Micropropagazione - Appunti

C, in condizioni di umidità per un tempo più o meno lungo a seconda delle specie, si parla cmq si

settimane, una pianta mantenuta in queste condizioni è una pianta che è al limite della

sopravvivenza e questa condizione limita fortemente l’attività replicativi del virus e di conseguenza

se la teoria detta all’inizio si conferma ancora di più, se il duomo meristematico è la zona che resta

libera dal virus, diminuendo l’attività replicativi del virus aumenta questa zona che è esente dal

virus quindi invece di essere 0.2 millimetri, ma potrà diventare anche 1-2-3 millimetri quindi

banalmente la termoterapia che era nata come un trattamento già di per se di risanamento delle

piante, con percentuali non elevatissime si riusciva ad ottenere un buon risanamento da virosi con

una tecnica di termoterapia e poi innesto delle gemme, accoppiandola al vitro è stata data questa

capacità di risanamento da virosi accoppiando i vantaggi delle 2 tecniche, per quando riguarda la

temperatura in generale se si prendono in considerazione un po’ tutte la specie vegetali si va da

valori che stanno tra i 32 a 40° per tempi che vanno a 4 a 30 settimane, nelle specie da frutto si

lavora tra 36 e 38° con trattamenti che vanno da qualche settimana fino oltre un mese e questo

permette di arrivare a prelievi che non sono più dell’ordine di un decimo di millimetro, ma anche di

un qualche millimetro; la tecnica tradizionale è nata con termoterapia alla pianta, prelievo di un

apice meristematico e innesto su un porta innesto virus esente per ottenere poi una pianta su cui si

andrà a fare il saggio per confermare il risanamento da virus, questa è la tecnica tradizionale che

non passa dal vitro; un esempio invece che si basa sul vitro: stesso discorso: trattamento

termoterapico, prelievo in questo caso max 3 millimetri e questo apice meristematico viene

coltivato in una coltura su cui si faranno i saggi, vediamo un esempio di termoterapia fatta su

materiale in vitro: la coltura in vitro viene trattata a 36-38° (si deve stare particolarmente attenti ai

tempi perché non è una pianta in contenitore, è molto meno resistente, quindi il tempo deve essere

molto ridotto e va individuato bene), poi prelievo dell’apice meristematico che è massimo 1

millimetro in genere, queste sono tecniche che sono applicate al laboratorio di veneto agricoltura

dove andremo a fare la visita, e poi coltura del materiale con la medesima tecnica; prelievo del

meristema abbiamo visto i caratteri generali, poi è chiaro che su alcune specie sono state messe a

punto tecniche leggermente diverse qui sono riportati 2 esempi uno più classico che è quello del

garofano e si lavora sterilizzando delle marzettine di garofano, poi si va sotto cappa a flusso

laminare, le si prendono di quelle dimensioni per poterle reggere, si va sotto lo stereoscopio e si

isola con una strumentazione idonea il meristema, duomo meristematico con il primo primordio

fogliare e poi viene messo in coltura su della carta bibula appoggiata sopra un substrato

probabilmente solido, l’importane è non metterla a contatto con il mezzo agarizzato, nell’altro che

può essere il meristema prelevato più o meno alla stesso modo come ad es. la fragola, il problema è

che la fragola ha molte foglioline che chiudono il meristema che è qui all’interno, una tecnica è

quella di scoprire, ma siccome il meristema è molto piccolo si rischia avvicinandosi di danneggiarlo

e una alternativa della fragola consiste nell’iniziare a tagliare sicuramente sotto la gemma in senso

trasversale e ognuno e ogni volta andare a vedere allo stereomicroscopio se si è arrivati in

prossimità della gemma, chiaramente andando avanti a un certo punto si arriverà a un taglio che è

un taglio dove si vede che subito sotto c’è la gemma attaccata (nel lucido c’è un errore la partenza è

dall’alto fino a che non si scopre la testa del meristema perché da sotto non lo si vedrebbe) quindi

arrivati a vedere la testa del meristema si fa un altro taglio di qualche decimo di millimetro sotto e si

ottiene una striscia dove è contenuta la gemma che poi a quel punto essendo visibile sarà più facile

togliere e mettere in coltura, questo per dire come poi la tecnica deve essere poi adattata alle

esigenze.

Un esempio fatta sulla patata per risanamento da virosi, abbiamo molti virus che attaccano la patata

virus x,y, mosaico etc, nella patata bisogna produrre degli ‘’occhi’’ che devono esenti da virosi,

quindi la prima cosa da vedere è se il nostro tubero è virosato quindi non si fa altro che fare un test

sierologici es. Elisa test, se è virosato si va a risanare facendo coltura mi meristema con ponte di

carta e substrato liquido, questo meristema poi sviluppa una piantina che viene suddivisa in nodi per

fare da ogni nodo un nuovo germofglietto, questo materiale è stato di nuovo sottoposto a test

sierologico, nel frattempo questo materiale viene mantenuto a 10-12° in attesa di conoscere il

risultato del test sierologico, nel momento in cui si sa che il materiale è risanato dal virus viene

mandato in moltiplicazione. Una tecnica che un po’ di tempo fa ha avuto un certo sviluppo a livello

di ricerca anche se non ha avuto applicazioni pratiche è quello di fare un risanamento mediante

termoterapia e coltura di meristema, ma mediante chemioterapia quindi trattamenti con delle

sostanze che limitano la capacità di diffusione del virus, utilizzare delle sostanze è quelle che hanno

avuto un maggiore risultato nell’applicazione nella coltura in vitro sono state 2: ribapirina detta

anche virazolo e bht, queste sostanze inibiscono la replicazione del virus, e attraverso un certo n. di

subculture si può riuscire a ottenere alla fine del materiale che siccome ogni volta si è rallentata

questa replicazione alla fine il materiale ne esce risanato, queste sostanze per essere efficaci devono

avere un indice chemioterapico molto alto, cioè il rapporto tra concentrazione massima utilizzata

nella pianta ospite e la concentrazione minima efficace per eradicare il virus, più alto è questo

rapporto e più è efficace la sostanza chemioterapia, circa una decina di anni fa si è cercato di

puntare molto su questa tecnica che è più semplice rispetto alla termoterapia o coltura di meristema

perché consiste semplicemente di applicare una sostanza in vitro, i risultati in alcuni casi sono stati

anche importanti ad es. risanamento nella patata dal virus x con la virazolo 10 milligrammi litro, 6-8

mesi quindi circa 7-8 subcolture, poi risultati anche interessanti ci sono stati nel tabacco, patata,

orchide, melo nel clorotic lift spot virus e nel caso del dht risultatio interessanti nel ciliegio, patata e

fragola; in realtà però poi i risultati non sono mai stati a livello tale da veramente far si che questa

tecnica si affermasse, poi l’idea di utilizzare questo tipo di sostanze in una coltura in vitro per

quanto poi non ci fosse il rischio che queste sostanze fossero passate in vivo è un qualcosa che non

è che piacesse molto come idea, tanto è vero che l’unione europea ha vietato l’uso di tali sostanze

sulle piante in campo, quindi questa tecnica si è arrestata.

Una tecnica da ricordare è il microinnesto che consiste nel prendere il meristema e innestarlo in

vitro su un piccolo porta innesto, la tecnica quindi si accoppia con la termoterapia, lo si fa perché in

alcuni casi in certe specie non parte, ad esempio nel citrus è una tecnica che è stata molto sviluppata

la termomicroinnesto, quindi sempre con condizioni di sterilità, lavorare allo stereoscopio, prendere

un apice meristematico con grandezza che può andare fino al millimetro, ci si deve essere preparata

un piccolo porta innesto di solito da seme e quando si è forfato un fusticino di almeno di qualche

cm di modo che si possa fare un taglio trasversale, il meristema viene appoggiato sopra questo porta

innesto che si troverà in un tubo, naturalmente così come viene fatto l’innesto tradizionale è

necessario che la zona del tessuto cambiale sia visibile e che il meristema venga appoggiato sulla

zona del cambio perché è lì che si ha la proliferazione delle cellule e l’attecchimento di questo

micro innesto come nell’innesto tradizionale, nel caso del citrus si fa un taglio trasversale di modo

che si apre l’epidermide del fusticino, si fa una piccola tasca ed è qui che viene appoggiato il

meristema e dà risultati migliori rispetto al taglio trasversale, si prelevano dei germoglietti di

qualche cm, si fa una sterilizzazione e poi si va a prendere le gemmettine e sotto cappa si prepara il

meristema che verrà poi innestato in vitro in questo modo anche questa è stata utilizzata in

risanamento da virosi: termoterapia più microinnesto che consiste termoterapia applicata al

materiale già in vitro, da un germoglio viene prelata una micromarzettina di dimensioni inferiori a

0.1 cm che viene innestata su un semenzale e viene innestato per ottenere il microinnesto che darà

con buone probabilità risanamento da virosi, il materiale successivamente come viene trattato? Si

può utilizzare il semenzale con substrato liquido all’interno di provette con supporto di carta per

reggere il semenzale oppure ad es. nel caso del porta innesto 677 viene messa della perlite

all’interno della provetta per poter reggere il porta innesto, dopo un paio di mesi se il micro innesto

è attecchito si fa il trapianto in vasetti normani di 10-12 cm con un substrato contenente torba, sabia

perlite e le piante vengono poi acclimatate.

In Veneto queste tecniche vengono applicate alla produzione di materiale certificato, si parlava in

partenza di centro di pre moltiplicazione dove viene creato il materiale di base, quindi relativamente

poche piante all’interno di serre che si chiamano screan house molto ben controllate, questo

materiale è testato con elevate caratteristiche genetico-sanitarie , poco materiale che serve per

moltiplicare o tenere una maggior qnt di materiale che costituisce il centro di moltiplicazione con

materiale derivato da questo materiale di base che serve per costituire le ceppaie di piante madri e i

campi di piante porta gemme per produrre poi da parte di vivaisti che fanno parte di questa

associazione il materiale che poi viene venduto come certificato, un discorso analogo viene fatto in

vitro e anche qui possiamo parlare di materiale di propagazione di categoria base quindi quello che

è in laboratorio il centro di premoltiplicazione, quindi un materiale ridotto, costantemente risanato,

sicuramente esente da visori, questo materiale di base può essere utilizzato per costituire