Modulo di Microbiologia

DIFFUSIONE VALUTAZIONE

SU AGAR e

! Presenza di un basso numero di

$

ATTIVITÀ GENOTOSSICA

dell’ : microrganismi non patogeni

Capacità di una sostanza di indurre Uso di terreni liquidi (o agarizzati) per

$

mutazioni --> TEST di AMES: Determinazione controllo sterilità

dell'aumento della frequenza di reversione Tollerata e regolamentata presenza di

$

dopo il contatto con un possibile mutageno. basso numero di microrganismi non

1. Coltura di ceppo auxotrofo (His-): patogeni

compaiono spontaneamente revertanti con Stabiliti valori “soglia”per impedire un

$

frequenza tipica per il ceppo (terreno potenziale rischio e la degradazione

privo di istidina) microbiologica del prodotto

2. Mutageno: provoca mutazioni e comparsa Si determina la carica microbica per

$

di nuovi mutanti (indotti). Conseguenza: il valutare che sia:

numero complessivo di revertanti aumenta al di sotto del valore soglia

•

=> revertanti totali = spontanei + indotti stabile nel tempo

•

Ceppo indicatore = ceppo auxotrofo His- di Controllo quantitativo per il conteggio

$

Salmonella typhimurium totale dei microrganismi contaminanti

Ceppi di Salmonella revertanti spontanei Controllo qualitativo per la ricerca di

$

(/10^ ) particolari microrganismi

8 NB: Per determinazione carica microbica nei

TA1535 20 farmaci non sterili si utilizzano metodiche

di CONTA VITALE --> N°microrganismi vivi/g

TA98 40 (mL)

=> Preparazione del campione Filtrazione

'

TA100 160 su membrana Conteggio delle colonie

' '

Terreno: privo di istidina --> NB: Crescono solo Calcolo

!

i batteri His+ (revertanti).

! 2) Farmaci obbligatoriamente sterili

Test di Ames mediante diffusione su agar (Preparazioni iniettabili e oftalmiche).

1. Trattamento della sostanza in esame con Assenza di microrganismi nella preparazione

$

enzimi epatici (per eventuale bioconversione) finale

2. Piastratura di Salmonella (108 cellule) su Uso di terreni liquidi (o agarizzati) in

$

agar His- metodiche di quantizzazione

3. Applicazione di filtri con sostanza sull’agar Assenza di microrganismi nella preparazione

$

4. Incubazione (48h, 37°C) finale: necessità di sterilizzazione durante il

5. Conteggio delle colonie di revertanti His+ e processo produttivo

confronto con il controllo

! 9

Test di sterilità: verifica della eventuale

presenza di batteri contaminanti mediante

valutazione della crescita batterica

TEST: prodotto + terreno di coltura

( crescita = prodotto non sterile

• nessuna crescita = prodotto sterile

•

Scelta del TIPO di TERRENO: terreni minimi

( o terreni con fattori di crescita (complessi)?

--> Si usano terreni con fattori di crescita o

terreni complessi per evitare falsi negativi

CONTROLLI PRELIMINARI al test di sterilità

( 1. STERILITÀ del terreno del test.

- Per evitare falsi positivi: torbidità

causata da contaminazioni.

- Incubazione di 7 giorni di aliquote del

terreno: (T.tioglicolato: 30-35°C;

T.idrolisato di caseina e soia: 20-25°C)

- Assenza totale di crescita => terreno

sterile (idoneo).

2. FERTILITÀ (PROPRIETÀ NUTRITIVE) del

terreno di test.

- Per evitare falsi negativi: assenza di

crescita dovuta ad incapacità del terreno

di sostenere crescita batterica.

- Si valuta la capacità del terreno di

permettere la crescita di ceppi indicatori.

3. PROPRIETÀ ANTIMICROBICHE del prodotto.

- Per evitare falsi negativi: assenza di

crescita dovuta a inibizione da parte del

prodotto.

- Incubazione di ceppi indicatori con e

senza prodotto: la crescita deve essere

comparabile.

- Questo è il punto critico nel test di

sterilità degli antibiotici. 10

NUTRIZIONE e METABOLISMO Classificazione dei microrganismi in TIPI

!

NUTRIZIONALI --> è basata su

Il metabolismo è il complesso delle reazioni A. FONTE DI CARBONIO: che tipo di

che avvengono nella cellula batterica: la cellula composti la cellula acquisisce per

è separata dall’ambiente esterno dalla parete, ottenere il carbonio. NB: Le molecole

ma riesce comunque a interagire con esso => contenenti C sono presenti in natura

il metabolismo è l’insieme dei processi con cui sottoforma di composti

i microrganismi assumono e utilizzano sostanze Inorganici (CO2)

•

dall’ambiente esterno: Organici (glucosio)

•

⇀

Assunzione nutrienti trasporto dall’esterno B. SORGENTE DI ENERGIA

⇀

all’interno della cellula Elaborazione "

nutrienti (una volta entrate le molecole FONTE DI CARBONIO

A.

subiscono delle trasformazioni) AUTOTROFI: carbonio inorganico (CO2) -->

•

Composizione della cellula batterica: sono in grado di vivere in ambienti in cui

Peso umido: 80% acqua

• sono presenti semplici composti inorganici;

Peso secco (è il peso dopo aver centrifugato

• essi riescono a sintetizzare le molecole

i batteri e averli disidratati: rimane una biologiche di cui hanno bisogno utilizzando

quantità di materiale organico ed inorganico come fonte di carbonio il biossido di

che rappresenta il peso secco). Del peso carbonio e come fonte di azoto l'ammoniaca

secco, il 96% è composto da macromolecole: o altri composti inorganici azotati. => non

proteine

• necessitano la presenza o meno di altri

polisaccaridi

• organismi, come pure di molecole organiche

lipidi

• di origine esogena.

acidi nucleici

• [=> hanno esigenze nutrizionali minime in

Le macromolecole sono costituite grado di svolgere autonomamente i processi

prevalentemente da C e O, a cui si legano di sintesi, utilizzano (riducendole) sostanze

⇢

N, H, P, S C: 50% O: 20% N: 14% H: 8% completamente ossidate come la CO2 e i

P: 3% S: 1% (questi in tutto fanno 96%) nitriti].

NUTRIENTI = Strumenti chimici che

! ETEROTROFI: hanno bisogno, dal punto di

•

forniscono i materiali di base e l’energia per vista nutrizionale, di composti organici, da cui

tutto il metabolismo cellulare ricavano, dopo la digestione e la successiva

A. Macronutrienti: elementi chimici focalizzati demolizione, anche l'energia necessaria alla

necessari in grande quantità: loro sopravvivenza.

H2O al primo posto

‣ [=> hanno notevoli esigenze nutrizionali,

C, O, H per tutti i composti organici

‣ necessità di nutrimenti organici preformati: da

N per le basi azotate (DNA, RNA) e gli

‣ un solo composto organico fino a moltissime

aminoacidi (proteine) molecole organiche (per esempio vitamine)

P per i fosfati organici (DNA, RNA,

‣ che il batterio è incapace di sintetizzare

fosfolipidi) (fattori di crescita)].

S per aminoacidi e vitamine

‣ SORGENTE DI ENERGIA

B.

Mg indispensabile per l’attività delle

‣ FOTOTROFI: utilizzano l’energia luminosa

•

polimerasi CHEMIOTROFI : utilizzano l’E chimica

•

B. Micronutrienti: elementi necessari in piccole contenuta nei legami dei composti chimici

quantità/in tracce, ma comunque (organici o inorganici) I batteri utilizzano in

indispensabili: Cu, Mn, Cr, Co, Zn.

" modo indipendente le fonti di energia e di

carbonio => ossidazioni chimiche dei substrati.

Ad ognuno dei seguenti passaggi la cellula "

deve fornire e affinchè possano avvenire: Queste 4 sorgenti possono essere usate

⇀ ⇀ ⇀

materia prima molecole monomeri indipendentemente le une dalle altre: mentre le

⇀

macromolecole (proteine, acidi nucleici) piante possono essere sia fototrofe che

⇀

strutture funzione che devono svolgere. 1

autotrofe, i microrganismi possono essere di 4 ASSIMILAZIONE dei NUTRIENTI

!

tipi (combinazioni possibili): È il trasporto di queste molecole attraverso la

organismi fotoautotrofi parete e la membrana, e può avvenire per:

LUCE + CO : utilizzano sostanze inorganiche A) Diffusione passiva

2

come base per la sintesi di molecole B) Diffusione facilitata

organiche e la luce come fonte di energia C) Trasporto attivo

(la maggior parte dei cianobatteri = batteri Le proteine di trasporto consentono il

fotosintetici); passaggio più o meno selettivo di molecole

organismi chemioautotrofi attraverso la membrana: le proteine di

COMP.INORGANICI + CO : utilizzano!sostanze membrana fungono da trasportatori.

2

inorganiche sia come base per la sintesi di Limitazioni della diffusione:

molecole organiche sia come fonte di non consente l’accumulo di grandi quantità di

•

energia (ad es nitrobatteri, ferrobatteri, nutrienti

nitrosobatteri); il flusso tende e si ferma all’equilibrio

•

organismi fotoeterotrofi l'accumulo è inefficiente con basse conc

•

LUCE + COMP.ORGANICI: utilizzano sostanze ambientali di nutrienti.

"

organiche come base per la sintesi di altre

molecole organiche e la luce come fonte di A) DIFFUSIONE PASSIVA = passaggio di

energia (ad esempio alcuni batteri); sostanze per osmosi: i composti liposolubili

organismi chemioeterotrofi (glicerolo) passano da zone ad alta

COMP.ORGANICI + COMP.ORGANICI: utilizzano concentrazione a zone a bassa

sostanze organiche e inorganiche sia come concentrazione. È un movimento spontaneo

materiali di sintesi per le loro strutture secondo gradiente di concentrazione => un

interne, sia per ricavare energia. processo energia-indipendente.

organismi chemiorganotrofi B) DIFFUSIONE FACILITATA = trasporto

(chemioeterotrofi e organofili): utilizzano solo mediato da proteine carrier (permeasi), più o

composti organici e sono i batteri patogeni meno selettivo. Anche in questo caso il

per l'uomo (di interesse medico): richiedono passaggio avviene da zone ad alta

terreni arricchiti concentrazione a zone dove questa è bassa.

" Quando le molecole arrivano in prossimità

Chemiorganotrofi e FATTORI di CRESCITA

! dei carrier, questi cambiano conformazione

Composti organici a basso P.M. necessari per la per accoglierla.

crescita di tutte le cellule. Principalmente sono: C) TRASPORTO ATTIVO = trasporto che

Vitamine (partecipano alla catalisi di

• consente il passaggio delle molecole contro

reazioni chimiche) gradiente di conc: da zone a bassa conc a

Aminoacidi

• zone ad alta conc => la cellula deve

Basi azotate

• spendere E per acquisire le molecole

che i batteri devono possedere per poter (nutrienti) e deve comunque possedere

vivere. carrier. L'E che la cellula deve impeigare, la

A. alcune cellule li sintetizzano: prototrofi (E. ricava generalmente da:

⇢

coli, Bacillus subtilis) necessitano solo di a. ATP

glucosio, il resto lo sintetizzano da sè b. gradiente protonico.

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