Miglioramento genetico

PCR.Costruendo una mappa genetica

Ci consente di individuare vari marcatori molecolari, ci possono essere dei marcatori che marcano vicino al nostro gene che stiamo cercando (esempio un gene per la resistenza). Questo marcatore è identificato da una coppia di primer, fiancheggiano il marcatore e sono molto lunghi. La probabilità di trovare le stesse sequenze a destra e a sinistra di questo marcatore è impossibile, non possiamo trovarle uguali. Abbiamo quindi una PCR molto selettiva. Primer lunghi e alte temperature di annealing -> selettività.

Marcatore molecolare -> Quelli che mappano vicino al nostro gene sono usati per selezionare gli alleli che vogliamo scegliere, nel nostro caso quelli che riguardano la resistenza, è molto comodo, semino 3000 individui, appena il seme germina, campiono le foglie, estraggo dna, faccio la PCR. Nel giro di pochi giorni valutiamo tutta la nostra popolazione e sappiamo già quali piante scegliere che sono resistenti.

Resistenza

Come vediamo sopra in figura è dominante. Il donatore è una linea omozigote dominante. Il ricorrente a cui vogliamo trasferire è omozigote recessivo.

Il donatore è omozigote per un allele chiamato A2 che è diverso dal prodotto PCR che abbiamo ottenuto facendo la PCR nel ricorrente dove abbiamo A1. A1 e A2 sono alleli diversi. Abbiamo quindi bande in posizione diverse. Nel donatore quella banda è concatenata con l'allele per la resistenza, nel ricorrente è concatenata alla suscettibilità. Obiettivo: trasferire allele R per la resistenza dal donatore al ricorrente.

L'allele R è associato all'allele A2 del marcatore molecolare, essendo la linea omozigote, quando c'è R c'è sempre A2. Quando c'è r c'è sempre A1, e vale lo stesso discorso di prima. Il ricorrente si incrocia col donatore. Il ricorrente produce tutti gameti A1 r e il donatore produce tutti gameti A2, R.

conl'incrocio otteniamo la F1. Nella F1 otteniamo il diibrido mendeliano come vediamo nella seconda riga Rr A2A1. In F1 abbiamo recuperato il 50% di tutti gli altri alleli del genoma del ricorrente e il 50% del donatore. Noi vogliamo ricostruire la linea omozigote ricorrente tranne che al posto di rvogliamo R. La F1 la rincrociamo su ricorrente. Otteniamo la BC1. L'allele R è associato con A2 (banda gialla). L'omozigote ricorrente è associato con A1 (banda nera). Dalla mappa genetica già disponibile sopra noi sappiamo che l'allele A si trova a 2u (2 unità di ricombinazione quando abbiamo un doppio eterozigote, il 2% dei gameti è ricombinante e il 98% è di tipo parentale) dal nostro gene per la resistenza R. F1 abbiamo Rr A2A1. I geni sono strettamente associati. La F1 la rincrociamo sulla ricorrente: i gameti parentali (98%) sono quelli che mantengono le combinazioni parentalitra marcatore e gene per la resistenza, sono.

prodotti quando non c'è stata ricombinazione tra allele marcatore e allele resistenza. Saranno le combinazioni: A1r (49%) e A2R (49%) ovvero i gameti parentali.

Però abbiamo comunque un 2% di ricombinazione. I ricombinanti sono di due tipi ovvero A1R (1%) e A2r (1%)

La generazione BC1 sarà costituita da:

• quando A1r si è unito con A1r quando otteniamo la PCR vediamo solo la banda nera. A1r A1r
• quando A2R si è unito con A1r otteniamo sia banda nera che banda gialla. A1r A2R
• quando A1R si è unito con A1r otteniamo solo la banda nera. A1R A1r
• quando A2r si è unito con A1r otteniamo banda nera e gialla. A1r A2r

Sappiamo che è la banda gialla quella che ci interessa perché è quella associata con l'allele della resistenza. Noi facendo il reincrocio andiamo a selezionare tutti gli individui BC1 che hanno la banda gialla. Siccome i geni sono associati la maggior parte degli individui della BC1 che ha la banda gialla,

è rappresentata da quelli che hanno l'associazione con R che hanno mantenuto la combinazione parentale A2R (49%, ultima riga dello schema). In una piccola parte, noi selezioniamo una banda gialla che ha perso l'associazione con R ma l'ha con r (1%, ultima riga dello schema). Marcatore singolo: Con le mappe genetiche noi abbiamo identifichiamo UN marcatore molecolare vicino al gene della resistenza che ci interessa. Noi seguiamo quindi il marcatore molecolare visto che un suo allele è associato appunto all'allele per la resistenza che ci interessa. Ad ogni generazione di incrocio noi seguiamo il marcatore molecolare come se ci rappresentasse il nostro allele preferito. Noi invece che fare l'inoculo ogni volta, aspettare che le piante siano recettive, controllare le condizioni in serra e aspettare che il patogeno agisce, noi usiamo il marcatore molecolare. Si fa l'estrazione molecolare subito e identifichiamo subito gli individui da.

rincrociare.

PROBLEMA

Se avessimo individuato il gene e avessimo la sua sequenza e trovato una coppia di primer in grado di metterci in evidenza l'allele che dà la resistenza avremmo risolto tutti i nostri problemi. Queste però NON È POSSIBILE. Cosa accade: molto spesso il gene non viene identificato ma abbiamo trovato il nostro marcatore che mappa VICINO al nostro gene. Il problema è che appunto c'è una distanza di ma tra il nostro marcatore e il nostro gene.

Quando selezioniamo per il nostro marcatore, una quota più o meno piccola (dipende dalla distanza di esso dal gene) di combinazioni in cui il marcatore ha perso l'associazione che il marcatore ha con l'allele favorevole. Questo però alla fine del programma di reincrocio viene superato perché alla fine facciamo uno screening generale.

Marcatori fiancheggianti:

La soluzione a questi problemi sono i marcatori fiancheggianti. Una volta trovati i marcatori fiancheggianti

noi possiamo ricostruire tutta la sequenza di dna compresa tra un marcatore e un altro e in questa zona da qualche parte c'è il nostro gene. Una volta clonato il gene ci costruiamo sopra il marcatore e abbiamo finito. Stesso discorso di prima solo che usiamo due marcatori A e B che fiancheggiano il gene e sono nuovamente polimorfici altrimenti non servirebbero a nulla (dobbiamo avere per A due bande in posizione diversa perché dobbiamo riconoscere da chi viene quel pezzo di dna). Otteniamo la F1: un gamete del donatore A2RB2 si unisce con un gamete della linea A1rB1 e otteniamo il triibrido. La F1 viene incrociata sul ricorrente. Qui abbiamo 2 marcatori e un gene ed è come se fossero 3 geni del test a 3 punti: la distanza tra marcatore A e B è più precisa se punti. [consideriamo la somma di distanze parziali perché se tra A e B c'è un terzo gene in mezzo noi riusciamo a vedere i cosiddetti crossover doppi] Quanti gameti produce il

nostro triibrido? 2 alla n ovvero 2 alla 3= 8. Di questi 8gameti (che si accoppiano sempre a 2 a 2), 2 sono parentali e 6 sonoricombinanti riuniti a 2 a 2 e sono i crossover doppi. Abbiamo i gameticrossover semplici tra il primo e il secondo gene, i gameti crossover semplicitra secondo e terzo gene e i gameti crossover doppi.

Ora concentriamoci invece su quello che accade durante l'incrocio tra F1 (congli 8 tipi di gameti prodotti dal triibrido) e ricorrente: come vediamo nella primatabella. Avendo due marcatori dobbiamo fare due PCR una per A e una per Bcome vediamo invece sotto.

Qui abbiamo che A1rB1 x A1rB1 abbiamo ottenutoA1A1rrB1B1. Omozigote per A1 e omozigote per B1.Parlando di bande abbiamo quindi la banda riferita ad A1che è nera e la banda riferita a B1 che è blu. In mezzo aqueste due bande c'è l'allele r che non vogliamo

Qui invece abbiamo A2RB2 x A1rB1 che dà origine aA2A1 Rr B2B1. Abbiamo eterozigoti per entrambi imarcatori molecolari.

Sappiamo che A2B2 si portano dietro R e A1B1 si portano dietro r. Facciamo la PCR. Per il marcatore A abbiamo sia A1 che A2 e quindi compaiono tutte e due le bande nere, per il marcatore B stessa cosa. Quando ci compare sia A2 che B2 significa che a queste piante è stato trasmesso R alle piante. Ogni volta che trovo sia A2 che B2 negli individuo da reincrocio, io li vado a selezionare. Problema. Abbiamo A2 e B2 anche nel crossing over doppio. Però al posto di R abbiamo r. Il vantaggio di usare i marcatori fiancheggianti è che la frequenza con cui compaiono i crossover doppi è lo 0,0006% perché è la probabilità di avere contemporaneamente un crossing over tra il primo e il secondo e il secondo e il terzo. In più, dei due gameti crossover doppi noi ne andiamo a scegliere uno solo, quindi è anche diviso 2. Quando i 3 geni coprono una distanza abbastanza ampia avviene il crossing over doppio: un crossing over tra i cromatidi A e B e uno tra i cromatidi a e b.tra i cromatidi b e c.Otteniamo due parentali e due crossover doppi. Il crossing over inoltre riguardavari cromatidi come vediamo nella seconda colonna della figura: può riguardare nel primo caso il secondo cromatidio e il terzo, oppure il primo e il terzo cromatidio, oppure il secondo e il quarto oppure il primo e il quarto.Abbiamo 4 possibilità. Notiamo che avvengono due crossing over: uno lo possiamo fissare ad esempio tra il secondo e il terzo come vediamo sotto nella figura (lo fissiamo perché le combinazioni finale non ci cambiano facendo così) e l'altro invece può variare.Per il secondo crossing over abbiamo 4 possibilità (hanno poi anche la stessa probabilità di verificarsi) in base ai cromatidi che vengono coinvolti ovviamente che sono:Con crossover doppi si intende quei gameti che portano un cromosoma che deriva da un cromatidio che ha subito una ricombinazione tra a e b e contemporaneamente una ricombinazione tra b e c.Gli eventi

più frequenti sono gli eventi senza crossing over, più rari sono isingoli crossing over ancora più rari invece sono i crossing over doppi. Nella figura ancora sopra notiamo poi che i crossover doppi sono 4 su 16 ovvero ¼dei gameti prodotti da un crossing over doppio è crossover doppio ed è per questo che sono poco frequenti.

Doppio aploide

Nel miglioramento genetico delle autogame l’obiettivo è quello di raggiungel’omozigosi. Come possiamo fare per raggiunger il 100% dell’omozigosi? Pure arrivando in F5, F6 c’è sempre un minimo residuo di eterozigosi. Per ottenerla subito al 100% si utilizzano gli aploidi raddoppiati.

Consideriamo il ciclo ontogenetico: abbiamo la fecondazione, si forma lo zigote, si sviluppa il seme, da esso si forma lo sporofito, abbiamo le nostre piante di grano che crescono e poi spigano. Vanno in meiosi: l