Ecologia del microbiota umano

Ecologia del microbiota umano

Principi di ecologia

Ecologia = studio scientifico delle interazioni tra gli organismi e il loro ambiente → include le interazioni che gli organismi hanno tra loro e il loro ambiente abiotico.

Ecosistema = insieme degli organismi viventi e delle sostanze non viventi con le quali i primi stabiliscono uno scambio di materiali e di energia → unità funzionale fondamentale in ecologia.

Biota = complesso degli organismi viventi che occupano un determinato spazio.

Habitat = ambiente in cui vive una specie animale o vegetale → un ecosistema è formato da diversi habitat.

Nicchia ecologica = posizione occupata da una specie o da una popolazione all'interno di un habitat → inteso come ruolo e funzioni che gli individui svolgono in un ecosistema e non come spazio fisico = modo di vivere, ruolo e condizioni che permettono ad un organismo di esistere in quel particolare ambiente.

Ecologia microbica = studio del comportamento e delle attività dei microorganismi nei loro ambienti naturali → descrivere la presenza e le distribuzioni di microorganismi in vari ecosistemi.

Microbiologia ambientale = insieme dei processi microbici che si verificano in un ambiente → effetti su più ampia scala della presenza e delle attività microbiche.

Classificazione dei viventi

Classificazione dei 5 regni (Whittaker, 1978):

• Plantae → eucarioti pluricellulari
• Fungi → eucarioti unicellulari (lieviti) e pluricellulari (muffe e funghi)
• Animalia → eucarioti pluricellulari
• Protista → eucarioti unicellulari (alghe e protozoi)
• Monera → procarioti unicellulari (batteri, archeobatteri e cianobatteri)

Le singole cellule crescono per formare popolazioni cioè l'insieme di tutti gli individui della stessa specie che vivono in un ecosistema, le popolazioni metabolicamente correlate costituiscono raggruppamenti chiamati corporazioni (gilde). Set di corporazioni che conducono processi fisiologici complementari interagiscono per formare comunità microbiche, cioè l'insieme delle popolazioni che vivono nello stesso ecosistema.

Le varie comunità microbiche interagiscono con le comunità di macroorganismi e la distribuzione dei microorganismi nell'ecosistema naturale dipende dalle risorse (nutrienti) disponibili e dalle condizioni di crescita → temperatura, pH, disponibilità di acqua, luce e ossigeno di un habitat definiscono la nicchia per ciascun microorganismo.

Interazioni tra organismi viventi in un ecosistema

SIMBIOSI= forme di interazioni biologiche (tra diversi organismi viventi) e possono essere positive o negative:

• Neutralismo
• Commensalismo
• Sinergismo
• Mutualismo
• Competizione
• Antagonismo

Neutralismo = compresenza di diverse specie senza che vi sia per esse danno o beneficio.

Commensalismo = interazione non obbligatoria fra due esseri viventi in cui uno approfitta del nutrimento o degli scarti dell'altro senza procurare danno o beneficio.

Sinergismo = interazione non obbligatoria in cui entrambe le popolazioni traggono beneficio → entrambe le popolazioni sarebbero in grado di sopravvivere indipendentemente (proto-cooperazione).

Mutualismo = interrelazione obbligatoria tra due popolazioni che determina beneficio per entrambe.

Antagonismo = interazione tra specie nella quale una o ambedue le specie in relazione subiscono un danno. Le principali relazioni antagonistiche sono:

• Antibiosi = inibizione della crescita e della riproduzione di un microorganismo da parte di un altro.
• Parassitismo = interazione fra due specie, di natura trofica, in cui una (parassita) trae vantaggio a spese dell'altro (ospite) creandogli un danno biologico.
• Predazione = interazione in cui un organismo (predatore) usa come fonte di cibo un altro organismo, solitamente, di specie differente (preda).
• Competizione = interazione che si verifica quando due popolazioni stanno cercando la stessa risorsa di nutrienti o habitat → competizione per nutrienti o per siti di adesione.

Denominazione dei microorganismi

La nomenclatura binomiale fu ideata da Carlo Linneo ed è basata sul concetto di specie (unità tassonomica fondamentale) intesa come insieme degli individui che presentano un elevato numero di caratteristiche comuni e di somiglianze a livello anatomo-morfologico → due termini latini: epiteto generico (corsivo maiuscolo) + epiteto specifico (corsivo minuscolo).

I gruppi tassonomici:

• Dominio
• Regno
• Phylum
• Classe
• Ordine
• Famiglia
• Genere
• Specie
• Ceppo = insieme di tutte le cellule microbiche teoricamente originate da un'unica cellula progenitrice e quindi, idealmente, aventi un identico patrimonio genetico.

Il rapporto tra microrganismi e l’uomo

La microbiologia nasce come disciplina medica → agli inizi del '900 si iniziò a pensare che i microrganismi non fossero solo negativi. Solo pochi microrganismi sono patogeni → molti possono instaurare relazioni benefiche con l’ospite.

La composizione e le funzioni del microbiota sono così cruciali per la vita degli animali e delle piante ai quali sono associati che è stato proposto di considerare gli ospiti e il loro microbiota come una unità ecologica singola (olobionte).

Olobionte (o super-organismo) = ospite (animali e piante) + microbiota (insieme delle comunità di batteri, funghi e tutti gli altri microrganismi) → l’insieme dell’organismo ospite e di tutti i microrganismi commensali e simbiotici ad esso associati.

I microrganismi che abbiamo nel nostro organismo non sono prelevati dall’ambiente ma sono microrganismi che si sono evoluti con l’essere umano.

Filosimbiosi = evoluzione dell’olobionte → permette che ogni ospite sia perfettamente adatto al suo microbiota.

I microrganismi associati all’uomo

Microorganismi = batteri, archea, eucarioti (funghi e protisti) e virus → i microrganismi nel e sul corpo umano adulto medio comprendono l'1%-3% della massa corporea con i batteri che superano ampiamente gli altri tipi di microrganismi. Stime recenti indicano che il rapporto tra cellule batteriche e cellule umane è di circa 1.3 a 1.

Microbiota = è l'insieme di tutte le cellule microbiche che colonizzano uno specifico ecosistema.

Microbioma = è un intero habitat in cui risiedono i microrganismi, compreso il loro intero "teatro di attività" → microrganismi, i loro genomi, le molecole che producono, le loro interazioni e l'ambiente circostante (microbiota + teatro d’attività).

Divisioni batteriche

• Firmicutes → batteri lattici, lattobacilli
• Bacteroidetes
• Actinobateria
• Proteobacteria

Sebbene gli ecosistemi microbici associati all’uomo non comprendano solo i batteri, ma anche membri del regno Fungi (lieviti e muffe) e Protista (protozoi) e molti virus, la maggior parte è batteri → maggior parte delle conoscenze scientifiche riguardano i batteri.

La microbiologia classica e l’ecologia microbica

La microbiologia classica è quella dei microrganismi coltivabili → UFC/g. Negli anni '80, si è giunti alla consapevolezza che la maggior parte dei microrganismi osservabili al microscopio in un campione ambientale non poteva essere coltivata in laboratorio → in alcuni ecosistemi microbici, solo meno dell’1% del totale dei batteri può essere individuato attraverso conta in piastra delle colonie.

I batteri che non si riesce a coltivare (99%) si trovano con metodologie alternative:

• Prima generazione: rapidissima evoluzione delle metodologie per il sequenziamento degli acidi nucleici (metodo enzimatico Sanger).
• Nuova generazione (o sequenziamento ad alto rendimento): serie di tecniche di sequenziamento in grado di operare in modo più rapido ed economicamente vantaggioso rispetto al metodo sequenziamento enzimatico Sanger.
• Tecnologie NGS di terza generazione: permettono un sequenziamento molto rapido del DNA senza richiedere amplificazione tramite PCR (Solexa-Illumina più utilizzata per la microbiomica e la metagenomica microbica).

Genomica = campo interdisciplinare delle Scienze della Vita che studia la struttura, la funzione, l’evoluzione dell’intero genoma (l’insieme dei geni) di un organismo e consente di interpretarne le proprietà biologiche.

Associata alla genomica vi sono altre discipline “omiche”, che permettono l’analisi di tipo globale degli organismi, quali:

• Trascrittomica: l’insieme dei trascritti
• Proteomica: l’insieme delle proteine
• Metabolomica: l’insieme dei metaboliti

Si è poi sviluppato un approccio interdisciplinare, noto come biologia dei sistemi, per la descrizione della biologia di un organismo mediante modelli matematici che si avvalgono dei dati derivanti dalle tecnologie “omiche” e dalla loro analisi globale; le scienze “omiche” sono quindi alla base biologia dei sistemi, la quale, elaborando con metodi computazionali le informazioni relative ai singoli elementi, genera modelli del funzionamento di sistemi biologici complessi.

Metagenomica

Metagenomica = lo studio dei genomi collettivi dei microrganismi di un campione indipendentemente dalla loro coltivazione.

Due tipologie:

• Microbiomica/metatassonomia: permette l’identificazione dei microrganismi (tassonomia) → vado a sequenziare e analizzare un solo gene (16S rRNA).
• Metagenomica propriamente detta: permette di dire quali geni e in che abbondanza (tutti non solo il 16S).

Caratterizzazione del microbiota attraverso la 16S rRNA gene profiling

1. Raccolgo il microbiota ed estraggo il DNA metagenomico totale.

2. Amplifico via PCR il gene 16S rRNA e ottengo una miscela di filamenti tutti uguali.

Come faccio a distinguere i filamenti?

3. Tramite sequenziamento attraverso tecnologie di nuova generazione (Illumina).

4. Infine, tramite analisi bioinformatiche si va a ricercare nel database la sequenza corrispondente e riesco a dare il nome al microrganismo (genere e specie).

La microbiomica condotta attraverso 16S rRNA gene profiling prevede l’amplificazione e il sequenziamento di una sola parte del gene 16S rRNA, comprendendo solo una o alcune regioni variabili del gene → le V3 e V4 sono le maggiormente considerate.

La microbiomica può essere condotta su altre regioni geniche. Ad esempio, per lo studio dei membri del regno Fungi, si amplifica e sequenzia una frazione del gene 18S rRNA, oppure una delle regioni spaziatrici ITS1 e/o ITS2 (ITS = internal transcribed spacer).

Studio del microbioma attraverso whole metagenome shotgun sequencing (Shotgun metagenomics)

1. Raccolgo un campione (di solito fecale).

2. Estrazione del DNA metagenomico totale.

3. Frammetazione del DNA in frammenti di grandezze casuali → con un colpo (ecco perché shotgun).

4. Isolamento dei frammenti aventi una simile dimensione (read).

5. Sequenziamento delle read attraverso next generation high-throughput technologies.

6. Analisi con dei software e ricostruzione di pezzi di genoma.

Sequencing reads

Il dato primario (grezzo) generato dalle analisi di microbiomica e metagenomica è rappresentato dalle sequencing reads.

Read = risultato di sequenziamento di un frammento di DNA.

Pipeline = algoritmo che esegue diversi passaggi: la più conosciuta è la QUIMM. Nel caso della microbiomica (16S rRNA gene profiling) ogni read ha una sequenza nucleotidica specifica che può essere fatta corrispondere a un determinato gruppo tassonomico. Per attribuire un significato tassonomico, le read aventi similarità almeno del 97% sono raggruppate; le sequenze di ogni «pacchetto» di read ottenuto sono quindi confrontate con le sequenze annotate presenti in specifici database.

Per esempio, per le read corrispondenti al gene codificante il 16S rRNA si usano i database Greengenes o Silva. Al termine di questa operazione (svolta in modo automatico con opportuni software), otterrò la cosiddetta OTU table, cioè una tabella in cui ogni «pacchetto di read» avrà una designazione tassonomica e un dato di abbondanza espresso come numero di read che la costituisce → il pacchetto di read ora si chiama OTU, cioè Operational Taxonomic Unit.

Le OTU raggruppano microrganismi tassonomicamente appartenenti allo stesso genere e alcune volte a livelli superiori (classe, ordine); talvolta, invece, raggruppano anche batteri di una singola specie (dipende dai microrganismi e dal tipo di campione).

Quindi:

• 1. Ho preso le reads.
• 2. Le ho raggruppate (quelle simili al 97%) → OTU unità tassonomica operativa create per fini pratici; ogni OTU ha una sigla (nome).
• 3. Scelgo la capostipite/sequenza consensus (lo sceglie l’algoritmo).
• 4. La mando in banca dati.
• 5. E vedo a quale sequenza già presente in banca dati si avvicina di più alla mia.

Un’alternativa alle OTU sono le Amplicon Sequence Variants (ASV):

• 1. Ho le read.
• 2. Non le raggruppo.
• 3. Un algoritmo, denoising, corregge la sequenza di ogni singola read attraverso un modello statistico d’errore.
• 4. In questo modo ottengo sequenze ASV → identiche al 100%.
• Si riesce ad attribuire anche la specie (cosa che con le OTU non potevo fare).

Nel caso della metagenomica dopo sequenziamento shotgun, le read sono prima di tutto assemblate (assembling) per creare delle sequenze più lunghe → contigs. Ogni riga è una read. I contigs ottenuti sono quindi sottoposti ad annotazione funzionale (annotation) → viene ad essi attribuito un significato biologico. Questa operazione viene fatta cercando le Open Reading Frame (ORF) → regioni potenzialmente corrispondenti ad un gene, quindi, le sequenze degli ipotetici geni sono confrontate con quelle disponibili nelle banche date (per es. GenBank). Queste operazioni sono fatte in maniera automatica, con apposite pipeline bioinformatiche.

In modo simile alla tassonomia per una OTU, anche per i geni è possibile stabilire diversi livelli. Per esempio, si possono usare i livelli KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). Ogni gene, dunque, può essere classificato a diversi livelli in base alla sua funzione.

L’uso dei dati di microbiomica per la caratterizzazione della composizione tassonomica di un microbiota

La caratterizzazione tassonomica di un ecosistema microbico consiste nello studio della biodiversità, la quale è costituita da tre principali componenti:

• Richness = misura del numero di differenti unità tassonomiche (specie) in un habitat/campione
• Evenness = è una misura della distribuzione delle abbondanze delle unità tassonomiche (cioè misura quanto sono vicine in quantità le varie specie) → più le specie sono distribuite in modo uniforme, più questo valore sarà alto.
• Abbondanza relativa = è una misura del numero di ciascuna unità tassonomica rispetto al numero totale

Indici e modelli per la descrizione della biodiversità in un ecosistema microbico

Diversità alpha → diversità intra-campione

Diversità beta → diversità tra campioni (inter-campioni)

Diversità gamma → diversità totale in un ambiente

Diversità alfa

Viene descritta attraverso indici che considerano in modo differente richness ed evenness, e attraverso le curve di rarefazione. Esistono diversi indici:

• “Observed species” e si basano sulla richness tassonomica del campione
• “Chao1”: considerano sia richness sia la evenness del campione
• “Shannon” <<Simpson>>: prendono in considerazione la richness e il rapporto filogenetico tra le unità tassonomiche (PD = Phylogenetic Diversity)

Si usano tutti e tre gli indici e si prende in considerazione quello che dà un risultato migliore.

La rarefazione è una tecnica per valutare la ricchezza tassonomica dai risultati di diversi campionamenti di un ecosistema, basata sulla costruzione delle cosiddette curve di rarefazione → diagramma del numero di unità tassonomiche diverse in funzione del numero di individui. Queste curve, generalmente, crescono rapidamente all’inizio perché si trovano le specie più comuni, ma raggiungono rapidamente un plateau quando rimangono solo le specie più rare da campionare.

Per individui si intendono le sequenze ottenute (reads) → asse delle X

Numero di unità tassonomiche (OTU) → asse delle Y

Le curve di rarefazione permettono di capire se un’analisi di microbiomica è stata in grado di coprire adeguatamente la diversità tassonomica del campione → dipende dalla profondità di sequenziamento cioè dal numero totale di sequenze o read generate.

Diversità beta

Descrive la differenza o la similarità esistente nella composizione tassonomica di due ecosistemi microbici. È determinata usando algoritmi che si dividono in due categorie:

• Algoritmi non filogenetici: non tengono in considerazione la distanza filogenetica tra gruppi tassonomici → analisi delle componenti principali (PCA) o analisi delle coordinate principali (PCoA)
• Algoritmi filogenetici: includono nell’analisi anche la distanza filogenetica esistente tra i taxa presenti nei campioni (Salmonella è filogeneticamente più simile ad Escherichia piuttosto che Bacillus) → quello più usato si chiama UniFrac che può usare l’abbondanza relativa oppure no

Sono in grado di descrivere più o meno bene la diversità esistente tra i campioni che vengono rappresentate in grafici a 2 o 3 dimensioni → ogni componente corrisponde ad una coordinata del campione sul grafico. La beta diversità viene svolta dopo aver fatto l’alfa diversità.