Modulo di Anatomia patologica

COLORAZIONI IMMUNO-ISTOCHIMICHE

7. ESAME MICROSCOPICO 7

Colorazioni immunoistochimiche (o immunoistocitochimiche) hanno soppiantato la gran parte delle colorazioni speciali ed istochimiche. Usano anticorpi specifici (monoclonali, policlonali) contro antigeni cellulari o tissutali (marcatori).

Identificazione del tipo cellulare:

• Definizione della malattia, prognosi e fattori predittivi
• Identificazione di antigeni estranei
• Diagnosi di malattia infettiva sfruttando la specificità degli anticorpi si riesce a riconoscere, anche con molta precisione, la natura dell'agente infettante.

Classificabili in:

• Metodo diretto - immunofluorescenza: si ha un solo passaggio con anticorpo primario marcato con un certo numero di marcatori (numero limitato), uso di microscopio a fluorescenza.

sensibilità dei metodi diretti non è particolarmente elevata.

• (uso di enzimi che danno un segnale colorato)

METODO INDIRETTO - IMMUNOENZIMATICA

1. Anticorpo primario
2. Sistema secondario di rivelazione
3. Reazione di sviluppo

La sensibilità è più elevata.

IHC immunoenzimatica:

Perossidasi (PX) di rafano (pianta erbacea perenne usata in cucina come aromatizzante).

La perossidasi è presente nei tessuti (macrofagi, midollo osseo, fegato) è un enzima che catalizza la scissione dell'acqua ossigenata in H2O e O2.

Per evitare di avere attiva la perossidasi endogena, questa si deve inibire con H2O2.

L'ossigeno nascente ossida un cromogeno, la 3-3'-diaminobenzidina tetraidrocoloruro (DAB), solubile ed incolore che viene ossidata dalla PX in presenza di H2O2 che viene scisso in acqua e ossigeno e forma un colorante che precipita (marrone).

Si possono usare vari cromogeni e avere amplificazione con sali di

nickel (nero) o cobalto (blu).

Fosfatasi alcalina, AP (estratta da intestino di bovini).

Enzima endogeno (intestino umano, fegato) inibito con levamisolo.

I cromogeni usati sono:

• il BCIP (bromo-cloro-indolil-fosfato di blu di toluidina) associato a NBT (nitroblu di tetrazolio) a formare un colorante blu scuro
• il naftolo fosfato AS-TR associato a Fast-Red RC a formare un colorante rosso intenso

Utile in presenza di pigmenti endogeni (come le melanine).

È necessario usare il reagente o anticorpo primario più adatto, più specifico possibile per ottenere la massima accuratezza diagnostica.

È quello che va a riconoscere l’antigene da evidenziare.

Gli anticorpi che si possono usare sono:

• anticorpo policlonale è il risultato dell’attivazione immunitaria di più cloni di linfociti B e dall’attività di più cloni→plasmacellulari.
• Coniglio o capra immunizzato con

l'Ag (+ adiuvante)- Siero raccolto e purificato (separazione delle Ig dalle altre proteine sieriche e purificazione per affinità su colonna in modo da prelevare solo la componente immunoglobulinica che interessa in termini di specificità.

- Eluizione da colonna degli Ab legati

- Vantaggi: produzione rapida e riconoscimento di più epitopi con lo stesso siero (affinità variabile cioè non uguale in tutte le molecole immunoistochimiche). NB.: L'affinità è direttamente proporzionale alla superficie di interazione tra epitopo e sito. Maggiore è la superficie, maggiore è l'affinità.

- Svantaggi: disponibilità limitata al numero degli animali immunizzati e variabilità tra lotti per differenti animali. Un antisiero policlonale non è esattamente uguale ad antisieri policlonali di un altro animale anche se appartenenti alla stessa razza.

8- anticorpi monoclonali- ottenuti da ibridomi tra linfociti

B di animale immunizzato (topo, coniglio) e linea di mieloma non producente Ig sono immortalizzate le plasmacellule producenti l'anticorpo→

- Affinità costante in quanto il clone può essere riprodotto all'infinito, grandi quantità e continuità nel tempo

- Coniglio preferito per epitopi umani non immunogeni nel topo e per maggiore affinità e stabilità degli Ab

- Topo preferito al coniglio per produrre MoAb appartenenti a sottoclassi di IgG (non esistenti nel coniglio), ad esempio per le reazioni di multiplexing (si fanno più colorazioni successive sulla stessa sezione).

- Colorazioni multiplexing (marcature multiple)

Reazioni in successione con rimozione del cromogeno o fluorocromo previa acquisizione di immagini digitali o Ab marcati con barcode o altri tag e rilevabili con spettrometria di massa.

Per situare meglio all'interno del taglio istologico le positività di antigeni e anticorpi si fa la contro-colorazione

(con ematossiline diluite) del resto del tessuto in modo delicato e contrastato rispetto al colore del precipitato enzimatico così da facilitarne la lettura e l'orientamento. Colorazione con:

• Ematossilina di Mayer
• Ematossilina di Gill II

I nuclei delle cellule non colorate così consentono di orientarsi nella sezione.

COLORAZIONI INDIRETTE:

L'obiettivo è riconoscere il legame dell'anticorpo primario. Si deve dare intensità alla reazione di liberazione abbastanza elevata da percepire il segnale con occhio umano → sensibilità. Si usano dei sistemi secondari: eto o→- Metodo ABC (Avidina Biotina Complex) primo sistema antigenesecondario messo a punto in immunoistochimica negli anni anticorpo'70. primario L'avidina lega la biotina con altissima affinità. Ora uso di anticorpostreptavidina. secondario Non si usa più biotina, cioè la vit H che nel corpo umano è biotinilatomolto presente.

Complesso ABC Il complesso ABC (avidina-biotina-perossidasi) è un metodo comunemente utilizzato per l'immunocitochimica. In questo metodo, un anticorpo primario viene utilizzato per rilevare un antigene specifico. Successivamente, un anticorpo secondario coniugato con perossidasi viene utilizzato per rilevare l'anticorpo primario. Infine, viene utilizzata avidina o streptavidina coniugata con perossidasi per rilevare l'anticorpo secondario. Questo metodo permette di amplificare il segnale e ottenere una maggiore sensibilità nella rilevazione dell'antigene desiderato. Sistema di amplificazione FLEX Il sistema di amplificazione FLEX è un metodo utilizzato per aumentare il segnale a livello di ciò che si vuole identificare. Questo sistema utilizza polimeri di destrano o altri composti a cui sono legati covalentemente anticorpi primari. Successivamente, viene utilizzato un anticorpo secondario coniugato con enzimi per legare molte molecole di enzimi all'anticorpo primario. Questo permette di amplificare il segnale e ottenere una maggiore sensibilità nella rilevazione dell'antigene desiderato. MICAdestrano Il MICAdestrano è un sistema utilizzato per l'immunocitochimica. In questo sistema, polimeri di destrano vengono utilizzati per legare covalentemente anticorpi primari. Successivamente, viene utilizzato un anticorpo secondario coniugato con enzimi per legare molte molecole di enzimi all'anticorpo primario. Questo permette di amplificare il segnale e ottenere una maggiore sensibilità nella rilevazione dell'antigene desiderato. SABAP (APAAP+SAP) Il sistema SABAP (streptavidina-biotina-perossidasi complesso coniugato ad anticorpo primario e perossidasi) è un metodo utilizzato per l'immunocitochimica. In questo sistema, un anticorpo primario viene utilizzato per rilevare un antigene specifico. Successivamente, viene utilizzata streptavidina o avidina coniugata con perossidasi per rilevare l'anticorpo primario. Questo permette di amplificare il segnale e ottenere una maggiore sensibilità nella rilevazione dell'antigene desiderato. Tyramide Signal Amplification (TSA, CARD) Il sistema Tyramide Signal Amplification (TSA, CARD) è un metodo utilizzato per l'immunocitochimica. Questo sistema si basa sull'uso di tiramide, che è un prodotto fenolico in grado di legarsi covalentemente a residui di tirosina in presenza di perossido di idrogeno attivo. La tiramide può essere legata a un enzima o a un marcatore fluorescente per amplificare il segnale e ottenere una maggiore sensibilità nella rilevazione dell'antigene desiderato. HRP (horseradish peroxidase) L'HRP (ororadice perossidasi) è un enzima utilizzato nella tecnica di immunocitochimica per catalizzare la deposizione e il legame di una tiramide marcatore (ad esempio biotina) su sezioni di tessuto o preparazioni cellulari. Questa reazione è rapida (meno di 10 minuti) e il legame è covalente perché l'intermedio di reazione si dimera con residui di tirosina sulle proteine.

1. surface-bound endogenous proteins. These labels can then be detected by standard chromogenic or fluorescent techniques.
2. Since the added labels are only deposited proximal to the enzyme site, there is minimal, if any, loss of resolution.
3. Biotinilando la tiramide si ottiene amplificazione.
4. La tiramide si lega ai radicali di tirosina (non Ab secondario come altri).
5. 9 Fattori che concorrono a definire la qualità del risultato in a alità ella rea ione immunoistochimica:
   • dipende dalla qualità della reazione
   • ase re analitica
   1. fase preanalitica issa ione ti o e rata e calcifica ione
   2. fase analitica
   3. interpretativa ase analitica
   • dipende dalla qualità della diagnosi
   • retrattamenti
   • scelta dei marcatori eto i i colora ione
   • integrazione dei risultati i o i colora ione man ale a tomatica
   • alità ei reagenti
6. Da cosa dipende, nelle varie fasi, la qualità? rrori tecnici
7. Scopo dei pretrattamenti: ase inter retati a
   • eliminare segnale aspecifico
   • ontrolli ositi i e

negati ibiotina endogena (avidina non marcata; sistemio i o i rea ione e erosimiglian a morfologicanon a biotina)enzimi endogeni (perossidasi con H2O2, APo con levamisole)Sostanze che riducono il grado elettrico delle cariche a livello tissutale per evitare che l’interazione con le molecoleche si usano come gli Ab avvengano e siano di tipo elettrostatico o non avvengano per repulsione:legami elettrostatici aspecifici (siero albumina)o- aumentare segnale specificoantigen retrievaloolo iologico iotina Fissazione ottimale non dovrebbe superare 72h ponti metilenici da→rompere per consentire all’Ab primario di legare l’epitopo.La biotina (vitamina H, B ), cofattore diquattro carbossilasi:piruvato carbossilasi (piruvato ossalacetato) Per aumentare il segnale specifico:nella gluconeogenesis e ciclo di rebs Procedure di smascheramento antigenico: è un problema→propionil CoA carbossilasi (propionil CoAmetilmalonil CoA) nella beta ossidazione degli conseguente

alla fissazione, serve per rompere i ponti metilenici che siacidi grassi formano.metilcrotonil carbossilasi nella sintesi della Si possono usare enzimi o sistemi fisici-chimici (metodo fisico è il calore,leucina chimico sono soluzioni sistemi tampone a pH debolmente acido o alcalino).acetil CoA carbossilasi (acetil CoA in malonilCoA) nella sintesi degli acidi grassi. A dx sinonimi di “smascheramento antigene”.n imi roteolitici Il recupero dell’antigenicità è un problema meno evidente,eat n ce ito e importante in caso di utilizzo di materiale fresco.etrie al Si possono usare:ltras oni enzimi proteolitici come: idrolasi (scindono molecole➢eto i c imici a introducendo molecole di H2O) …tem erat ra am iente HIER calore (sistema facile, rapido, standardizzabile)➢ →om inati c imico Combinati chimici e fisici➢fisiciIl (metodo fisico) è il sistema più usato nella maggior parteCALOREdei casi. Aumentando l’energia

cinetica aumenta la probabilità dirottura dei legami covalenti e quindi l’es osi ione egli e ito i. Per produrre calore:

Microonde: Non si ottiene l’effetto “uovo sodo” perché il campione è fissato.

Pentola a pressione: Spesso i metodi basati sul calore si associano all’uso di soluzioni acquose formate da sistemi tampone a pH vario, debolmente acido (pH 3) o alcalino (più efficaci, fino a 8,5-9).

Autoclave: Acido Borico + Urea.

Bagno termostatato: Nella maggior parte dei casi si usa il tampone fosfato a pH 6-6,4 o il tampone con EDTA a pH 8-9.