Micropropagazione - Appunti

Introduzione alla coltura in vitro e micropropagazione

Vediamo un lucido che abbiamo già visto: riassume tutte le possibilità che si hanno nella coltura in vitro, nell'introduzione, moltiplicazione in vitro, organogenesi ed embriogenesi somatica e vengono indicati come termini principali di micropropagazione. In realtà, col termine di micropropagazione si intende una di queste linee perché la base fondamentale della micropropagazione è quella di riprodurre il materiale clonalmente, come nella propagazione per talea e per innesto, mantenendo la rispondenza genetica.

Guardando il lucido, consideriamo le parti che passano attraverso la preparazione di una porzione di tessuto, che può essere di foglia, di fusto di una pianta. Questo tipo di rigenerazione, soprattutto la morfogenesi indiretta, passa attraverso una fase di produzione di callo, quando si va in una fase di cellule indifferenziate e dopo si induce la formazione di nuove piantine attraverso organogenesi ed embriogenesi somatica. C'è un rischio di alterazioni genetiche perché la fase di cellule indifferenziate è una fase di non sicura stabilità genetica, per cui c'è sempre il rischio di questa alterazione genetica che viene indicata nella coltura in vitro come variabilità somaclonale, per cui il materiale che si ha in fondo non dà la certezza di rispondenza genetica. Infatti, per questa fase viene indicato alto rischio di variabilità genetica; la fascia intermedia è quella dell'induzione diretta di germogli o embrioni somatici dall'espianto e qui la fase di callo o è assente o comunque molto limitata e questo abbassa il rischio di variabilità genetica ma non lo annulla infatti è indicato rischio medio di variabilità genetica.

Micropropagazione e stabilità genetica

L'unica via effettivamente sicura per la propagazione clonale, che dà entro certi limiti una certa garanzia di rispondenza genetica della piantina alla fine ottenuta dalla micropropagazione rispetto alla pianta madre di partenza da cui si è fatto l'espianto, è la seconda che parte da una gemma di una pianta in vivo, può essere una gemma o un segmento nodale contenente una gemma da una pianta che può venire da una pianta in vivo, in campo e si avvia un ciclo di micropropagazione e porterà ad avviare un ciclo che si può mantenere per tempi molto lunghi durante il quale si continuerà a produrre queste piantine in vitro, radicarle e quindi portando di nuovo in vivo ottenere una pianta che si sviluppa, questo sarà l'argomento del corso.

Fasi della micropropagazione

Lo vediamo in modo più dettagliato: sono riassunte le diverse fasi della micropropagazione che consistono in una prima fase che viene indicata con A e B che è quella di scelta del materiale e introduzione in vitro. La vera fase 1 è considerata la fase di introduzione dell'espianto in vitro, quindi la fase delle piante madri, cioè partire da delle piante madri che sono mantenute in certe condizioni che hanno una certa rispondenza genetica è un aspetto fondamentale perché poi condiziona anche tutto il risultato finale. Se non si ha la certezza delle caratteristiche genetiche e anche parte sanitarie, perché se si va a prendere del materiale di partenza da una pianta virosata è chiaro che andremo a produrre delle piante virosate.

Il problema della virosi lo vedremo, l'unico sistema molto importante che permette di avere un risanamento da virosi è la coltura di meristema e vedremo che una parte del meristema che si chiama duomo meristematico è quella zona che anche in una pianta virosata è con alta probabilità esente da virosi. Lo vedremo comunque nella seconda parte del corso, in tutto il resto ti porti il virus. Tornando al nostro discorso, anche la scelta della pianta madre è importante e viene indicata come fase zero ed è uno dei fattori importanti del successo di tutto il sistema.

Fase 1: introduzione in vitro. Andiamo a vedere l'importanza della scelta dell'espianto e di come si tratta questo espianto per poter evitare che si abbia contaminazione. Tutto quello che avviene in vitro deve essere in condizioni asettiche e mantenerle fino alla fase di acclimatazione. Poi vedremo la fase 2 di proliferazione in cui ciclicamente, attraverso le subcolture, questo materiale viene mantenuto in moltiplicazione andando a aumentare sempre più il materiale prodotto da quel famoso espianto di partenza attraverso questi cicli di moltiplicazione.

Poi c'è una fase che può esserci o no anche se attualmente c'è quasi sempre, è una fase intermedia perché è una fase di allungamento che sta tra la proliferazione e la radicazione. Prima di andare alla fase di radicazione c'è quasi sempre questa fase intermedia che può essere più o meno breve di allungamento dei germogli. Poi c'è la fase 3 di radicazione in cui i germogli vengono passati in un substrato diverso per ottenere la produzione di radici e poi c'è la fase 4 che è quella di acclimatazione durante la quale il materiale viene gradualmente riadattato alle condizioni che troverà al di fuori del vitro, perché in vitro è una pianta con nulla o scarsa capacità fotosintetizzante, umidità alla saturazione, condizioni di eterotrofia e poi anche un problema di apparato radicale non particolarmente efficiente perché si forma all'interno di un substrato particolare che è quello agarizzato.

Questa fase di acclimatazione viene fatta nei laboratori commerciali da qui direttamente all'interno delle serre sotto tunnel, può essere fatta anche in appositi contenitori, e poi le piante possono andare in campo al destino a cui sono state preparate. Se sono portainnesti andranno nel vivaio in una zona apposita dove poi saranno innestate, oppure in contenitore per essere innestate. Se sono varietà, andranno in vivaio o in contenitore per raggiungere una dimensione tale per essere immesse sul mercato, in vera sintesi è la micropropagazione.

Laboratori di micropropagazione in Italia e in Europa

Vediamo quale è la consistenza dei laboratori di micropropagazione in Italia e in Europa. Sono stati fatti censimenti abbastanza dettagliati fino al 1996. C'era un progetto che andava a fare regolarmente questi censimenti, questa cosa non è più stata fatta per cui dal 96 a oggi le informazioni date sono quelle che il docente conosce per indagini fatte. Nel lucido il peso è diviso per settore di ricerca e settore commerciale. Chiaramente la media del settore commerciale è molto più facile da calcolare, i settori di ricerca sono un dato molto vago perché qualsiasi istituto universitario, del CNR o del ministero può avere un piccolo laboratorio dove si fa anche coltura in vitro che può essere o non essere censito.

Sono molti di più i laboratori di ricerca rispetto ai laboratori commerciali dove cambia la filosofia di approccio alla micropropagazione. Il settore commerciale ha come prima regola quella di ottenere un vantaggio economico, cosa che non ha il settore di ricerca per cui seguirà delle regole abbastanza diverse. Faremo sempre riferimento al settore commerciale, le informazioni di base servono per qualsiasi applicazione della micropropagazione. Andando a vedere i numeri del settore commerciale si scopre che in Italia siamo su 28 laboratori commerciali.

Non è la realtà più importante, ma è una delle più importanti perché almeno al 96 c'erano più laboratori in Olanda, perché c'è un business molto elevato con il settore floricolo, ornamentale con un margine maggiore di guadagno. Anche in Germania c'è una consistenza molto elevata poi subito dopo troviamo l'Italia anche se sono prevalentemente laboratori medio piccoli però ci sono 3-4 laboratori di dimensioni più grandi. Perché si sono affermati in questi paesi? In Olanda è come se si fossero fatti accordi che sono venuti in maniera naturale di piante ornamentali e da fiore e limitatamente fa il resto, quindi piante da frutto.

L'Italia all'opposto si è presa il settore di piante da frutto, ma fa anche una certa produzione di ornamentali. In Germania si fanno un po' tutte e due, si fanno anche un po' di forestali. Le altre, ad esempio il Belgio considerando che è piccolo, è una realtà piuttosto importante specie da fiore e ornamentale. Tra l'altro, il Belgio è il paese in cui la micropropagazione ha avuto i più grossi avanzamenti di ricerca di base perché c'è stata tutta una scuola che ha lavorato molto per migliorare le tecniche di micropropagazione. Le altre realtà sono tutte più limitate anche se ci sono alcuni casi di laboratori grossi per esempio in Francia c'è un laboratorio che produce piante forestali mediante la produzione di linee embriogeniche e da lì produzione di piante che vengono commercializzate, sistema che viene molto diffuso in Canada dove c'è una industria grossa che produce piante forestali, conifere che vengono utilizzate per la produzione di legno mediante la tecnica dell'embriogenesi somatica.

Distribuzione geografica dei laboratori italiani

Dove sono questi laboratori italiani? Sono indicati nome, cognome, indirizzo dei vari laboratori. C'è una concentrazione notevolissima non lontana da qui, nel cesenate ed è facilmente spiegabile se considerate che nella zona di Cesena ci sono grossi vivai per la produzione di piante da frutto e quindi è naturale che ci sia stata una grossa diffusione. Solo su Cesena ci sono 5 laboratori di micropropagazione, 4/5 dei laboratori di quelli grossi sono tutti nella zona di Cesena, 2 si chiamano con lo stesso nome: azienda Battistini, 2 grossi laboratori inseriti all'interno di un vivaio tradizionale come ormai tutto.

C'è stato un periodo in cui in Italia i laboratori sono cresciuti molto, arrivando a numeri più alti di quelli attuali, poi intorno a un certo periodo, intorno agli anni 90, 95-96 sono diminuiti per poi ricominciare a salire. Perché questo? Principalmente per 2 motivi: primo perché c'è stato un momento 20 anni fa quando si sono cominciati ad aprire laboratori di micropropagazione in cui si pensava che la micropropagazione potesse essere il futuro unico della propagazione delle piante nel senso che si potessero risolvere tutti i problemi che ci sono con alcune specie da frutto che sono difficili da produrre con talea o devono essere innestati e ci si è resi conto che non è così semplice e le problematiche che si trovano ad avere con le specie arboree si ritrovano anche in vitro.

In vitro alcune cose si possono migliorare però non è che una specie che non viene bene, ad esempio, propagazione con talea in vitro viene bene, non è più così... i problemi te li mantieni quindi c'è stata una fase di assestamento. Secondo motivo, perché alcuni laboratori erano aperti solo come laboratorio senza avere l'appoggio su un vivaio tradizionale, il che voleva dire che la fase di acclimatazione doveva farla di appoggio su altri vivai. Mentre la maggior parte oggi sono laboratori calati all'interno di un vivaio tradizionale per cui tutto il ciclo viene completato all'interno della stessa azienda, il che permette di ammortizzare ancora di più i costi e poi di superare anche periodi di crisi.

Poi i laboratori li troviamo sul centro dell'Italia per esempio in Toscana ci sono 3 laboratori, di questi uno è molto grande, e poi le altre sono tutte realtà più piccole, su Bari c'è un laboratorio abbastanza consistente. Di questi 28 laboratori, solo 19 risposero al censimento, il risultato generale dava una indicazione della dimensione di questi laboratori. Una indicazione di quanto è grande un laboratorio di micropropagazione lo dà il numero di cappe sterili, perché il numero delle cappe a flusso laminare vuol dire gli operatori che lavorano e il materiale che viene moltiplicato periodicamente, nella fascia più piccola da 1 a 5 cappe a flusso laminare 10 dei 19 laboratori, quindi piccole realtà.

Se si va a laboratori grossi, almeno 15 cappe a flusso laminare in su, veniva fuori che dei 19 laboratori solo 3 avevano questa realtà; lo stesso discorso superficie dei bancali perché sono sempre adattati alla quantità di materiale che viene lavorato, la maggior parte dei laboratori stanno sotto gli 80 mq, via via che si cresce diminuiscono, manca un po' la fascia intermedia, alcuni molto grandi e poi tutta la fascia medio piccola; addetti di laboratorio quindi personale fisso, dato poco indicativo perché questi laboratori hanno personale a tempo determinato e tipicamente sono solo donne, richiede una certa attenzione e meticolosità e poi perché è più facile trovare donne per lavorare, da 1 a 5 per tempi fissi quindi pochissimi; solo 6 erano laboratori che hanno solo il laboratorio e poi si appoggiano per l'acclimatazione ad altre aziende.

Produzione di micropropagazione in Italia

Cosa si produce in Italia? Vediamo la tabella dove viene divisa la produzione per categoria, si vede che la produzione è intorno ai 19 milioni di piante circa, di questi fruttiferi cioè portainnesti più varietà è il 65%, quindi 2/3 della produzione italiana, poi subito dopo ed insieme vanno a fare quasi il 90% delle produzione troviamo i fiori recisi, prevalentemente gipsofila, gerbera e ranuncolo, e rappresenta il 28%, il resto sono tutte produzioni molto più contenute, ad esempio orchidee, ornamentali da giardino (betulla, oleandro) 7%, poi produzione ornamentale da appartamento bassissima 0,4% principalmente di spatifillo e ficus che vengono particolarmente bene, e poi qualcosa di orticole, carciofo soltanto.

Se andiamo a vedere all'interno dei fruttiferi cosa viene prodotto vediamo che c'è stato un incremento dal '92 al 2000 sull'ordine delle 3.000.000 di piante prodotte, di queste 12.000.000 di piante la stragrande maggioranza sono portainnesti (11.000.000 di piante) pari al 90% di questa produzione e meno del 10% sono varietà, come mai? Perché quasi tutta la frutticoltura italiana è tutto materiale innestato perché con il portainnesto si interviene, ad esempio nel melo è tutto innestato con portainnesti che riducono il portamento vegetativo della pianta, nanizzanti o seminanizzanti, e tutto il melo è prodotto per innesto. Il portainnesto dà ad esempio delle specifiche resistenze nel pesco a nematodi oppure perché dà adattabilità a certe condizioni di terreno, motivo per cui gran parte della produzione italiana è fatta tramite innesto.

Le uniche eccezioni le troviamo nell'actinidia, prodotto per autoradicato cioè la pianta è monomembra e succede nell'olivo e in piccola parte nel pero perché viene principalmente innestato, quindi perché si produce in vitro dei portainnesti? Perché è chiaro che in queste specie che devono essere innestate non ha senso produrre una varietà in vitro se poi questa varietà deve essere poi presa la gemma e innestata, si prende direttamente la gemma dalla pianta e si fa l'innesto oppure si prende la marza e si fa l'innesto, non avrebbe senso produrre la varietà se poi questa varietà deve essere cresciuta per poi prendere la marza e la gemma e innestarla sul portainnesto, mentre ha molto senso produrre portainnesti perché si può ottenere una produzione molto elevata e svincolata di piante che poi verranno innestate.

Laddove si può lavorare con piante che sono portatrici delle proprie radici ecco che in quel caso ha senso produrre piante in vitro, motivazione per cui la maggior parte della produzione della micropropagazione e poi comunque necessita dei portainnesti, se poi andiamo a vedere dentro a questi portainnesti scopriamo che di questo 90%, il 70% è soltanto un portainnesto, cioè il GF 677 un portainnesto preferito dai frutticoltori per coltivare il pesco, questo GF 677 è un ibrido pesco-mandorlo, i motivi per cui si è affermato così tanto per cui questa produzione il 70% è solo questo e secondo motivo in vitro viene molto bene e a costi molto contenuti, se ne vendono grossi quantitativi dando un ottimo margine di guadagno.

Il ciliegio è l'unica specie dove c'è stato il maggior incremento di produzione in laboratori di micropropagazione, vi sono dei portainnesti abbastanza recenti che in vitro hanno dimostrato di venire molto bene e sono richiesti dal mercato.

Sviluppo della tecnica di micropropagazione

Vediamo le date fondamentali di sviluppo della tecnica di micropropagazione e di coltura in vitro, per rendersi conto che si parla di una tecnica abbastanza giovane perché si parte agli inizi del secolo con le prime esperienze che dimostravano possibilità di fare della riproduzione in vitro e poi per vedere come alcuni di questi passaggi fondamentali continuano ad essere ancora il cuore della micropropagazione. Fine 1800 inizi 1900 ci sono i primi lavori che dimostrano che è possibile prendere delle cellule vegetali, metterle in vitro e farle mantenere in vita, in questi primi lavori che vanno alla fine del 1920 ancora non si riesce realmente a fare moltiplicare le cellule perché mancavano le sostanze ormonali.

Si salta al 1940, Wite che cominciò ad aggiungere componenti che potessero migliorare questa capacità delle cellule di mantenersi in vitro, il primo che comincia a mettere sali inorganici, estratto di lievito, una fonte importante di vitamine e notare gli effetti della tiamina e poi sempre in questi anni Boteret dimostrò la possibilità di produrre del callo ancora in assenza di ormoni e aggiunse acido indolacetico; sempre in questi anni Overtek aggiunge latte di cocco passaggio fondamentale, funziona molto bene anche se non è economicamente conveniente ad esempio nelle orchidee; nel 1946 Vall dimostra che è possibile trasferire le piante dal vitro al vivo.

Nel 1960, Skugh è il primo che comincia ad utilizzare citochinine, usare queste sostanze per favorire la moltiplicazione delle cellule in vitro, ad esempio la chinetina; nel 1962 viene fuori il substrato più utilizzato nella storia della coltura in vitro MS come uso generale, nel 1964, Timan fa studi specifici.