Appunti di Microbiologia applicata, primo modulo

PROBLEMA

Il pellet viene risospeso in un tampone di lisi, 3 ml, ph 8 che contiene lisozima. Il lisozima agisce anche se messo a 4 gradi, per velocizzare lo si mette a 36 gradi per almeno mezz'ora. Dopo di che aggiungiamo 200 microlitri di SDS al 20%. Risospendere vuol dire riportare in sospensione il Pellet. Qual è la concentrazione finale dell'SDS? Se il volume finale è 3 ml.

Proporzione:

Concentrazione iniziale x volume iniziale = c finale x V finale.

GEL ELETTROFORESI E VISUALIZZAZIONE

Principi dell'elettroforesi: - una molecola carica posta all'interno di un campo elettrico migra in direzione del polo di carica opposta; - in un gel costituito da un polimero organico, molecole di dimensioni diverse (ma di uguale carica) migrano con velocità diverse, perché le molecole di dimensioni maggiori incontrano maggiore resistenza tra le maglie di un gel. - Il gel di agarosio viene preparato a concentrazioni variabili da 0,5 al 3% (p/v).in funzione del range di peso molecolare delle molecole che si vogliono separare e visualizzare (più grandi sono le molecole più bassa deve essere la concentrazione del gel di agarosio). Preparare il gel di agarosio allo 0,7%, risospendendo la quantità di agarosio necessaria (relativa alle dimensioni del gel che si deve preparare) in tampone TAE 1X (Tris-acetato-EDTA pH 8, costituito da Tris 40 mM, Acido acetico glaciale 20 mM, EDTA 1 mM) a cui vengono aggiunti 0,2 μg/ml di una soluzione di bromuro di etidio (ATTENZIONE: IL BROMURO DI ETIDIO È NEUROTOSSICO per cui si lavora con guanti e tutto il materiale che è stato a contatto con il bromuro di etidio deve essere trattato a parte). (Quindi in questo caso gel al 0,7 %, quindi 0,7 g in 100 ml. Domanda gel al 1% a 150 ml ne pesiamo 1,5 g. Oppure 50 ml al 3 % .. ??) Sciogliere a caldo e versare il gel ancora caldo nella idonea vaschetta, posizionando il pettine per costruire le tasche di caricamento. Lasciare

raffreddare no ad avvenuta solidi cazione delgel. Estrarre con cura il pettine, porre il gel nell’ idonea vaschetta per elettroforesi orizzontale eriempire la vaschetta con TAE 1X no a ricoprire l’intero gel. Caricare 25 μl di campioneaddizionato di 1/6 di volume di un indicatore di corsa: BBF (0,25% blu di bromofenolo, 40%saccarosio)(quindi addizionare 5 μl di BBF= il volume totale sarà di 30 di cui 1/6 costitutito dalBBF). Impostare un campo elettrico costante di 100 V e procedere con la corsa elettroforeticano a che il BBF non abbia raggiunto la ne del gel.Estrarre con cura il gel e deporlo sullo schermo di un transilluminatore dove viene esposto airaggi di una lampada UV a 254 nm per visualizzare il DNA come bande uorescenti. Procedereall’acquisizione digitale dell’immaginefi fi fi fi fl fiEsempio di gel fotografato, relativo all’estrazione del DNA totale(commentare foto di un gel di dna totale, domanda esame)tasche di caricamentoDNA

cromosomale: essendo di grandi dimensioni forma una banda grande e non ben definita

DNA plasmidico: migra più velocemente perché di più piccole dimensioni e in conformazione CCC, mentre il DNA cromosomale in seguito all'estrazione cambia conformazione e lo ritroviamo come lunghi frammenti lineari

RNA: poiché non abbiamo eseguito la rimozione dell'RNA con Rnasi, è co-estratto e co-precipitato con il DNA. Ma non interferisce nelle successive analisi di amplificazione.

In questo caso la striscia bianca che si vede indica che il campione non è molto purificato: presumibilmente non è stata posta attenzione nel non prelevare l'interfase durante lo step di deproteinizzazione con solventi.

Dopo la visualizzazione del DNA in gel di agarosio, si possono usare questi metodi per la valutazione quantitativa:

• spettrofotometro: sfruttando il fatto che il DNA assorbe a 260 nanometri.

Si ha una soluzione di DNA perché il DNA si è sciolto.

si diluisce 1 ml di una diluizione di 1 a 100. Come si fa: faccio prima 1:10 e poi 1:100. Bisogna fare 2 diluizioni, una alla ^-1 e una alla^-2. Se invece voglio avere questa diluizione in un solo passaggio faccio 10 micro litri + 990 micro litri. Quindi si diluisce la soluzione di DNA. Il tampone serve come bianco, perché anche questo avrà assorbanza di 260 nanometri.

1U A260nm = 50 microgrammi/mL

1U: 50 = A(campione):X (ug/mL)

X= 50 x A- L'altro metodo invece consente di determinare la concentrazione del DNA mediante fluorescenza. Con lo spettrofotometro si può determinare anche la qualità del DNA estratto, si fa una lettura dello stesso campione a 280 nanometri, che è la lunghezza d'onda a cui assorbono le proteine. Un DNA di buona qualità deve avere un rapporto di lettura 1.8.

Le Proteine vengono rimosse con il cloroformio e interferiscono nell'amplificazione del DNA con la PCR. Per campioni in cui il rapporto tra 260/280 è basso,

l'unico modo per migliorarlo è riprendere il DNA e ripetere la procedura di purificazione. Questo rapporto deve essere 1,8 o superiore.

Oltre al 16s c'è un altro metodo per identificare l'isolato, è l'amplificazione della regione che si trova tra il 16s e il 23s.

Ripasso della teoria di amplificazione via PCR

La PCR consiste in diversi passaggi di raffreddamento e riscaldamento della doppia elica di DNA e si basa sul principio della replicazione del DNA. La doppia elica del DNA si separa scaldando, e nella fase di raffreddamento viene aggiunta una sequenza nucleotidica di 20/25 paia di basi (primer), che si appaiono andando a definire una regione precisa del DNA. La PCR richiede l'utilizzo di un termociclatore, una macchina in cui si inseriscono provette eppendorf da 0,2 ml di volume vuoto e che possiede un software per impostare dei cicli termici. Ripassiamo le fasi che compongono la PCR (polymerase chain reaction):

La PCR si usa sia

in campo diagnostico sia in campo di ricerca. I primer hanno sempre direzione 5’ 3’. L’appaiamento dei primer dipende dalla lunghezza e dalla percentuale di G-C, maggiore è questa % e maggiore sarà la T di appaiamento. Tendenzialmente si lavora con %G-C= 60% che consente di lavorare a T di melting, maggiori di 60° (circa 62), maggiore è questa T e minore è la specificità dei primer. Ci sono software che consentono di distinguere i primer.

Nel primo step della PCR si delimita la regione che si vuole amplificare; durante la fase di sintesi del nuovo filamento la polimerasi inizia ad attaccare i polinucleotidi; la creazione della regione che viene amplificata la determinano i primer. Nel primo ciclo si ha la sintesi di un filamento dove viene delimitata una parte, nel secondo ciclo il primer si appaia. Ad ogni ciclo della PCR si ha un raddoppio.

Componenti di una soluzione di amplificazione PCR:

• Gli enzimi agiscono in uno

speci co tampone dove sono presenti sali, cofattori e pH; non inacqua.- Ntp: nucleotiditrifosfato- magnesio cloruro: cofattore della dna polimerasi: se ne utilizzano 0,5 L e la concentrazionenale è 0,5 millimolare. Concentrazione dello stock? Volume nale=25L

e provette si preparano con una miscela madre di 200 microlitri, che contiene tutti gliingredienti tranne il dna, in cui andremo a mettere il Vt-dna = 24 microlitri. In questo modol’errore è minore (questa fase è master mix). Dopo aver preparato le provette, queste vengonomesse nel termociclatore che può contenere no a 24 tubi PCR, e consente di riscaldare in pocotempo e consente l’ampli cazione.

1° fase. Denaturazione: per poter utilizzare entrambi i lamenti di DNA come stampo perl'azione della DNA polimerasi e per permettere la riassociazione tra primers e lamenti stampo,è necessario denaturare il DNA attraverso l'innalzamento della temperatura a circa 94°C perpochi

minuti.2° fase. Appaiamento (o annealing): la temperatura viene abbassata per permettere l'appaiamento dei primers alle loro regioni omologhe. La riassociazione sarà favorita da temperature inferiori al valore di Tm calcolato per i primers, circa 3°C al di sotto. Se i primers sono stati costruiti correttamente, si andranno a posizionare nella posizione e direzione corretta per far avvenire un'amplificazione interna della regione bersaglio. Avremo allora un primer (forward) che si legherà al lamento antiparallelo 3' 5' delimitando l'inizio della sintesi, ed un primer (reverse) che si legherà all'altro lamento delimitando la fine della sintesi.

3° fase. Estensione o sintesi: a questo punto è tutto pronto per l'azione della DNA polimerasi. La temperatura di questa fase corrisponde alla temperatura ottimale di azione enzimatica (per la Taq 72°C).

Per la PCR bisogna calcolare il Tm dei

primers a cui sottrarre 3°C.Tm = temperatura media di denaturazione termica dei primers, ovvero la temperatura alla quale il 50% delle molecole si trovano in forma dissociata. Non avendo a disposizione una curva di denaturazione (che si utilizza per il calcolo della Tm di una molecola intera di DNA), nel caso dei primers si ricorre a una semplice formula:

Tm = (4 [G] + (2 [C])) * 4 + (2 [A] + 2 [T]) * 2

Dove G (guanina), C (citosina), A (adenina) e T (timina). Il calcolo è molto semplice poiché i primer hanno dimensione di 15-20 paia di basi (bp). Al valore calcolato sottrarre 3°C per arrivare ad una temperatura che favorisce la riassociazione. Inoltre, dal momento che la DNA polimerasi lavora solo in direzione 5'->3' i primer devono essere costruiti con la giusta direzione, ovvero devono presentare l'estremità 3' libera. In questo modo l'enzima andrà a copiare la regione di DNA interna, compresa tra i due primer.

Si impostano circa

e dell'operone ribosomale RS è noto e indicativo per molte specie, e questo consente di ottenere subito indicazioni attendibili sulla specie di appartenenza dei vari isolati. Con microorganismi meno conosciuti invece le banche dati sono molto utili nell'ottenere informazioni sulla regione target da amplificare per identificare la specie. La regione spaziante dell'operone ribosomale RS è costituita da sequenze altamente conservate e sequenze variabili. Le sequenze conservate sono utilizzate per progettare primer universali che si legano a tutte le specie, mentre le sequenze variabili sono utilizzate per progettare primer specifici per una determinata specie.