Appunti di Microbiologia applicata, primo modulo

Dispensa microbiologia applicata parte generale

Differenza tra carica batterica coltivabile e vitale

Un batterio vitale è in grado di moltiplicarsi su terreno agarizzato e il prodotto che vedo sul terreno sono le colonie. Non tutte le cellule vitali sono coltivabili perché esistono tantissimi stati fisiologici, alcuni anche scoperti recentemente, di cui uno è di vitalità ma non di coltivabilità. Ad esempio ci sono alcuni microrganismi che in condizioni ambientali sfavorevoli entrano in uno stato di metabolismo ridotto —> VBNC = stato vitale ma non coltivabile.

Una colonia a cosa corrisponde e da dove deriva? (domanda di esame)

La colonia deriva dalla replicazione di una cellula coltivabile presente sul terreno dando origine a qualcosa di visibile, la colonia.

Come funzionano i marcatori della citometria?

Cosa si intende per coltura pura e come si ottiene?

Per coltura pura si intende una popolazione di organismi che deriva da un unico organismo vivente iniziale. La coltura pura è di notevole importanza nell'ambito della microbiologia in quanto permette di isolare un singolo ceppo microbico da una miscela contenente microrganismi di specie diverse o della stessa specie ma di ceppi differenti. La popolazione (o colonia) cellulare che è stata isolata può essere analizzata e può essere identificato e studiato l'organismo di cui è composta.

Cos'è la conta vitale?

La conta vitale (conta in piastra o conta delle colonie) consiste nel determinare il numero di cellule di un campione in grado di formare delle colonie su terreno agarizzato. Tale conta si può eseguire in due modi: attraverso piastramento di un volume noto di coltura sulla superficie di un terreno oppure mediante piastramento per inclusione mescolando un volume noto di coltura con il terreno agarizzato fuso all’interno di una piastra Petri sterile, assicurandosi che il microrganismo sopporti la temperatura di circa 45°C dell’agar fuso. Per ottenere un numero di colonie appropriato (tra 3 e 300) il campione viene di solito diluito mediante diluizioni seriali (in base 10) fino alla diluizione finale desiderata. La conta vitale è influenzata oltre che dalle dimensioni dell’inoculo, dal terreno utilizzato, dalle condizioni e dal tempo d’incubazione.

N.B. Il risultato della conta vitale è spesso espresso come numero di CFU (unità formanti colonia), piuttosto che come numero di cellule vitali, in quanto una CFU può essere costituita da una o più cellule.

Fondamenti di citometria a flusso

La citometria a flusso è una tecnica di conta diretta dei microrganismi e trova applicazione non solo nella microbiologia ma anche in tanti altri campi ed è stata sviluppata per l’analisi di eucarioti. Il primo citometro è stato ideato nel 1949 da Wallace H. Coulter che poi diede il proprio nome alla macchina. Il contatore Coulter consentiva di rilevare la presenza di particelle presenti in una sospensione.

I primi impianti rudimentali si basavano su un flusso di corrente elettrica che permetteva di segnalare la presenza di eventi grazie all’interruzione del suo flusso provocato dal passaggio degli stessi. Nello specifico, il contatore Coulter è nato per la conta dei globuli bianchi e dei globuli rossi nel sangue. Successivamente sono stati sviluppati citometri più complessi negli anni '60, sempre per fini clinici. I microbiologici hanno iniziato ad utilizzare questo strumento solo alla fine degli anni '70. Le limitazioni nel campo della microbiologia sono state le dimensioni delle cellule procariote, che hanno richiesto l’impiego di particolari accorgimenti, rispetto alle cellule dei mammiferi, perché essendo una tecnica sviluppata per rilevare cellule grandi è stata poi adattata anche per osservare batteri più piccoli.

Il potenziale di questa tecnica è il fatto che non richiede la coltivazione dei batteri su un terreno agarizzato. Un metodo chiamato quindi culture-independence. Quando si parla di batteri non coltivabili ci si riferisce al fatto che non sempre è possibile vedere il batterio presente sul terreno, e il vantaggio della citometria a flusso è proprio quello di poter contare anche i batteri non coltivabili che invece non vengono rilevati dalle tecniche di diluizione e piastramento per la loro selettività intrinseca.

Per esempio, in un campione di suolo siamo in grado di coltivare solo l’1% dei batteri presenti, poiché gli altri necessitano di substrati di crescita non presenti e poiché si innescano rapporti di competizione per il nutrimento e di antagonismo tra i microrganismi. Coltivare batteri non è semplice, esistono diversi stati fisiologici che non sono solo cellule vive e cellule morte, ma ci sono cellule vitali e coltivabili, cellule vitali ma che non riescono a replicarsi e cellule vitali che riescono a replicarsi solo su certi terreni. Con la citometria abbiamo una visione globale di tutto quello che è presente nel campione, compreso ciò che non è coltivabile.

Cosa vuol dire citometria a flusso?

• Flow (flusso): significa che abbiamo necessariamente un liquido di batteri in una sospensione (che non è soluzione, perché i batteri non si sciolgono) per esempio in una soluzione salina per evitare stress osmotici o in un campione di suolo diluito.
• Cyto (cito): fa riferimento alla cellula.
• Metry (metria): vuol dire misurazione. Si ha una misurazione della concentrazione, della dimensione, della morfologia e della complessità interna di queste cellule. È quindi una misura multiparametrica che consente di contare una cellula per volta e caratterizzarla a livello fisiologico.

Quindi misurazione di cellule in sospensione; e cosa andiamo a misurare?

• La densità, cioè quante cellule x ml abbiamo nella nostra sospensione.
• Le dimensioni delle cellule distinguendo le varie popolazioni in base alle diverse dimensioni.
• La complessità interna, una caratteristica vera soprattutto per i lieviti, in quanto le cellule di lievito possono avere dei vacuoli intracellulari che rappresentano zone più dense del citoplasma e mano a mano che le cellule di lievito invecchiano questi vacuoli tendono ad occupare tutta la parte del citoplasma, ecco perché si parla di complessità interna o densità intracellulare. Può capitare anche in batteri.

La citometria a flusso è una metodologia di analisi microbiologica quantitativa e qualitativa, dotata di elevata rapidità d’esecuzione. Per valutare la vitalità di una sospensione si utilizza un citometro capillare che consente l’aspirazione del campione in sospensione. Al suo interno scorre un fluido formante un flusso laminare uniforme e il diametro del capillare è tale da costringere le cellule batteriche a procedere in fila.

Prima di tutto un campione di cellule viene sospeso in un fluido. Successivamente, prima del test e sulla base delle cellule da analizzare, il campione viene trattato con coloranti specifici in grado di discriminare i sottotipi cellulari. Questo colorante (il fluorocromo) viene attaccato ad anticorpi monoclonali diretti verso particolari distretti cellulari o antigeni marcatori. Infine il campione contenente le cellule marcate viene introdotto nello strumento chiamato citofluorimetro, che è costituito da 5 parti:

• La prima parte e più importante è costituita da un sistema fluidico, (capillare) che consente di analizzare una cellula alla volta. Un fluido comprime la sospensione ai due lati e permette di incanalare, mettere in fila, una particella per volta prima di incontrare il laser. Anche noto come principio di focalizzazione idrodinamica, si basa sul principio di Bernoulli.
• Laser (fonte di eccitazione) a diverse lunghezze d’onda: quindi luminoso, a 488 nm, che rappresenta sia una luce (fonte luminosa all’interno dello strumento) ma anche una fonte di eccitazione nel caso in cui si lavori con molecole fluorescenti. Quindi il laser può essere considerato come una sorgente luminosa che viene deviata ogni volta che una particella incontra questo laser, quindi la deviazione del laser è indice del passaggio di un evento. Il punto in cui la singola particella incontra il laser è definito interrogation point. Inoltre il modo in cui la luce viene deviata (forward scatter e side scatter) permette di dedurre la dimensione e la complessità degli eventi citometrici. Il forward scatter (scatto della luce in avanti) è proporzionale alle dimensioni della cellula ed è quindi indice delle dimensioni. Il side scatter si basa sul principio della rifrazione della luce; quando la luce viene deviata di 90°C è indice della complessità interna. Entrambi vengono poi convertiti in impulso elettrico in modo proporzionale. Di solito la complessità interna si pone sull’asse delle y e le dimensioni sulle ascisse per mettere i due parametri in relazione e differenziare le particelle analizzate. La posizione delle particelle nel grafico permette di discriminare il tipo di cellule in base a dimensioni/complessità (per esempio batteri e lieviti). La grande difficoltà è discriminare i batteri dal background, ovvero dal particolato di dimensioni simili alle cellule procariote. Per questo si utilizzano delle molecole fluorescenti per marcare il campione e il laser eccita queste molecole provocando una emissione di fluorescenza. Un target per riconoscere una cellula da una qualsiasi particella è, per esempio, la marcatura del DNA: alcune molecole si intercalano nella doppia elica del DNA diventando fluorescenti e vengono rilevate dal detector. Questo mi permette di dire con certezza cosa è cellula e cosa è particolato. (Quale principio uso per distinguere un evento che ha deviato il laser e che è cellula, da un evento che ha deviato il laser ma è qualcos’altro? Cosa le distingue? domanda esame)
• Altre sostanze fluorescenti permettono di misurare il pH citoplasmatico, la produzione di ATP, lo stress osmotico intracellulare e anche l’attività enzimatica.
• Sistema di ottica costituito da lenti, specchi e filtri che servono per indirizzare il flusso luminoso ai rilevatori.
• Detectors o rilevatori: rilevano la lunghezza d’onda della fluorescenza prodotta o la deviazione della luce del laser e il segnale rilevato viene amplificato dai fotomoltiplicatori e inviato al computer.
• Sistema elettronico: un sistema digitale che converte le misurazioni analogiche di intensità luminosa, trasformandole in un segnale elettrico per permettere al software di gestione di elaborare i segnale e restituire il risultato dell'analisi.

I risultati vengono rappresentati con:

• Istogrammi monoparametrici (numero di eventi/fluorescenza).
• Istogrammi biparametrici (confronto di diverse fluorescenze o side scatter/forward scatter).

Il vantaggio della citometria è la possibilità di eseguire sullo stesso campione una grande quantità di analisi ottenendo più informazioni. Per esempio tramite l’uso di due molecole fluorescenti con diversi canali di fluorescenza è possibile distinguere le cellule vive da quelle danneggiate o morte.

Ci sono 4 canali di fluorescenza:

• SYTO 24 che ha fluorescenza nel verde.
• FR3 probidio ioduro: rosso.
• FL2: giallo.
• FL4: arancione.

Ma i principali sono i primi 2.

Principio della focalizzazione idrodinamica

Il principio della citometria a flusso, è la focalizzazione idrodinamica, che è il principio per cui in citometria facciamo un’analisi a livello di singola cellula.

Perché la citometria ci consente un’analisi a livello di singola cellula?

Una sospensione disordinata grazie al liquido di trascinamento, che ha una pressione diversa rispetto a quella del nostro campione, fa in modo che gli eventi si allineino in modo da passare dal punto di interrogazione uno per volta.

Vantaggi e svantaggi dell'uso di citometri nella microbiologia

Pro:

• Raccolta di molte informazioni in contemporanea.
• Accuratezza molto elevata e riproducibilità (errore inferiore al 5% e se si considera diluizione/piastramento l’errore è del 20%).
• Velocità di analisi (per analizzare campioni di suolo solo 30 minuti) e possibilità di automazione.
• Generazione di multiparametri (FSC, SSC, fluorescenza primaria e secondaria).
• Le cellule microbiche possono essere rilevate indipendentemente dalla loro coltivabilità.
• Analisi a livello di singola cellula.

Contro:

• Non ha un approccio tassonomico: ogni volta che abbiamo un evento che definiamo essere cellula non possiamo descriverla dal punto di vista tassonomico perché il metodo non permette di discriminare ordine, genere e/o specie (a meno che lavoro con una coltura pura preparata a monte). Il problema si pone lavorando con campioni sconosciuti.

Per alcune analisi quindi si può proporre la citometria a flusso ma solo in combinazione con altre analisi che sono fondamentalmente il piastramento. Non è una metodica adatta per la conta di coltura in alimenti; fatta eccezione per lo yogurt, che essendo fermentato è molto semplice, i contaminanti sono inattivati e viene prodotto da due specie e quindi in questo caso posso utilizzare la citometria a flusso. Anche per l’acqua posso utilizzare la citometria a flusso.

Come abbiamo già detto è una metodica multiparametrica, oltre ad analizzare una singola cellula per volta, di quella singola cellula si possono andare a valutare i forward scatter (parametro legato alle dimensioni cellulari) e side scatter (indice correlato alla complessità della cellula), l’integrità di membrana, le attività metaboliche, la crescita della cellula grazie ai fluorocromi, ed il pH e lo stress ossidativo. L’utilizzo di questi parametri FS e SSC, ci fornisce la possibilità di distinguere, ed eventualmente separare, popolazioni cellulari di diverso tipo, ad esempio batteri e lieviti, ma anche batteri di specie diverse.

Per valutare l’integrità della membrana, si usa propidio di ioduro (PI) che è una molecola fluorescente nel rosso che penetra la membrana solo nel caso sia danneggiata, intercala la doppia elica di DNA e rende la cellula fluorescente. (domanda esame) Quando invece la membrana è integra non è in grado di entrare nella cellula.

Riassunto delle informazioni rilevabili tramite citometria a flusso

Basate sul laser e sulla deviazione della luce:

• Tipo di cellula.
• Complessità interna.
• Dimensione, rugosità della superficie, membrana cellulare.
• Forma.

Basate sulla fluorescenza (uso di uno o più coloranti in contemporanea):

• Attività metaboliche (esterasi, sintesi di ATP) e crescita della cellula.
• Potenziale di membrana.
• Integrità di membrana.
• Viabilità e funzionalità della cellula.

Applicazioni nella microbiologia dei contatori Coulter

• Monitoraggio della qualità delle acque.
• Valutazione della presenza dei virus (con opportune modifiche agli strumenti).
• Studio degli alimenti.
• Screening nella biocatalisi.
• Molte altre in evoluzione.

Acqua

La sicurezza delle acqua è fondamentale, il controllo microbiologico delle acqua viene normalmente fatto mediante diluizione e piastramento, dove tutto ciò che conto in piastra deriva da una cellula vitale presente nel campione e questo tipo di analisi ha un costo relativamente basso ed è un metodo relativamente semplice. Lo svantaggio è che ci vuole molto tempo per preparare il materiale, per l’incubazione (da 24 h fino ad anche 10 giorni di crescita). Inoltre per la variabilità di batteri presenti nell’acqua non sempre è possibile contare davvero il numero di cellule vitali per ciascun gruppo microbico. Trovare un terreno che consenta la crescita di batteri è tutt'altro che semplice soprattutto se si ha a che fare con un campione che contiene più specie di batteri. Quindi per evitare questa metodica si utilizza la citometria a flusso, che oltre a far vedere la complessità di un campione consente di avere anche un’analisi molto rapida, rispetto invece ai tempi più lunghi impiegati per diluizione e piastramento.

Esterichia coli viene contato usando un particolare terreno chiamato TBX che consente la crescita anche di altri batteri. Cresce con colonie di colore azzurro, sfruttando una particolare attività enzimatica, cioè idrolizzare una parte di substrato presente nel terreno. (terreno selettivo)

HCP

Numerazione dei batteri mediante HCP (conta dei MO diluizione e piastramento)

Per rilevare la più grande frazione possibile di batteri in un dato campione:

• Supporti diversi.
• Diversi tempi di incubazione (da ore a settimane).
• Diverse temperature di incubazione (da 20 a 40°C).

Vantaggi:

• Un risultato positivo è un innegabile indicatore di vitalità per le cellule che hanno formato colonie.
• Metodo economico e semplicistico.

Svantaggi (cosa manca all’HPC? e quanto è rilevante il valore di questo metodo?):

• Tempo e manodopera.
• Il tempo per i risultati varia tra 2 e 10 giorni.
• I risultati dell’HPC non rappresentano né l'abbondanza né la composizione dei batteri nell'acqua potabile.

I batteri non rilevati con metodi HPC convenzionali possono essere osservati con microscopia FCM e altri metodi indipendenti dalla coltivazione:

• Cellule mortalmente ferite e morte.
• Cellule vitali ma non coltivabili (VBNC) (o cellule dormienti).
• Batteri incoltivabili, non coltivabili con metodi HPC convenzionali.

Perché i batteri non coltivabili non vengono rilevati dall’HPC?

Per la presenza di concentrazioni eccessive di nutrienti in qualsiasi tipo di mezzo HPC rispetto all'acqua potabile. I batteri rilevati su HPC non sono le specie dominanti nei campioni di acqua. L'HPC non è adatto per valutare il livello di crescita microbica nei sistemi di distribuzione.