miRNA micro RNA

Il complesso RISC-miRNA è a questo punto in grado di legare sequenze di mRNA

bersaglio che presentano regioni di parziale complementarietà con il miRNA stesso,

regioni localizzate prevalentemente , ma non esclusivamente, nelle loro regioni 3’ non

tradotte. All’interno della regione di legame esiste tuttavia una porzione di perfetta

complementarietà di sequenza tra il miRNA e il gene bersaglio che corrisponde a una

regione di circa 7-8 nucleotidi all’estremità 5’ del miRNA, denominata seed.

Parte dell’apparato molecolare preposto alla biogenesi dei miRNA viene utilizzato dalla

cellula anche per attivare il processo di RNA interference (iRNA), una forma naturale di

silenziamento genico con effetto protettivo rispetto a eventi dannosi come infezioni

virali.

PROCESSO DELL’RNA INTERFERENCE

Si tratta di un processo di inibizione dell’espressione genica esercitato da molecole

di RNA su altre molecole di RNA, per lo più RNA messaggeri. Il meccanismo della

RNAi viene utilizzato dagli organismi sia per regolare l’espressione genica (come nel

caso dei miRNA) sia per proteggersi da aggressioni da parte di agenti quali virus e

trasposoni. Estremamente importante in questo processo è la formazione di una

molecola di RNA a doppio filamento che può derivare dalla biogenesi dei miRNA;

dall’interazione tra trascritti esogeni; oppure da processi esterni alla cellula come

infezioni virali o somministrazione esogena.

La formazione di molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) nel citoplasma

cellulare determina l’attivazione delle RNAsi Dicer che, una volta legatasi a esse, è

in grado, come per i miRNA, di tagliare in frammenti di dsRNA di circa 20-25 basi.

Questi ultimi sono denominati piccoli RNA interferenti (siRNA) che sono

successivamente separati nei due filamenti e incorporati nel complesso RISC con la

proteina Ago. A questo punto sono in grado di riconoscere lunghe molecole di RNA

con cui prestino complementarietà di sequenza (geni bersaglio). Se questa

complementarietà è totale la proteina Ago potrà determinare il taglio e

conseguentemente l’inattivazione del gene bersaglio. Questo è il meccanismo

attraverso il quale l’RNA virale può inattivato mediante meccanismo di iRNA.

Tuttavia i siRNA, possono regolare l’espressione genica non solo tramite un

meccanismo post- traduzionale, come quello appena descritto, ma anche con un

meccanismo diverso, di tipo trascrizionale che si esplica nel nucleo e non nel

citoplasma. Attraverso questo meccanismo molecole di siRNA possono indurre la

formazione di eterocromatina in determinati loci genomici e conseguentemente

inibire il processo della trascrizione.

Il processo della iRNA può essere anche utilizzato per applicazioni traslazionali.

Innanzitutto, può essere sfruttato come approccio in biologia sperimentale per

studiare la funzione di geni specifici in modelli cellulari o in vivo in organismi

modello tramite somministrazione esogena di oligonucleotidi in grado di riconoscere

la sequenza del gene di interesse con conseguente attivazione del processo di iRNA

e conseguente silenziamento genico. Inoltre, i siRNA, così come i miRNA possiedono

un grosso potenziale come agenti terapeutici e sono in corso sperimentazioni

cliniche avanzate per valutare la loro efficacia, soprattutto in alcune forme di

neoplasia.

A tutt’oggi oltre un migliaio di miRNA sono stati identificati nel genoma umano. A

livello di organizzazione genomica, i miRNA possono essere localizzati all’interno di

unità trascrizionali (geni ospiti), anche codificanti per proteine, nel qual caso

vengono etichettati come intragenici. Spesso i miRNA intragenici sono coespressi con

i loro geni ospiti e , pertanto, condividono gli stessi elementi di controllo

dell’espressione (promotori, enhancer ecc). Alternativamente i miRNA possono essere

localizzati in regioni genomiche in cui non sono localizzati altri geni, in questo caso

vengono denominati intergenici e sono dotati di propri elementi di controllo della

trascrizione.

15.1.1.2 Riconoscimento di geni bersaglio da parte dei miRNA

La conseguenza del parziale appaiamento di sequenza tra miRNA ed mRNA che si

verifica nelle cellule animali è una riduzione dell’espressione dell’mRNA bersaglio che

può essere conseguenza o di una ridotta capacità di traduzione o di una degradazione

del trascritto. Nelle cellule vegetali, in cui l’appaiamento è totale, si osserva un taglio

(clivaggio) del trascritto bersaglio.

È possibile generare per ogni miRNA liste di geni bersaglio predetti sulla base di analisi

bioinformatiche che si avvalgono di fattori quali l’analisi della complementarietà di

sequenza tra i miRNA e le regioni 3’ non tradotte dei geni, sfruttando in particolare la

presenza di regioni seed, la loro conservazione nel corso dell’evoluzione, la formazione

di strutture secondarie predette. Tuttavia, considerata la ridotta dimensione delle

regioni seed e la non perfetta complementarietà di sequenza che media l’azione dei

miRNA al di fuori del seed, tutte le predizioni di geni bersaglio per i miRNA devono

essere convalidate tramite approcci sperimentali.

15.1.1.3 ruolo fisiopatologico dei miRNA

Ogni miRNA è in grado di riconoscere varie centinaia di geni bersaglio per cui l’effetto

globale operato da questi ncRNA nell’ambito della regolazione dell’espressione genica

sembra essere molto rilevante e quasi paragonabile a quello esercitato da fattori di

trascrizione: circa il 60& dei geni presenti nel genoma possono essere regolati da

miRNA. Attualmente si pensa che i miRNA possano esercitare un azione di fine

modulazione dell’espressione genica e che cos’, coordinati con i fattori di trascrizione,

possano contribuire in modo determinante alla regolazione dei processi di

differenziazione e fusione cellulare.

15.1.1.4 altri tipi di ncRNA regolatori

Oltre ai miRNA esistono anche altri tipi di piccoli ncRNA. Tra questi, quelli

maggiormente importanti sono rappresentati dai piRNA, ovvero RNa in grado di

interagire con la proteina PiWi. Si tratta di RNA di dimensioni leggermente maggiori

rispetto ai miRNA (24-31 basi) espressi delle cellule germinali dei mammiferi. Sono

organizzati in cluster nel genoma e ne esistono diverse migliaia e, quindi,

rappresentano una delle famiglie più complesse dei piccoli ncRNA. Anche i piRNA sono

coinvolti nel silenziamento genico e in particolare nella modulazione negativa

dell’attività dei trasposoni che sono in grado di causare riarrangiamenti genomici

altamente dannosi in cellule germinali. La loro azione è esercitata attraverso la

formazione di un complesso RISC che è composto da proteine Piwi anziché argonauta

come nel caso dei miRNA.

15.2 Lunghi ncRNA ad attività regolatoria

Oltre ai piccoli ncRNA esistono trascritti con lunghezza superiore a 200 basi e

apparentemente privi di potenziale codificante. Questi trascritti sono stati etichettati

come ncRNA lunghi (lncRNA) e sembrano rappresentare una famiglia altamente

eterogenea sia come struttura che come funzione. Nella maggior parte dei casi la loro

trascrizione avviene in modo simile a quello degli mRNA, prima con la formazione di

RNA precursori (eterogenei nucleari) sottoposti a splicing, e con successiva aggiunta di

cap e poliadenilazione. Tuttavia una frazione significativa di essi può presentare

modalità diverse di formazione e può essere ritenuta nel nucleo. I lncRNA sono tessuto

specifici e si trovano per esempio nel SNC, nelle cellule staminali embrionali ecc. Un

modo di classificare i lncRNA si basa sulla loro relazione genomica con altri trascritti, in

genere codificanti per proteine. Si possono infatti individuare le seguenti sottoclassi:

- lncRNA intergenici (localizzati in regioni genomiche prove di trascritti)

- Associati ad altri trascritti, distinguibili a loro volta in :

intronici/intragenici;

o antisenso

o

I lncRNA antisenso si sovrappongono ad altri trascritti ma in direzione opposta di

trascrizione.

Si distinguono diversi gradi di sovrapposizione: su può andare dalla sovrapposizione

diretta di uno o più esoni (antisenso propriamente detti) alla sovrapposizione di regioni

più terminali (denominati in questo caso bidirezionali.

15.2.1 funzione dei lncRNA

Al contrario dei miRNA, non sembra esservi un meccanismo molecolare comune di

azione dei lncRNA, che pertanto rappresentano un gruppo molto eterogeneo di

trascritti la cui ulteriore analisi è necessaria ai fini di una loro migliore classificazione.

Tuttavia numerose evidenze puntano a un loro ruolo fondamentale nel controllo

dell’espressione genica.

15.2.1.1 regolazione della struttura cromatinica

Uno dei primi meccanismi associati all’azione dei lncRNA è la capacità di modificare la

conformazione cromatinica e di operare, di conseguenza, delle modificazioni

epigenetiche. Questo può avvenire mediante il reclutamento da parte dei lncRNA di

complessi proteici deputati al rimodellamento della struttura cromatinica. Un esempio

Xist,

può essere fatto prendendo in considerazione uno dei primi lncRNA identificati,

implicato nella regolazione del fenomeno dell’inattivazione del cromosoma X,

attraverso il quale uno dei due cromosomi X nelle femmine di mammifero viene ad

essere , in modo casuale, inattivato in seguito a processi di condensazione cromatinica

Xist

e conseguentemente portando a repressione trascrizionale. Si ritiene che regoli

almeno in parte questo processo tramite il reclutamento del complesso PRC2. Un altro

importante processo biologico a cui gli lncRNA possono prendere parte è l’imprinting

genomico attraverso il quale solo uno dei due alleli in determinati loci autosomici

risulta essere espresso, mentre l’altro viene inattivato.

15.2.1.2 regolazione trascrizionale

lncRNA possono regolare l’espressione genica direttamente in fase trascrizionale. Nelle

regioni geniche contenenti elementi di controllo della trascrizione come promotori ed

enhanacer possono essere trascritti lncRNA. Questa trascrizione può avere, a causa di

un ingombro sterico, un effetto inibitorio sull’azione della sequenza regolatoria

corrispondente (fenomeno dell’interferenza trascrizionale). L’interferenza

trascrizionale può verificarsi spesso nel caso della trascrizione di lncRNA bidirezionali

che esercita un effetto competitivo nei confronti della trascrizione in senso opposto di

un gene codificante per proteina adiacente. lncRNA trascritti da promotori o enhancer

possono esercitare un controllo della trascrizione dell’espressione genica anche con

modalità più complesse. Per esempio danni al DNA inducono la trascrizione di lncRNA

a livello della regione della ciclina D1. Questi lncRNa dirottano su quel promotore dell