Modulo di Microbiologia

MICRORGANISMI CELLULARI PROCARIOTI (sono distinti in due gruppi

• separati)

⇢

1900 cause di morte più comuni = malattie

• !

infettive L’analisi filogenetica (RNA ribosomiale) ha

⇢

2000 cause di more più comuni = altre

• portato a suddividere gli organismi viventi

cause (malattie infett quasi scomparse tra le (cellulari) in tre gruppi evolutivi diversi detti

cause di morte) DOMINI degli organismi cellulari:

↳ questo è dovuto a scoperte microbiologiche: 1. Bacteria(Batteri) Procarioti

#

prevenzione, trattamento, cura; e a trattamenti 2. Archaea(Archea)

farmacologici (pennicillina = 1º farmaco 3. Eukarya(Eucarioti) Eucarioti

#

scoperto da Fleming nel 1929) ANTIBIOTICI.

!

! => non sono compresi gli organismi non

cellulari come i virus, che hanno un'altra

MALATTIE INFETTIVE: dovute a VIRUS e

" classificazione filogenetica.

BATTERI. Le malattie infettive rimaste nel 2000 !

sono solo di natura virale (AIDS e polmoniti/ 1) BACTERIA (Batteri)

influenze) Enorme varietà di specie e ambienti

#

=> l'uso d antibiotici ha portato a un colonizzati

ridimensionamento dell'incidenza dll infezioni Comprendono specie patogene

#

batteriche, ma NON di quelle virali. cellula procariote

•

L'incidenza dll infez virali è ridimensionata monocellulari (sempre!)

•

invece dall'uso dei vaccini. => VIRUS ≠ chemiotrofi; fototrofi (tipi di metabolismo)

•

BATTERI

! peptidoglicano (NB: è esclusivo dei batteri

• come costituente della parete)

Classificazione degli organismi viventi:

" riproduzione asessuata

•

tentativo di determinare un ordine nella ⇢

[“sensibili”agli antibiotici] non è una

•

diversità delle varie forme di vita identificando caratteristica strutturale, naturale dei

gruppi di individui accomunati da relazioni di batteri. Le stesse molecole

affinità. sonominfattiminutili anche in Archea.

↓ solo ambientali:

$Specie

⇢

Whittaker, 1951 Classificazione a 5 REGNI: apatogene solfobatteri, cianobatteri, ecc.

tiene conto dei microrganismi cellulari ambientali, occasionalmente patogene;

$Specie

BATTERI-Monera, Piante, PROTOZOI-Protisti, colera ecc.

FUNGHI MONOCELLULARI (non sono cellula patogene a trasmissione interumana:

$Specie

vegetali e sono eterotrofi!) -Funghi, Animali.

! difterite, meningococco, treponemi, ecc

!

Analisi filogenetica = Interpretazione in chiave

" 2) ARCHAEA

evolutiva delle relazioni tra organismi, Enorme varietà di specie e ambienti

#

individuate mediante grado di identità delle colonizzati Batteri “ambientali”, non patogeni

sequenze di acidi nucleici Gli individui sono

! cellula procariote

•

legati dal grado di “somiglianza” nucleotidica. monocellulari

•

- Woese (anni ’70): Analisi filogenetica degli chemiotrofi

•

organismi viventi mediante confronto delle parete proteica (no peptidoglicano)

•

sequenze di RNA ribosomiale: ha confrontato riproduzione asessuata

•

queste sequenze x creare degli alberi [insensibili agli antibiotici]

•

filogenetici. Tre gruppi principali che spesso sono

$

L’analisi dell’RNA ribosomiale ha evidenziato 3 “estremofili”:

linee evolutive (non 2): 1. ipertermofili: alte T (Pyrolobus: 90°C –

EUCARIOTI A (sono procarioti ma hanno

• 113°C)

somiglianze con gli euacrioti => si

staccano dai procarioti)

EUCARIOTI B

• 1

MICRORGANISMI ACELLULARI

2. alofili estremi: riproduzione in ambienti

ad alta conc di sale (Halobacterium: Presentano un piano organizzativo

15% -32%) subcellulare:

3. metanogeni: produttori di gas metano aggregati molecolari (virus)

•

- Questi gruppi viono/si riproducono solo in singole molecole (viroidi, prioni)

•

questi ambienti/condizioni estreme. Gruppo eterogeneo che include numerose e

- Termofili/ipertermofili sono spesso utili alle diversissime forme di organismi viventi (o non

biotecnologie: viventi):

⇢

Thermus aquaticus (Bacteria) Taq DNA

• •organismi cellulari (in genere monocellulari)

⇢

polimerasi PCR; •particelle acellulari, infettive e patogene

⇢

Pyrococcus furiosus (Archea) Pfu (vent)

• •molecole infettive e patogene

⇢

DNA polimerasi (High fidelity pol.) PCR ad Non hanno capacità di vita autonoma: sono

alta fedeltà. tutti parassiti e patogeni => si riproducono a

! spese della cellula ospite:

3) EUKARYA (Eucarioti) A. VIRUS = aggregati proteici con acido

cellula eucariote nucleico; varie malattie infettive (virali);

• monocellulari; pluricellulari B. VIROIDI = piccole molecole di RNA patogene

• eterotrofi; fototrofi per le piante;

• parete derivata da glucosio che si C. PRIONI = particelle proteiche infettive

• distingue x le varie specie (chitina, trasmissibili in animali, compreso l’uomo;

cellulosa); oppure privi di parete (mai encefalopatie spongiformi (TSE), kuru,

peptidoglicano) sindrome di Creutzfeldt-Jacob, BSE, mucca

riproduzione asessuata e sessuata pazza.

•

Microrganismi eucarioti: NB: per microrganismi si intendono prettamente

A. Funghi organismi unicellulari.

- monocellulari = lieviti ⇢

Microrganismi !-organismi = tutti gli

- pluricellulari = muffe; funghi fruttiferi organismi microscopici (e submicroscopici)

- eterotrofi visibili solo al microscopio (ottico e/o

- parete di chitina elettronico). Si tratta di organismi aventi

- riproduzione asessuata e sessuata; dimensioni dell’ordine di grandezza dei micron

spore (o meno) micron (!)= micrometro (!m).

Alcuni funghi sono utili (e utilizzati):

% Protozoi > 10 !m

•

Saccharomyces cerevisiae (lievito di

• Funghi 8 -10 !m

•

birra) Batteri 0,5 –4 !m

•

Aspergillus niger: ac. citrico

• Virus 20 –350 nm (< 0,5 !m). Quelli che

•

Penicillium: penicillina

• interessano l'uomo sono di ~ 200-250 nm.

Alcuni funghi causano patologie (micosi):

% STRUTTURA: - acellulari - procarioti - eucarioti

!

•Candida

B. Protozoi Cellula PROCARIOTICA Cellula EUCARIOTICA

- monocellulari Parete Parete (funghi, alghe,

- eterotrofi piante)

- privi di parete

- riproduzione asessuata e sessuata Membrana cellulare Membrana cellulare

I Protozoi sono normalmente ambientali

% •Paramecium Ribosomi Ribosomi

Alcuni sono patogeni

% DNA (aploide) DNA (diploide)

•Ameba

•Plasmodium RNA RNA

•Toxoplasma

•Trypanosoma 2

cellula x ambiente

•

Cellula PROCARIOTICA Cellula EUCARIOTICA strutture cellulari (flagelli, parete, spora...)

•

!

Nucleoide (senza Nucleo (con involucro !

involucro nucleare) nucleare) Eccezioni alla regola:

Non ha mitocondri Organelli citoplasmatici A. Microscopio in campo chiaro/scuro che

che svolgono la (mitocondri, consente di ingrandire l’immagine di

respirazione cellulare cloroplasti, lisosomi, elementi in genere poco contrastati;

(se la svolge, avviene ecc) B. Campioni naturalmente contrastati.

tramite la membrana La tecnica di colorazione può consentire di

cellulare) vedere la forma della cellula e le sue strutt

=> analizzare/ classificare/diagnosticare a

Priva di tutte le Possiede tutte le seconda dll scopo.

strutture membranose strutture membranose Colorazioni:

interne. Non ha un interne come RE, Golgi 1. coloranti “ISTOLOGICI” = soluzioni contenenti

involucro nucleare etc.

! pigmenti;

2. molecole CROMOGENE/FLUORESCENTI legate

MORFOLOGIA = Studio della FORMA del a sonde specifiche (anticorpi, acidi nucleici):

microrganismo Osservazione dei l,legame anticorpo-proteina è altamente

microrganismi con adatti strumenti (NON sono specifico e permette di individuare una

osservabili ad occhio nudo a cusa delle loro particolare molecola/sostanza/organello

caratteristiche chimico-fisiche). cellulare.

1. Composizione chimica: le cellule sono A) Coloranti BASICI

composte principalmente da acqua (~ 80% - carica positiva

in peso) => scarsamente contrastate: manca ⇢

- colorano strutture acide (basofile)

il contrasto tra l'oggetto e lo sfondo (si membrane, cromatina (es. cristal violetto,

⇢

vede ttt trasparente) sono visibili solo le blu di metilene, safranina, fucsina basica);

cellule colorate naturalmente => B) Coloranti ACIDI:

naturalmente contrastate. - carica negativa

⇢

2. Dimensioni microrganismi ordini di ⇢

- colorano strutture basiche (acidofile)

grandezza: proteine citoplasmatiche (eosina, fucsina

Virus: nm (^-9) acida, Rosso Congo).

• !

Cellule: (^-6)

• μm

=> hanno dimensioni inferiori al potere COLORAZIONE ISTOLOGICA = applicazione di

risolutivo umano (l'occhio umano visualizza da uno/più coloranti tradizionali al campione

0.1 mm in poi: può distinguere oggetti a fissato

!

distanze > 0.1 mm.

=> Problema: i microrganismi non si vedono a A) Colorazioni semplice: un solo colorante

occhio nudo per: 1. APPLICAZIONE campione su vetrino

1. assenza di contrasto 2. ESSICCAZIONE

2. ridotte dimensioni 3. FISSAZINE (implica sempre la morte del

=> Soluzione: si devono ingrandire e rendere campione!)

contrastati: •fisica (calore)

1. colorazioni •chimica (solvente organico)

2. microscopio 4. APPLICAZIONE del colorante (fase di

NB: ingrandire non basta! Normalmente è

& colorazione vera e propria)

necessario contrastare il campione 5. OSSERVAZIONE al microscopio ottico

COLORAZIONE = tecnica di applicazione di =>Tutti i microrganismi presenti sul vetrino

una/più sostanze coloranti in grado quindi di appaiono colorati allo stesso modo e si vede

creare contrasto solo la forma. 3

NB: la colorazione istologica consente solo la II. Decolorazione con alcool + acido

visione di campioni fissati = morti. III. 2ª applicazione: colorante blu basico

! di metilene

B) Colorazioni differenziale/specifica: diversi In base al risultato finale si definiscono:

coloranti in successione che colorano batteri rossi = acido-resistenti &

•

selettivamente diversi tipi di cellule presenti rispondono positivamente alla colorazione

nel campione (si usano determinati coloranti batteri blu = non acido-resistenti.

•

in u ordine specifico). NB: Colorazione semplice e colorazione

1. Colorazione di GRAM : Consente di differenziale:

evidenziare due diversi tipi strutturali di A. colorazione SEMPLICE: ⇢

batteri: Meningococco e Pneumococco

•

a) G r a m p o s i t i v i = b a t t e r i b l u diplococchi

(rispondono positivamente alla B. colorazione DIFFERENZIALE (Gram):

colorazione) ⇢

Meningococcococchi Gram negativi

•

b) Gram negativi negativi = batteri rossi (rosso)

NB: se non rispondono alla colorazione non ⇢

Pneumococcococchi Gram positivi (blu)

•

!

si possono definire nè positivi nè negativi!

FASI principali: 3. Colorazione VITALE ISTOLOGICA:

Preparazione campione e fissazione (=>

• coloranti non tossici

•

morte del campione, è istologica) osservazione campione fresco (vivo)

•

Colorazione mediante applicazione in

• distinzione tra cellule morte e vive (x vedere

•

successione di 2 diversi coloranti basici: ad es l'effetto tossico di certe sostanze)

I. Applicazione del 1º colorante = Rosso Neutro: Assunto attivamente dalle

Colorante basico blu (es. Cristal cellule vive => colorazione delle cellule vive,

violetto Violetto di genziana) ma non delle morte.

!

II. Utilizzo di un mordenzante: si ha la !

fissazione e le cellule rimangono tutte

blu (soluzione iodio/KI) OSSERVAZIONE MICROSCOPICA dei

III. Decolorazione (alcool/acetone o microrganismi : Analisi dei microrganismi

entrambi) => In questa fase si osserva mediante l’uso di strumenti che permettono di

che alcuni batteri rimangono colorati di ingrandire l’immagine del preparato, dal

blu, altri si decolorano momento che l'occhio umano ha il suo potere

IV. Applicazione del 2º colorante = risolutivo (ha una certa capacità di ingrandire

Colorante rosso (basico) (Safranina l'immagine dll oggetto osservato).

Fucsina) => i batteri cha hanno I sistemi di ingrandimento utilizzati sono

mantenuto la colorazione blu dopo la principalmente i microscopi ottici ed

decolorazione, rimangono colorati di elettronici.

blu. Si colorano di rosso solo i batteri !

che si erano decolorati (trasparenti). A. OTTICO: usato in microbiologia tradizionale

Queste colorazioni dipendono dal tipo di Sorgente luminosa = luce visibile

•

parete e alla fine nello stesso vetrino si Sistema di ingrandimento = lenti di vetro

•

vedono batteri blu e rossi che hanno parete Ingrandimenti max. = 1000 x

•

differente.

! Risoluzione = 0,2 !m

•

Sistemi di lenti = 2oculari (ingrandimento fisso

2. Colorazione di Ziehl Neelsen/di ACIDO = 10 x) + obiettivi (ingrandimento che varia

RESISTENZA: Colorazione differenziale da 50 a 100 x). => Ingrandimento finale =

Selettiva per batteri acido resistenti prodotto dell’ingrandimento delle singole lenti

(micobatteri) (Es. obiettivo 40X e oculare 10X = 400X).

I. 1ª applicazione: colorante basico rosso !

(Fucsina basica) B. ELETTRONICO: 4

Sorgente luminosa = fascio di elettroni raggi che attraversano strutture cellulari:

• •

Sistema di ingrandimento= magneti = ritardati

• Ingrandimenti: 100.000 X (SEM) e 1.000.000 raggi diretti

• •

X (TEM) => si crea un gioco di ombre: si cede il

Risoluzione: 0,2 nm campione vivo, non fissato, ma in bianco e

•

! nero “Sfumature di grigio”, colorazione

&

! non necessaria osservazione delle colture

&

A. Alcuni tipi di microscopio OTTICO cellulari.

1) in campo chiaro sfasamento delle = contrasto naturale

• λ

!

2) in campo oscuro

3) a contrasto di fase NB: Microscopi in campo scuro e a contrasto

4) a fluorescenza ⇢

di fase osservazione di:

! Campioni non colorabili agevolmente

•

1) Microscopio in CAMPO CHIARO Campioni freschi e vitali

•

=“classico”. Analisi immediata

•

Osservazione diretta del preparato. Mobilità dei batteri

• !

La luce bianca incidente attraversa sia il

• campione che lo sfondo => se non c'è un 4) Microscopio a FLUORESCENZA

contrasto naturale non vedo il campione Fenomeno della FLUORESCENZA = Analisi

$

⇢

Sa l’oggetto che lo sfondo sono illuminati

• di microscopia ottica basata sull’uso di

Assenza di contrasto sostanze fluorescenti

Il campione deve essere colorato

• Coloranti fluorescenti (Flurocromi) =

$

(colorazione semplice/differenziale). La Sostanze che assorbono radiazione a una

colorazione serve a trasformare la luce data ed emettono a una superiore:

λ, λ

bianca incidente sul campione in luce ⇀

fluoresceina (FITC) gialla-verde

•

colorata ⇀

rodamina rossa

•

Campioni fissati (morti)

• ⇀

DAPI blu

•

Usato anche x la visione di campioni

• ⇀

acridina orange arancione

•

colorati naturalmente senza la colorazione ⇀

bromuro di etidio rossa-arancione

•

(batteri come cianobatteri -1batteri Sono molecole costituite da molte strutture

fotosintetici; e alghe unicellulari -hanno ad anelli aromatici.

!

forme molto simmetriche e vengono colorati

sui cloroplasti). È un microscopio ottico con sorgente

•

! luminosa a bassa (raggio UV)

λ

2) Microscopio in CAMPO SCURO: sfrutta un NB: il raggio UV incide sul preparato ma poi

sistema di specchi che riflette la luce è bloccato da un filtro di sbarramento =>

La luce incidente colpisce il campione ma

• non attraversa l’obiettivo

non penetra nell’obiettivo Penetra nell’obiettivo solo la fluorescenza

•

Entra nell’obiettivo solo la luce riflessa

• (luce visibile) emessa dal campione marcato

(quella che si vede) con il fluorocromo.

Il vetrino appare buio perchè non

• ⇀ ⇀ ⇀

=> filtro di eccitazione campione

λA

attraversato da luce incidentr => risultato = ⇀

filtro di sbarramento λE.

campione illuminato su sfondo scuro: Se prendo una molecola ad anelli aromatici,

contrasto naturale si dice che il campione è colorato.

Colorazione non necessaria => si possono

• Se accendo una luce bianca, vedo il

$

vedere anche cellule non fissate, vive.

! campione bianco;

Se accendo i raggi UV, il campione si

$

3) Microscopio a CONTRASTO DI FASE (il più colora di fluorescente => si vede solo al

utilizzato): buio

La luce incidente attraversa il campione:

• 5

=> non vedo un campione colorato

istologicamente: se spengo i raggi UV non

vedo più il campione.

!

!

B. Microscopio ELETTRONICO:

1. a scansione (SEM) campione intero

#

2. a t r a s m i s s i o n e ( T E M ) c a m p i o n e

#

sezionato ⇀

Raggio incidente = fascio di elettroni

⇀

campione schermo fluorescente/

fosforescente quella che vede l'operatore è

l'immagine in negativo sullo schermo.

Problematiche

A. Il fascio di elettroni può attraversare solo

materiale di spessore molto ridotto (pochi

nm) => il campione deve essere tagliato in

sezioni sottili mediante microtomi (TEM)

B. I tessuti biologici e le cellule sono però

normalmente molli prima del taglio => il

tessuto deve essere indurito.

INDURIMENTO:

Fissazione (glutaraldeide, OsO4)

• Inclusione (resina Epon, Araldite): si include

• del campione in una resina

Congelamento: poi però il campione deve

• essere mantenuto congelato x tutto il corso