PCR e MiRNA

PCR; RT-PCR

Il metodo della PCR è un sistema di determinazione molecolare inventato negli USA negli anni '70 che prevede l'utilizzo di un enzima Taq Polimerasi per amplificare una sequenza target utilizzando dei primer a DNA di innesco (Figura 4).

La PCR prevede la presenza di una sequenza di DNA target che funge da filamento di stampo per la duplicazione. Nella miscela di reazione, l'enzima TAQ Polimerasi utilizza un primer di innesco a DNA (primer Farward e primer Reverse), complementare al DNA target, per aggiungervi nucleotidi, producendo una copia esatta. Mediante questa reazione la sequenza target viene amplificata e il ciclo viene ripetuto per aumentarne la concentrazione.

Mediante la tecnica della PCR è possibile eseguire due tipologie di determinazione:

• Qualitativa: il risultato della reazione di PCR viene caricato su un gel elettroforetico e, data la grande quantità della sequenza target, si osserverà una banda corrispondente alla lunghezza della sequenza amplificata, indicando la presenza/assenza della sequenza Target.

Quantitativa: nelle stesse condizioni di reazione vengono amplificati dei campioni a concentrazione nota di sequenza Target, i quali fungeranno da punti di calibrazione per la costruzione di una retta di taratura che servirà per la determinazione della concentrazione della sequenza Target incognita.

La tecnica della PCR prevede la duplicazione del DNA in quanto la TaQ polimerasi non è capace di amplificare sequenze di RNA.

Per lo studio dell’espressione genica, viene utilizzata una variante della tecnica di PCR denominata RT-PCR (RetroTrascriptase- PCR), dove una Trascrittasi inversa produce un filamento di DNA a partire da una sequenza di RNA: in questo modo il filamento di RNA viene convertito in uno a DNA e, quindi, la reazione di PCR può avvenire con le modalità descritte precedentemente.

Le tecniche qui descritte prevedono l’impiego di un termociclatore, ossia un sistema capace di modificare la temperatura della reazione e mantenerla stabile per un determinato periodo di tempo dipendente dalla metodica utilizzata.

Nel dettaglio:

1. Fase di Retrotrascrizione: la procedura prevede l'utilizzo di un primer per RT, il quale presenta una forma di loop in cui alcuni nucleotidi mostrano una complementarietà. Una porzione del primer è complementare a sua volta con il miRNA target nella posizione 3'. La funzione del primer con forma di loop è anche quella di proteggere l'estremità 3' del miRNA maturo che, altrimenti, verrebbe degradato nella fase di RT. Infine, il primer presenta anche una sequenza di innesco per la reazione di RT.

   In seguito al riconoscimento del primer con il miRNA target, si verifica la produzione di un filamento di DNA complementare (cDNA) al miRNA Target (Figura 6).

Figura 6: Reazione di Retrotrascrizione (RT). Il filamento rosso corrisponde al miRNA target, il filamento blu corrisponde al Primer per RT, il filamento verde corrisponde alla sequenza di innesco per la RT.

2. Fase di Real-Time PCR: successivamente alla produzione del cDNA ottenuto dal miRNA target si procede con la fase di Real-Time PCR dove un primer d'innesco, complementare al cDNA specifico del miRNA target, promuove la duplicazione della sequenza. Al momento della duplicazione della sequenza avviene il riconoscimento del target ad opera di una sonda: essa si lega in siti