Microbiota umano e metagenomica

FISH: Introduzione di sonde nucleotidiche marcate

Questa tecnica è utile perché permette di individuare la presenza di un particolare tipo di organismo all'interno di una coltura. Le sonde possono essere genere specifiche (più generiche) o specie specifiche (molto specifiche). È possibile introdurre anche più sonde marcate con fluorofori diversi.

Metodi di conta indiretti:

1. Misurazione della biomassa sospesa attraverso la luce assorbita e dispersa utilizzando uno spettrofotometro o colorimetri
2. Misurazione di una componente della biomassa (proteine o acidi nucleici)
3. Coltivazione su agar con formazione di colonie
4. Metodo MPN (Most Probable Number) in provetta statistico

Misurazione della biomassa attraverso la luce assorbita:

Possiamo valutare la biomassa microbica attraverso la misurazione della torbidità della coltura. Se una coltura non è cresciuta, il terreno risulterà limpido.

La formula della media pesata unità, cioè per ml. Conta MPN: questo tipo di conta è una conta su provetta. Questa è più utile perché della conta su piastra perché quest'ultima è lenta, almeno 48 h, mentre una conta su provetta è molto più veloce.

Come si fa l'MPN? Vado a diluire il mio campione (faccio tante repliche, in triplicato anche in quadruplicato) e poi vado a valutare una caratteristica rivelatrice per valutare la frequenza dei risultati positivi. Posso ad esempio valutare la produzione di gas: alcuni microrganismi producono co2 e H. Di conseguenza metto all'interno delle provette una campanella di vetro rovesciata: se nella provetta non è cresciuto niente la campanella rimane sul fondo, se invece è cresciuto qualcosa la campana si alza a causa della produzione di co2 e H.

Ci possono essere anche altre caratteristiche rivelatrici, come ad esempio per i microrganismi che coagulano il latte:

se li metto a crescere sul latte formano il coagulo, si vede quindi una precipitazione sul fondo. Questo perché i batteri producono acido lattico, l'ambiente si acidifica e si forma il coagulo. Alla fine vado a fare una statistica: si determina un numero che vado a confrontare con le tabelle statistiche che mi dice il numero di organismi che probabilmente sono presenti in quella diluizione, non è una conta precisa.

Metodi microscopici: sono importanti. Quasi tutti i laboratori possiedono un microscopio ottico per vedere anche solo la morfologia delle cellule in questione. Ovviamente se voglio fare qualcosa di più specifico devo usare il microscopio elettronico, per vedere ad esempio i pili e le fimbrie.

Il microscopio ottico è semplice: sorgente di luce da sotto, poi abbiamo degli obiettivi diversi per diverse grandezze. Per vedere i microrganismi in microbiologia si usa il 100x ad immersione.

Il microscopio a fluorescenza è un microscopio ottico che ha

qualcosa in più perché, utilizzando dei fluorofori, posso determinare alcune caratteristiche, posso vedere il DAPI che abbiamo visto prima, ecc. Molte cellule sono autofluorescenti, emettono una colorazione loro ma la maggior parte di queste cellule autofluorescenti sono eucarioti e non procarioti.

Esistono diversi tipi di microscopi a fluorescenza perché hanno una sorgente di luce, non più da sotto, ma da dietro e può essere diversa: lampade a vapore di mercurio, lampade allo xeno, sorgenti a led. La luce passa attraverso diversi filtri, la lunghezza d'onda è mandata sul campione il quale riemette una certa luce che arriva al filtro di emissione e lo vede l'operatore.

Il microscopio elettronico si usa invece quando devo vedere strutture piccole: il microscopio elettronico a scansione consente di studiare la superficie dei microrganismi, mentre quello a trasmissione permette di fare sottili sezioni e quindi è possibile vedere.

All'interno dei microrganismi. I microscopi elettronici funzionano in alto vuoto: l'immagine è generata da un fascio di elettroni che lavora in altovuoto.

Nel microscopio ottico a trasmissione (TEM) il fascio di elettroni passa attraverso il microscopio e questo fascio viene catturato da una specie di strumento che va a trasformare gli elettroni in immagini e la riproduce su uno schermo.

Il microscopio elettronico a scansione (SEM), il preparato è preparato depositando sulla superficie delle cellule un metallo (oro) che deve essere molto conduttivo e il preparato viene messo in una camera in cui si crea anche in questo caso il vuoto di elettroni. Un fascio di elettroni diretto sul campione effettua la scansione. Gli elettroni dispersi dal metallo vengono raccolti ed utilizzati per produrre immagini sullo schermo.

Microscopio a forza atomica: Evidenzia strutture biologiche mediante immagini tridimensionali.

Il microscopio a forza atomica consiste di una microleva

(cantilever) alla cui estremità è montata una punta acuminata(tip), tipicamente composta di silicio o nitruro di silicio, che presenta un raggio di curvatura dell'ordine dei nanometri. La punta investigatrice viene collocata nelle strette vicinanze della superficie del campione di cui si vuole effettuare lascansione. La punta traccia rilievi ed avvallamenti in seguito all'interazione di forze repulsive deboli tra sonda-campione. Il microscopio a forza atomica evidenzia strutture biologiche mediante immagini tridimensionali e una cosa molto importante è che i campioni sono molto facili da preparare per l'osservazione tramite questo microscopio e inoltre possono essere osservati preparati vitali.

METODI CULTURE INDIPENDENT: queste sono metodiche molecolari e passano attraverso il sequenziamento del DNA. Questo è un metodo molto diverso da prima: con il metodo culture dipendent vado a studiare il microrganismo, cercare di isolarlo,

Determinare le caratteristiche mediante saggi fisiologici, mentre attraverso il metodo molecolare vado a fare analisi su DNA e RNA. In questo caso non ho il microorganismo a mia disposizione, di conseguenza ci sono dei pro e dei contro. In questo metodo ci interessano gli acidi nucleici, in particolare determiniamo la sequenza una porzione di un gene, un gene singolo o l'intero genoma di un microrganismo. Determinare tutto il DNA di un microrganismo è importante perché permette di capire tutte le potenzialità di questo organismo, so quali geni ha, ma dopo posso fare delle analisi di espressione: vado a vedere quali geni esprime in determinate condizioni. Quello che si è cercato di fare nel corso del tempo è di arrivare ad un metodo di sequenziamento ideale:

1. sequenziare direttamente una sola molecola di DNA o RNA originale senza bisogno dello step di amplificazione e della produzione di un filamento complementare (non dovrebbe essere cioè un sequencing-by-synthesis);
2. ...

produrre risultati senza errori;

rilevare direttamente modificazioni epigenetiche (come ad esempio la metilazione delle citosine);

funzionare in laboratori non specializzati ad opera anche di personale non qualificato. Il sistema ideale dovrebbe infine essere realmente accessibile, così da poter essere adottato in tutto il mondo, anche da strutture con risorse limitate.

Le principali tecniche di sequenziamento le possiamo classificare in "generazioni":

• Generazione 0: sequenziamento chimico, primo sequenziamento
• Generazione 1: dye-terminator (metodo sanger)
• Generazione 2: sequenziamento con pre-amplificazione (Pyrosequencing 454; Illumina-Solexa); rivelazione di un segnale elettrico (IonTorrent)
• Generazione 3: PcBioM MiniION (nanopore)

Cosa è cambiato dalla generazione 0 alla 3? Sono calati i costi, perché i primi sequenziamenti erano molto cari e soprattutto c'è stato un aumento della quantità di dati ottenibili.

per unità di tempo: molti dati in pochi giorni.

Le ultime metodiche sono chiamate next generation sequenzing (NGS) e sono metodiche innovative, caratterizzate da sequenziamento ad alto rendimento (high-throughput) e generano molti dati in poco tempo. Mentre le prime metodiche di sequenziamento erano lette manualmente, per questo motivo non era possibile utilizzarle per leggere migliaia di sequenze geniche. Quindi con l'avanzare della tecnologia sono state affiancate da server che analizzano i dati.

Nello specifico le NGS sono appartenenti alla generazione 2 e 3. Le ultime NGS sono molto complesse anche come tecnologia. Generazione 0

Il sequenziamento chimico consiste in moltiplicazioni chimiche del DNA e conseguente taglio in posizioni specifiche.

Procedimento:

1. Si dentatura il campione di DNA a doppia elica
2. Il filamento singolo a 5' è marcato con isotopo radioattivo (P32) che è molto pericoloso.
3. Il DNA viene suddiviso in 4 aliquote che vengono sottoposte a 4