Ancian Blu (AB), associata ad altre colorazioni, mette in evidenza

o componenti acidi della matrice extracellulare e alcune mucine.

MORFOLOGIA E BIOLOGIA CELLULARE (II MODULO)

Gli organismi pluricellulari sono costituiti da differenti tipi cellulari specializzati a

svolgere funzioni particolari. Le cellule eucariotiche e procariotiche hanno in comune

la membrana plasmatica.

INCLUSIONI E GRANULI CELLULARI

 Le inclusioni sono strutture/depositi (metaboliti che si accumulano o composti

transitori) citoplasmatici non presenti in tutte le cellule. Sono mobili e con una

scarsa attività metabolica.

GOCCIOLE LIPIDICHE, insieme di molecole lipidiche contornato da uno

 strato fosfolipidico e proteine legate ad esso. Sono presenti negli adipociti

(cellule del tessuto adiposo bianco, che spingono il nucleo nella periferia),

ma anche nelle cellule della corteccia surrenale e negli epatociti.

GLICOGENO, carboidrato complesso, riserva più importante di glucosio

 degli animali. Si trova negli epatociti, nelle cellule muscolari, scheletriche

e cardiache.

PIGMENTI. Si ha la MELANINA, nei melanociti e cheranociti, responsabile

 del colore della pelle, dei capelli, dei peli e degli occhi. C’è la

LIPOFUSCINA, nei vacuoli, nei neuroni e nei cardiomiociti, un miscuglio

complesso di sostanze che derivano dall’attività lisosomiale, nella

digestione della cellula. Ed infine, l’EMOSIDERINA, negli epatociti e nei

macrofagi, complesso di ferritina.

CITOSCHELETRO

 Complesso dinamico di strutture sottili e relativamente lunghe che si trova nel

citoplasma delle cellule eucariotiche. Sostiene strutturalmente la cellula

stabilizzandone la forma e permette vari tipi di movimenti cellulari. E’ formato

da proteine con proprietà meccaniche.

MICROTUBULI, formati da una singola struttura tubica di 13

 protofilamenti. Alcuni sono costituiti da doppietti (assonemi di ciglia e

flagelli) o triplette (corpi basali di ciglia, flagelli e centrioli). Essi

presentano due estremità, una NEGATIVA (α tubulina) ed una POSITIVA (β

tubulina). I dimeri di tubulina possono essere aggiunti o rimossi da

entrambe le estremità con un processo che allunga o accorcia il

microtubulo e viene definito TREADMILLING. Tale assemblaggio avviene

più rapidamente all’estremità positiva. I movimenti di organuli e

vescicole dentro il citoplasma avvengono grazie a proteine motrici: la

CHINESINA (verso l’estremità -) e la DINEINA (verso l’estremità +).

CENTRI ORGANIZZATORI DEI MICROTUBULI (MTOC).

Le cellule controllano l’assemblaggio dei microtubuli mediante tale

centro, che agisce nucleando i microtubuli e determinandone la posizione

e l’orientamento. Il principale MTOC delle cellule animali è il

CENTROSOMA, formato da una coppia di centrioli immersi in una matrice

pericentriolare.

ORIENTAMENTO DEI MICROTUBULI E FORMA DELLA CELLULA.

Sono organizzati in base alla loro polarità.

CELLULE EPITELIALI, in modo parallelo.

 CELLULA NERVOSA, in un assone nella stessa direzione.

 ERITROCITA UMANO MATURO, non ha nucleo e MTOC. Hanno

 polarità mista e sono disposti in bande circolari alla periferia.

FIBROBLASTO, con estremità negative centralmente e quelle

 positive in periferia.

ORGANULI MICROTUBULARI: CIGLIA e FLAGELLI.

Molte cellule eucariotiche presentano evaginazioni citoplasmatiche

distinguibili in ciglia e flagelli (+ lunghi). Possono avere il ruolo di spinta o

trazione della cellula. Il loro asse, detto assonema, presenta