Morfologia, embriologia e biologia cellulare

Morfologia (I modulo)

Il termine morfologia deriva dal greco e vuol dire forma. Fu coniato da Goethe nel 1785 per indicare l’anatomia comparata e la descrizione delle forme. È una branca della biologia che studia la forma e la struttura degli esseri viventi.

Quando si parla di morfologia esterna, ci si riferisce alla descrizione della forma esterna dell’organismo e ai rapporti di posizione delle varie parti o di organi visibili esternamente; quando invece si parla di morfologia interna, ci si riferisce all’indagine sulla struttura interna visibile ad occhio nudo (anatomia macroscopica) o al microscopio (anatomia microscopica).

La morfologia che si occupa delle cellule prende il nome di citologia, quella che studia i tessuti si chiama istologia, mentre quella che tratta le trasformazioni delle forme durante lo sviluppo è l’embriologia.

Lo studio morfologico può essere di tipo descrittivo, se fornisce la descrizione delle strutture di un organismo; comparato, se paragona le strutture nei diversi organismi; morfogenesi sperimentale, se studia i processi della morfogenesi (insorgenza e differenziamento della forma) e i meccanismi o fattori che la influenzano.

Oltre ad avere diversità morfologiche nelle cellule, nei tessuti e negli organi di una stessa specie, si riscontrano diversità in specie diverse. Esempio tipico è il cuore, che è diverso nei diversi animali. Le differenze di struttura del cuore si riflettono sull’apparato cardiocircolatorio e sul tipo di circolazione. Inoltre, nei vertebrati il sangue non bagna i tessuti ma rilascia CO2 e O2 per diffusione.

Studio microscopico

Per uno studio microscopico è necessario seguire tre parametri fondamentali: ingrandimento (rapporto fra la dimensione dell’immagine al microscopio rispetto a quella reale), contrasto e risoluzione (fa emergere dettagli e nitidezza ed è la distanza minima che deve esserci tra due punti, affinché questi siano percepiti separati). Quest’ultima dipende dall’equazione di Abbe, in cui λ è la lunghezza d’onda o il fascio di elettroni, n l’indice di rifrazione mentre α è l’apertura angolare. La miglior lente teorica dovrebbe essere di 90°, mentre quella reale è di 70°.

I microscopi possono essere di tipo ottico o elettronico. I microscopi ottici funzionano con raggi luminosi proiettati alla retina di chi guarda e utilizzano lenti di ingrandimento. Questi hanno raggiunto il top delle qualità, il futuro in questo campo sarebbe solo collegare delle videocamere, a loro volta collegate a dei PC così da filmare i processi ed osservarli senza l’operatore e di aumentare la qualità dell’immagine.

• In campo chiaro. Il campione è attraversato direttamente dalla luce, appare chiaro su sfondo chiaro.
• In campo scuro. La luce viene proiettata sul campione con un angolo non diretto ed il campione riflette la luce raccolta dal condensatore, apparendo chiaro su fondo scuro.
• A contrasto di fase. Ha un sistema di lenti tali da produrre immagini di campioni trasparenti, osservabili grazie alle diverse densità dei campioni e dunque, alla presenza di zone più chiare e zone più scure. A contrasto di fase interdifferenziale (è più sensibile, in quanto possiede un sistema di polarizzazione, prisma di Wollaston e un analizzatore. Ciò divide il fascio di luce in 2 raggi che seguono diverse direzioni. Dopo aver attraversato il campione, essi vengono ricombinati, ma non allo stesso modo, e aumenta la risoluzione).
• A fluorescenza. Usa la monocromatica per stimolare il fenomeno naturale (o autofluorescenza, prodotta da sostanze presenti nel tessuto) o artificiale (con i fluorocromi) della fluorescenza (capacità di alcune molecole di assorbire la luce ad una λ ed emetterla ad una λ maggiore) presentato dal campione. Viene utilizzato per sapere come sono distribuite le strutture all’interno delle cellule.
• A epifluorescenza. In esso, la luce viene mandata dall’alto sullo specchio rispetto al campione basso.
• A fluorescenza confocale. In cui, la luce che proviene da un laser passa attraverso il campione che emette la luce fluorescente. Questa passa poi all’apertura confocale prima di arrivare al rilevatore. Tale sistema considera un solo piano di fuoco ed esclude gli altri.
• A luce polarizzata. Ha un filtro polarizzato, con il quale si evidenziano le strutture ordinate (cristalline) che danno il fenomeno della birifrangenza.
• Ottico composto. Ingrandisce l’immagine attraverso passaggi successivi, passando attraverso più lenti che ingrandiscono le immagini volta per volta.

Composizione

Parte meccanica o stativo. Questa comprende la base (pesante per minimizzare le vibrazioni), la sorgente d’illuminazione (proietta la luce verso l’alto) e il braccio, a cui sono attaccati il vetrino portaoggetti con sistema di pinze, manopole per spostare il vetrino e manopole per spostare il vetrino portaoggetti (monometrica, per mettere a fuoco e micrometrica, per piccoli aggiustamenti).

Parte ottica o sistema di lenti. È la parte più importante e comprende il condensatore (che raccoglie ed indirizza verso il campione la luce, attraverso un diaframma con apertura che regola la quantità di luce), l’obiettivo (ogni microscopio lo possiede con diverse capacità di ingrandimento ed è posto su un revolver con possibilità di ingrandimento. Più è corto, maggiore sarà l’ingrandimento) e l’oculare (che a sua volta ingrandisce l’immagine nuovamente).

Il prodotto dell’immagine vista è il prodotto fra oculare e obiettivo.

Microscopi elettronici

I microscopi elettronici, invece, sono utili per analizzare le strutture subcellulari e vengono usati in ambienti in cui è stato creato il vuoto, poiché se ci fosse l’aria gli elettroni sarebbero dispersi.

• TEM (a trasmissione). Viene utilizzato per sezioni molto sottili dei tessuti. È formato da un cannone elettronico che consiste in un filamento metallico portato ad incandescenza grazie ad una corrente elettrica di 50/100 K. Presenta un tubo elettronico con un catodo all’apice, che trasmette elettroni attratti dall’anodo. Vi sono una serie di lenti che fungono da condensatore ed indirizzano, dunque, il fascio sul campione, il quale è precedentemente fissato e colorato con sali di metalli pesanti. Le lenti sono bobine elettromagnetiche capaci di creare un campo elettromagnetico variabile, che fa focalizzare sul campione gli elettroni, che lo colpiscono passando attraverso lenti intermedie e poi raggiungendo il rilevatore per avere un’immagine. Viene effettuata poi una fotografia.
• SEM (a scansione). È molto più piccolo del TEM ma fornisce immagini 3D, un’ampia gamma di informazione su morfologia, composizione e struttura e presenta comunque il tubo elettronico, in cui passano gli elettroni. Quando questi arrivano sul campione (precedentemente preparato, fissato, disidratato e dorato), si ha un’emissione di elettroni secondari, catturata dal rilevatore che ha un oscillatore che emette fotoni quando viene eccitato dagli elettroni che lo colpiscono. I fotoni generano un’immagine visibile dai monitor.
• A forza atomica. È un SEM potentissimo di sonda, in grado di fornire un’ottima risoluzione a livello di molecole e atomi. È possibile osservare i campioni biologici prima di fissarli e trattarli.

Preparazione dei campioni (procedimento istologico)

1. Dissezione/prelievo, per studiare la morfologia (anatomia interna), per l’analisi istologica di organi e tessuti, per rinvenire parassiti negli organi, per definire la condizione riproduttiva ed espiantare materiale utile per trapianto o colture cellulari.

Procedura ed attrezzatura

• Preparare gli strumenti necessari, quali bisturi, pinze, pinzette, forbici, aghi manicati, sonde ed eventualmente stereomicroscopio.
• Orientare correttamente l’animale poiché il cordone nervoso è posizionato diversamente.
• Invertebrati (iponervi) vengono dissezionati sulla superficie dorsale, in quanto hanno il cordone nella zona ventrale, bisogna aprirlo dalla parte opposta.
• Vertebrati (epinervi) vengono dissezionati sulla superficie ventrale, poiché hanno il cordone dorsalmente.
• Taglio non troppo profondo e per non danneggiare gli organi bisogna rivolgere sempre la punta verso l’alto.

2. Fissazione (cruciale), immergendo il campione in una soluzione liquida così da stabilizzarlo e per impedire che vada incontro ad autolisi post-mortem per mezzo di una autodigestione degli enzimi contenuti nelle cellule o che i tessuti si degradino a causa di agenti esterni. Inoltre, in questo modo si protegge il campione dallo stress delle fasi successive.

Metodi di fissazione

• Fisici, utilizzando alte e basse temperature con N liquido, isopentano ecco in modo veloce.
• Chimici, utilizzando sostanze e miscele di sostanze (fissativi 1:10) nelle quali si va ad immergere il campione per un tempo variabile o perfusione, inserendo il fissativo nel torrente circolatorio dell’animale.

Principali fissativi

• Aldeidi (formaldeide/formalina o gluteraldeide).
• Alcoli (etanolo).
• Acidi organici e minerali (acido acetico, tricloroacetico, pirico, cianico).
• Sali di metalli pesanti (bicromato di potassio, cloruro di mercurio).

Miscele di fissazione

• Liquido di Bouin, miscela di soluzione satura di acido pirico, acetico e formalina, indicato per pezzi voluminosi.
• Liquido di Carnoy, miscela di etanolo, cloroformio ed acido acetico, per fissare cellule isolate.

3. Inclusione, si ottiene un blocchetto in paraffina (miscela di idrocarburi saturi non miscibili in acqua) all’interno del quale c’è il campione, che permette il taglio in fette sottili.

Fasi

• Disidratazione in solventi organici (etanolo) a gradazione crescente (70-80-90-100).
• Chiarificazione nello xilolo, che riesce a miscelarsi sia con il campione che con la paraffina.
• Inserimento del pezzo nella paraffina fusa ed a causa del calore fuoriesce lo xilolo ed entra la paraffina. Una volta solidificato, al pezzo può essere aggiunto un sostegno che funga da base di aggancio al microtomo.

Se i pezzi non devono essere visti al MO ma al TEM, l’inclusione viene fatta con resine epossidiche, più dure e che permettono di tagliare fette più sottili.

4. Taglio (microtomia), per ottenere sezioni sottili utilizzando il microtomo.

Microtomo rotativo

• Portapezzo, dove si aggancia il blocchetto. Viene mosso di una quantità di µm impostata ogni volta che si va ad agitare il volano in senso orario.
• Portalama, dove è inserita la lama monouso, molto tagliente. Questa taglia le fettine ogni volta che avviene una rotazione e poi quest’ultime vengono raccolte con dei pennelli, messe a bagnomaria per distendere il tessuto all’interno di esse e poi una volta raccolte su un vetrino portaoggetti, fatte asciugare per permettere un’adesione migliore. I vetrini si conservano a -80°C fino a quando non avverrà la colorazione.
• Volano.

Ultramicrotomo

Serve per tagliare campioni inclusi in resine epossidiche destinate al TEM. Ha gli stessi elementi del microtomo (+ un binoculare poiché i pezzi sono molto piccoli) ma il materiale è diverso.

• Acciaio (microtomo e miostato).
• Vetro o diamante (ultramicrotomo).

5. Colorazioni, per colorare i campioni che per lo più sono trasparenti ed aumentare il contrasto dei componenti della cellula e dei tessuti, per identificarli meglio al microscopio. Viene scelta in base a ciò che interessa osservare, alterandolo il meno possibile. Di solito vengono usate polveri e soluzioni.

Classificazione

• Acquosi.
• A base alcolica.
• Vitali (utili su cellule vive che li assorbono, accumulandoli nelle strutture affini): Tripanblu (per studiare la fagocitosi dei macrofagi), Verde Gianus (per individuare i mitocondri), Blu di metilene (per le cellule nervose).
• Non vitali (usati nei campioni fissati, ma non vivi).
• Naturali (hanno origine nel mondo animale e vegetale).
• Artificiali (sono sintetici).
• Acidi (COOH, si deprotonerà e legherà cariche +, sostanza acidofila).
• Basici (NH2, si protonerà e legherà cariche -, sostanza basofila).
• Neutri (posseggono entrambi i gruppi).

Tipi di colorazione

• Diretta, quando il colorante agisce direttamente senza che ci sia stati dei trattamenti preventivi di preparazione.
• Indiretta, quando prima di immergere nel colorante si devono fare dei trattamenti con sostanze mordenti per far acquisire al tessuto la capacità di assorbire il colore.
• Progressiva, quando si inseriscono le sezioni nel colorante fino a quando non si raggiunge la gradazione desiderata. Il colorante è selettivo per determinare strutture ed è usato a concentrazioni basse.
• Regressiva, quando si inseriscono sezioni a lungo ad alta concentrazione e non selettive. Le sezioni si sovracolorano e con lavaggi il colorante viene tolto fino ad avere il quadro cromatico desiderato.
• Semplice, si basa su un solo colorante (mono o metacromato).
• Combinata, si usano due o più coloranti.
• Successive, se le colorazioni vengono fatte una alla volta.
• Simultanee, tutti i coloranti insieme.
• Istomorfologiche, per individuare delle strutture/tessuti rispetto ad altri.
• Istochimiche, per individuare composizioni chimiche specifiche del tessuto.

Colorazioni istologiche

• Ematossilina-eosina, veloce e semplice. Può essere usata per qualsiasi tessuto e per discriminare fra nuclei e citoplasmi.
• Tricromica di Masson, tre coloranti (ematossilina e uno verde luce/blu di metilene), di cui uno colora la matrice extracellulare dei tessuti connettivi ed evidenzia le fibre collagene. Usata per discriminare le componenti intracellulari rispetto alla matrice.

Colorazione citologica

• May-G-Giemsa o Giemsa e Wright, per gli strisci di sangue o tessuti solidi, evidenziano granulociti.
• Impregnazione argentica, per identificare le cellule nervose e le fibre reticolari difficili da mettere in evidenza.
• Reazione di PAS, per evidenziare i carboidrati nelle cellule e nei tessuti (glicogeno, glicoproteine, amido, cellulosa e polisaccaridi).
• Reazione di Feulgen, per colorare in modo specifico il DNA.
• Ancian Blu (AB), associata ad altre colorazioni, mette in evidenza componenti acidi della matrice extracellulare e alcune mucine.

Morfologia e biologia cellulare (II modulo)

Gli organismi pluricellulari sono costituiti da differenti tipi cellulari specializzati a svolgere funzioni particolari. Le cellule eucariotiche e procariotiche hanno in comune la membrana plasmatica.

Inclusioni e granuli cellulari

Le inclusioni sono strutture/depositi (metaboliti che si accumulano o composti transitori) citoplasmatici non presenti in tutte le cellule. Sono mobili e con una scarsa attività metabolica.

• Goccioline lipidiche, insieme di molecole lipidiche contornato da uno strato fosfolipidico e proteine legate ad esso. Sono presenti negli adipociti (cellule del tessuto adiposo bianco, che spingono il nucleo nella periferia), ma anche nelle cellule della corteccia surrenale e negli epatociti.
• Glicogeno, carboidrato complesso, riserva più importante di glucosio degli animali. Si trova negli epatociti, nelle cellule muscolari, scheletriche e cardiache.
• Pigmenti. Si ha la melanina, nei melanociti e cheratinociti, responsabile del colore della pelle, dei capelli, dei peli e degli occhi. C’è la lipofuscina, nei vacuoli, nei neuroni e nei cardiomiociti, un miscuglio complesso di sostanze che derivano dall’attività lisosomiale, nella digestione della cellula. Ed infine, l’emosiderina, negli epatociti e nei macrofagi, complesso di ferritina.

Citoscheletro

Complesso dinamico di strutture sottili e relativamente lunghe che si trova nel citoplasma delle cellule eucariotiche. Sostiene strutturalmente la cellula stabilizzandone la forma e permette vari tipi di movimenti cellulari. È formato da proteine con proprietà meccaniche.

• Microtubuli, formati da una singola struttura tubica di 13 protofilamenti. Alcuni sono costituiti da doppietti (assonemi di ciglia e flagelli) o triplette (corpi basali di ciglia, flagelli e centrioli). Essi presentano due estremità, una negativa (α tubulina) ed una positiva (β tubulina). I dimeri di tubulina possono essere aggiunti o rimossi da entrambe le estremità con un processo che allunga o accorcia il microtubulo e viene definito treadmilling. Tale assemblaggio avviene più rapidamente all’estremità positiva. I movimenti di organuli e vescicole dentro il citoplasma avvengono grazie a proteine motrici: la chinesina (verso l’estremità -) e la dineina (verso l’estremità +).

Centri organizzatori dei microtubuli (MTOC)

Le cellule controllano l’assemblaggio dei microtubuli mediante tale centro, che agisce nucleando i microtubuli e determinandone la posizione e l’orientamento. Il principale MTOC delle cellule animali è il centrosoma, formato da una coppia di centrioli immersi in una matrice pericentriolare.

Orientamento dei microtubuli e forma della cellula

Sono organizzati in base alla loro polarità.

• Cellule epiteliali, in modo parallelo.
• Cellula nervosa, in un assone nella stessa direzione.
• Eritrocita umano maturo, non ha nucleo e MTOC. Hanno polarità mista e sono disposti in bande circolari alla periferia.
• Fibroblasto, con estremità negative centralmente e quelle positive in periferia.

Organuli microtubulari: ciglia e flagelli

Molte cellule eucariotiche presentano evaginazioni citoplasmatiche distinguibili in ciglia e flagelli (+ lunghi). Possono avere il ruolo di spinta o trazione della cellula. Il loro asse, detto assonema, presenta